外用8-甲氧補(bǔ)骨脂素誘導(dǎo)的黃褐斑動(dòng)物模型研究

蘇美麗，許亞瑩，張理平

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州350122）

外用8-甲氧補(bǔ)骨脂素誘導(dǎo)的黃褐斑動(dòng)物模型研究

蘇美麗，許亞瑩，張理平

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州350122）

目的采用綜合造模法創(chuàng)建小鼠皮膚黃褐斑動(dòng)物模型。方法30只KM雌性小鼠隨機(jī)分為空白組、造模1組、造模2組。除空白組外，造模1組和造模2組根據(jù)文獻(xiàn)均每日用波長(zhǎng)320 nm的中波紫外線（UVB）照射小鼠背部皮膚1次，照射時(shí)間30 s，并每日定時(shí)肌肉注射1%黃體酮注射液2 mL／kg體重，兩腿交替注射；同時(shí)每日將小鼠置于特制的束縛桶內(nèi)束縛30 min；造模2組同時(shí)局部外涂8-甲氧補(bǔ)骨脂素（8-MOP），每日1次。造模4周后，HE染色和免疫組化染色觀察皮膚黑色素細(xì)胞病理形態(tài)學(xué)。結(jié)果①HE染色結(jié)果：造模1組和造模2組小鼠皮膚黑色素細(xì)胞的上皮層增生數(shù)、真皮血管數(shù)和真皮炎性細(xì)胞數(shù)高于空白組（P＜0.01）；造模2組小鼠皮膚黑色素細(xì)胞的上皮層增生數(shù)、真皮血管數(shù)和真皮炎性細(xì)胞數(shù)高于造模1組（P＜0.01）。②免疫組化染色結(jié)果：造模1組和造模2組小鼠皮膚黑色素細(xì)胞的HIS、平均光密度和積分光密度高于空白組（P＜0.01）；造模2組小鼠皮膚黑色素細(xì)胞的HIS、平均光密度和積分光密度高于造模1組（P＜0.01）。結(jié)論采用小鼠皮膚局部黃體酮注射+慢性束縛＋局部紫外線照射＋外涂8-甲氧補(bǔ)骨脂素的綜合實(shí)驗(yàn)方法建立的黃褐斑小鼠模型，更加接近人類黃褐斑病變特征。

黃褐斑；黃體酮；紫外線；慢性束縛；8-甲氧補(bǔ)骨脂素

黃褐斑（chloasma）是一種多因素產(chǎn)生的慢性皮膚色素代謝障礙性疾病，至今尚無療效確切的治療藥物。本研究根據(jù)內(nèi)分泌失調(diào)、日曬是黃褐斑產(chǎn)生的主要因素，皮損區(qū)黑色素細(xì)胞分泌黑色素顆粒增多是其主要病理變化的機(jī)制，采用小鼠皮膚局部黃體酮注射＋慢性束縛＋局部紫外線照射＋外涂8-甲氧補(bǔ)骨脂素（8-MOP）［1］的綜合實(shí)驗(yàn)方法造模，為建立更加接近人類黃褐斑病變特征動(dòng)物模型提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)KM雌性小鼠，體質(zhì)量（20± 2）g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，合格證號(hào)：00513712。

1.2藥物及試劑甲氧沙林溶液（重慶華邦制藥有限公司）；黃體酮注射液（20 mg／支，浙江仙琚制藥股份有限公司）；一抗bs-7362R（南京建成生物工程研究所）

1.3儀器UV236B中波紫外線照射儀（德國(guó)Waldman公司）；BX51T-PHD-J11顯微鏡（日本奧林巴司公司）；形態(tài)學(xué)顯微圖像分析系統(tǒng)（德國(guó)徠卡儀器有限公司）

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1分組與造模小鼠購(gòu)回飼養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、造模1組、造模2組，每組各10只。具體造模方法如下：①空白組：用10%的NaS2水溶液背部脫毛，每2 d脫毛1次，背部裸露約2 cm×2.5 cm的皮膚；每日肌肉注射注射用生理鹽水5 mL／kg體重。②造模1組：脫毛同空白組，每日用波長(zhǎng)320 nm的中波紫外線（UVB）照射小鼠背部皮膚1次，照射時(shí)間30 s；并每日定時(shí)肌肉注射1%黃體酮注射液2 mL／kg體重，兩腿交替注射；同時(shí)每日將小鼠置于特制的束縛桶內(nèi)束縛30 min。③造模2組：方法同組②，同時(shí)局部外涂8-甲氧補(bǔ)骨脂素，每日1次。

