粉紅粘帚霉的形態(tài)特征及分子生物學(xué)鑒定

周 翠

（東阿縣林業(yè)局，山東 東阿 252200）

粘帚霉（Gliocladiumsp.），屬半知菌門，絲孢綱，叢梗孢目，叢梗孢科，粘帚霉屬，是一種分布廣泛的土壤習(xí)居菌和重寄生菌，具有生長(zhǎng)速度快、產(chǎn)孢量大、寄主范圍廣、寄生能力強(qiáng)、拮抗機(jī)制多樣等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是目前已發(fā)現(xiàn)的拮抗微生物中極具潛力的生防因子之一[1-2］。粉紅粘帚霉（G.roseum，無(wú)性階段拉丁文名稱為Clonostachys rosea）是得到廣泛的研究和應(yīng)用的粘帚霉之一，絲狀真菌，在生長(zhǎng)周期內(nèi)可以產(chǎn)生3種繁殖體，包括菌絲體、分生孢子和厚垣孢子[3-5］。粉紅粘帚霉的生存環(huán)境十分廣泛，熱帶雨林，溫帶，靠近北極地區(qū)以及世界上的沙漠地帶均有粉紅粘帚霉分布。據(jù)報(bào)道，耕地、草地、荒野、淡水、海灘以及鹽堿地都可能分離到粉紅粘帚酶[6］。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：粉紅粘帚霉分離自于山東省濰坊市臨朐縣蘋果枝干部輪紋病病斑，分離純化后保存。

1.2 方法

1.2.1 粉紅粘帚霉的菌落特征

在活化培養(yǎng)3～5d的粉紅粘帚霉菌落邊緣用5mm的無(wú)菌打孔器打取菌餅，轉(zhuǎn)接到已制備好的9cm直徑的PDA平板中央，重復(fù)3組實(shí)驗(yàn)，將接種好的PDA平板放置在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定時(shí)觀察和記錄粉紅粘帚霉菌落顏色、邊緣整齊程度、質(zhì)地、氣生菌絲梳密和發(fā)達(dá)程度、菌株產(chǎn)生色素的情況等變化。

1.2.2 粉紅粘帚霉的形態(tài)特征

當(dāng)純化培養(yǎng)的粉紅粘帚霉菌落顏色開(kāi)始變?yōu)榉奂t色時(shí)，用無(wú)菌解剖針挑取菌落邊緣菌絲置于載玻片上制成臨時(shí)裝片，在顯微鏡下觀察粉紅粘帚霉產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，菌絲形態(tài)以及孢子形態(tài)特征。

1.2.3 粉紅粘帚霉分子生物學(xué)鑒定

1.2.3 .1 液體培養(yǎng)與菌絲的獲得

搖菌：在經(jīng)過(guò)純化的粉紅粘帚霉菌落邊緣用打孔器打取五個(gè)菌餅，將菌餅接種到PD（液體馬鈴薯）培養(yǎng)基中，28℃，200rpm恒溫?fù)u床上培養(yǎng)2d。

菌絲抽提：將培養(yǎng)好的菌絲用真空泵及布式漏斗抽提，除去培養(yǎng)液，獲得干燥的粉紅粘帚霉菌絲，然后用烘箱65℃烘干，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 .2 DNA的提取

采用CTAB法提取粉紅粘帚霉DNA。

1.2.3 .3 PCR擴(kuò)增

設(shè)置 25 μL 反應(yīng)體系為 10×PCR buffer2.5μL，dNTP 1μL，ITS1 引 物 2μL，ITS4 引物 2μL，Taq 酶0.5 μL，Mg2+1μL，DNA 模板 2μL，ddH2O 14μL；其PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性 3min，94℃變性 1 min，55℃退火1 min，72℃延伸 2min，重復(fù)步驟上述 30次，72℃延伸10 min。將獲得PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中取5 μL電泳，觀察目標(biāo)片段的大小。

1.2.3 .4 CR產(chǎn)物的純化回收和測(cè)序

擴(kuò)增后的目標(biāo)片段按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行純化回收，將回收的PCR產(chǎn)物送華大基因公司測(cè)序。