2.2標(biāo)本采集造模完4周后取各組小鼠背部脫毛部位皮膚一塊（約0.5 cm×1 cm），剔除其皮下脂肪和黏液組織，用4℃的預(yù)冷生理鹽水沖洗干凈，拭干水分。用4%的多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片。

2.3指標(biāo)觀察

2.3.13組小鼠皮膚黑色素細(xì)胞的病理形態(tài)學(xué)觀察切片經(jīng)HE染色，每張切片選取5個(gè)不同視野，根據(jù)圖象分析管理系統(tǒng)計(jì)數(shù)上皮層增生數(shù)、真皮血管數(shù)及真皮炎性細(xì)胞數(shù)；切片經(jīng)免疫組化染色，每張切片選取5個(gè)不同視野，根據(jù)圖象分析管理系統(tǒng)計(jì)算黑素細(xì)胞染色面積和程度。

2.3.2顯微鏡圖像分析黑色素細(xì)胞用CMOS計(jì)算機(jī)圖像處理系統(tǒng)和專用軟件進(jìn)行圖象分析，每例觀察5個(gè)不同視野。確定黑色素細(xì)胞后，用多功能真彩色細(xì)胞圖象分析管理系統(tǒng)對(duì)目標(biāo)圖象進(jìn)行定量分析：400倍視野下統(tǒng)計(jì)黑色素細(xì)胞百分比，觀察其染色程度并進(jìn)行免疫組化評(píng)分（immunohistochemical score，HIS）。評(píng)分方法如下［4］：A為陽(yáng)性細(xì)胞百分率，A＜5%為0分，5%～25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，75%～100%為4分；B為陽(yáng)性細(xì)胞染色程度，B為陰性為0分，弱陽(yáng)性為1分，中度陽(yáng)性為2分，強(qiáng)陽(yáng)性為3分。A、B兩項(xiàng)乘積即為該例組織的HIS，并根據(jù)圖象分析管理系統(tǒng)計(jì)算出平均光密度和積分光密度。

2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。計(jì)量資料均符合正態(tài)分布以（x±s）表示，采用單因素方差分析。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.13組小鼠皮膚黑色素細(xì)胞HE染色結(jié)果空白組鱗狀上皮較薄，無增生，由排列整齊的基底細(xì)胞和棘細(xì)胞組成，共1～2層，表面有少量角質(zhì)；真皮中見正常的毛囊、皮脂腺，未見汗腺、血管、炎性細(xì)胞；結(jié)締組織、皮下脂肪及肌肉組織未見特殊。造模1組小鼠皮膚的上皮層較空白組增生明顯，共約2～3層，角質(zhì)層增厚，表皮細(xì)胞數(shù)增多，毛囊和皮脂腺增生明顯，血管、炎性細(xì)胞增多。造模2組小鼠皮膚的上皮層較造模1組明顯增生，共約4～6層，角質(zhì)層增厚，表皮細(xì)胞數(shù)增多，毛囊和皮脂腺增生明顯，血管、炎性細(xì)胞明顯增多。見圖1。

圖13組小鼠皮膚HE染色圖（×200）

3.23組小鼠皮膚黑色素細(xì)胞上皮層增生數(shù)、真皮血管數(shù)、真皮炎性細(xì)胞數(shù)比較見表1。3.33組小鼠皮膚黑色素細(xì)胞免疫組化結(jié)果空白組小鼠皮膚表皮中幾乎未見黑色素細(xì)胞，基底層可見單個(gè)散在分布的黑色素細(xì)胞，胞漿著色呈棕黃色。造模1組小鼠皮膚表皮中可見少量黑素色細(xì)胞，基底層可見多個(gè)散在分布的黑色素細(xì)胞，著色面積較空白組大。造模2組皮膚表皮中可見大量黑色素細(xì)胞，表皮基底層可見多個(gè)成簇分布的黑色素細(xì)胞，著色面積較造模1組大，呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，胞漿著色呈深褐色。見圖2。

表13組小鼠皮膚黑素細(xì)胞上皮層增生數(shù)、真皮血管數(shù)、真皮炎性細(xì)胞數(shù)比較（x±s）

圖23組小鼠皮膚黑素細(xì)胞免疫組化圖

3.43組小鼠皮膚黑色素細(xì)胞HIS、平均光密度、積分光密度比較見表2。

4討論

8-甲氧補(bǔ)骨脂素（8-methoxypsoralen，8-MOP）主要存在于多種常見中草藥如蛇床子、北沙參、白芷、枳實(shí)、羌活、芫荽等根莖或果實(shí)中，由于8-MOP結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，易與DNA發(fā)生相互作用，有較多的生物活性［5］。8-MOP對(duì)鼠類B16黑色素瘤細(xì)胞株具有較好的促進(jìn)黑色素生成作用［6］，是治療白癜風(fēng)的藥物。其外用的機(jī)理為：8-MOP是光敏性化合物，能增加黑色素細(xì)胞的密度，增加黑色素細(xì)胞中酪氨酸酶的活性，從而促進(jìn)黑色素的生化合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和擴(kuò)散［7］。該作用機(jī)制與黃褐斑產(chǎn)生的機(jī)理頗為相似，為此，我們?cè)谀壳拔墨I(xiàn)報(bào)道的多因素黃褐斑小鼠動(dòng)物模型研究的基礎(chǔ)上（紫外線照射＋黃體酮注射＋慢性束縛法［2-3］），增加外用促進(jìn)黑素細(xì)胞分泌黑素的藥物（8-MOP）的方法進(jìn)行小鼠黃褐斑動(dòng)物模型的建立，以期創(chuàng)建更加符合人類黃褐斑產(chǎn)生的動(dòng)物模型，為治療黃褐斑新藥研究奠定基礎(chǔ)。

表23組小鼠皮膚黑素陽(yáng)性目標(biāo)HIS、平均光密度、積分光密度比較（x±s）

目前，判斷黃褐斑動(dòng)物模型成功與否的重要指標(biāo)有皮膚黑色素細(xì)胞病理形態(tài)學(xué)觀察以及生化指標(biāo)檢測(cè)。而前者是最直接、最客觀的指標(biāo)。光密度是反映物體顏色的深淺度，是反映物體對(duì)光的吸收率（透過率）的指標(biāo)。顏色越深，對(duì)光線的吸收越多，光密度越高。積分光密度是平均光密度與面積的乘積，顏色越深，面積越大，積分光密度越高［8］。因此，平均光密度、積分光密度可作為觀察黑素細(xì)胞著色深淺度的量化指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)诠忡R下觀察到造模2組小鼠皮膚黑色素細(xì)胞較造模1組明顯增多。而計(jì)算機(jī)的病理圖像學(xué)定量分析結(jié)果顯示：造模2組同造模1組及空白組比較，小鼠皮膚黑色素的HIS、平均光密度、積分光密度均有顯著性差異。因此，采用小鼠皮膚局部黃體酮注射+慢性束縛+局部紫外線照射+外涂8-MOP的綜合實(shí)驗(yàn)方法建立的黃褐斑小鼠模型是成功的。但是沒有對(duì)模型的穩(wěn)定性和維持時(shí)間進(jìn)行觀察，如果模型不夠穩(wěn)定或維持時(shí)間過短，在藥物治療實(shí)驗(yàn)過程很難對(duì)藥物的有效性做出評(píng)價(jià)。因此，模型穩(wěn)定性或維持時(shí)間是評(píng)價(jià)模型是否成功的關(guān)鍵，這些不足有待進(jìn)一步研究完善。

［1］張理平.治療黃褐斑中藥研究的思索［J］.中華醫(yī)學(xué)美學(xué)美容雜志，2005，11（4）：248-249.

［2］汪南玥，陳家旭，吳曉丹.肝郁型黃褐斑小鼠模型的建立及其與現(xiàn)有模型的比較研究［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2007，22（5）：161-163.

［3］薄純光.黃褐斑肝氣郁證小鼠模型的建立及消斑靈干預(yù)［D］.濟(jì)南：山東中醫(yī)藥大學(xué)，2013：1-31.

［4］YING M A，LIN M A，QUAN GUO，et al.Expression of bone morphogenetic protein-2 and its receptors in epithelial ovarian cancer and their influence on the prognosis of ovarian cancer patients［J］.Joural of Experimental&Clinical Cancer Research，2010，29（1）：461-462.

［5］楊倩，楊儉.8-甲氧補(bǔ)骨脂素藥理作用研究進(jìn)展［J］.中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2014，19（10）：1177-1178.

［6］YE Y，CHOU G X，WANG H，et al.Flavonoids apigenin snd icariin exert poten melanogenic activities in murine B16 melanoma cells［J］.Phytomedicine，2010，18（1）：32-35.

［7］龔小梭.8甲氧補(bǔ)骨脂素和艾洛松聯(lián)合外用治療白癜風(fēng)60例［J］.皮膚病與性病，2006，28（2）：42-43.

［8］汪薇，王詩(shī)航.光密度值測(cè)定在實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用及意義［J］.解剖科學(xué)進(jìn)展，2006，12（3）：286.

R285.5

A

1000-338X（2017）02-0053-03

2017-12-15

福建中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目

（201610393080）

蘇美麗（1991—），女，碩士研究生，主要從事中醫(yī)美容方藥的研究。

張理平（1958—），女，教授、碩士生導(dǎo)師。

E-mail：1223754614@qq.com