1.2.3 .5 分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

將測(cè)定的菌株ITS序列提交到NCBI上，并用BLAST進(jìn)行同源性序列比對(duì)，確定菌株的分類地位。在所測(cè)定的相關(guān)基因序列的基礎(chǔ)上，再?gòu)腉en-Bank上搜集與測(cè)序菌株相關(guān)的序列，并首先對(duì)測(cè)定序列用Clustalx1.83進(jìn)行序列對(duì)齊，刪除缺失位點(diǎn)、殘缺位點(diǎn)、非編碼序列位點(diǎn)，然后利用MEGA 5.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，以自展法（bootstrap）進(jìn)行檢測(cè)，共循環(huán)1,000次，用鄰接法構(gòu)建菌株序列的鄰接樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 粉紅粘帚霉的菌落特征觀察

在PDA培養(yǎng)基上，菌絲初為白色，邊緣整齊，菌絲匍匐，較疏松，氣生菌絲不發(fā)達(dá)，后菌絲變?yōu)榉奂t色，菌落表面有少許水溢出，菌落底有橙紅色色素產(chǎn)生（見(jiàn)圖 1）。

圖1 粉紅粘帚霉菌落形態(tài)Fig.1 Colonial morphology of Clonostachys

2.2 粉紅粘帚霉的顯微形態(tài)特征觀察

分生孢子梗掃帚狀分枝。分生孢子橢圓形，粘連在一起聚集成團(tuán)狀，菌絲無(wú)色，有隔膜，并且具有與其功能相適應(yīng)的菌環(huán)（見(jiàn)圖2）。

圖2 粉紅粘帚霉的形態(tài)特征Fig.2 Structure characterastics of Clonostachys rosea A粉紅粘帚霉的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)B分生孢子C菌絲D菌環(huán)結(jié)構(gòu)

2.3 粉紅粘帚霉菌株ITS序列測(cè)定

通過(guò)對(duì)菌株的rDNA ITS進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其電泳結(jié)果見(jiàn)圖3。對(duì)PCR擴(kuò)增后的基因序列進(jìn)行凝膠電泳，用2Kb Maker進(jìn)行對(duì)照，我們發(fā)現(xiàn)所得序列大小約為600bp。

圖3 部分菌株ITS序列電泳圖Fig.3 The electrophorogram of ITS

2.4 粉紅粘帚霉菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

通過(guò)構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析樹(shù)我們可以發(fā)現(xiàn)，本次試驗(yàn)所用的菌株編號(hào)為JF817331.1，它的分類地位為半知菌門，絲孢綱，叢梗孢目，叢梗孢科，粘帚霉屬，粉紅粘帚霉。與已知編號(hào)為KP670432.1的粉紅粘帚霉菌株具有最近的親緣關(guān)系。在一定程度上我們可以通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育分析樹(shù)得 到供試菌株的分類地位并參照親緣關(guān)系較近的已知菌株的特性推測(cè)供試菌株的形態(tài)特征等生物學(xué)特性。

圖4 粉紅粘帚霉菌株分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析樹(shù)Fig.4Phylogenetic tree of Clonostachys rosea strain

3 結(jié)論與討論

菌落形態(tài)顯示，粉紅粘帚霉菌絲初為白色，邊緣整齊，菌絲匍匐，較疏松，氣生菌絲不發(fā)達(dá)，后變?yōu)榉奂t色，菌落表面有少許水溢出，菌落底部有橙紅色色素產(chǎn)生，通過(guò)對(duì)粉紅粘帚霉的培養(yǎng)觀察可以看到粉紅粘帚霉可以產(chǎn)生大量分生孢子。ITS序列測(cè)定表明，該菌株與genbank中提交的粉紅粘帚霉（Clonostachys rosea）菌株同源性達(dá)到100%，上述研究明確了該菌株為半知菌門，絲孢綱，叢梗孢目，叢梗孢科，粘帚霉屬，粉紅粘帚霉。

[1］Domsch,K.H.Compendium of Soil Fungi[M］.London,Academic Press,1980.

[2］趙士振，粉紅粘帚霉防治果蔬灰霉病的研究[D］.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

[3］董佩佩，等.粉紅粘帚霉67-1厚垣孢子形成與貯存研究.黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，（10）：48-50.

[4］楊榮華.粘帚霉GR菌株高產(chǎn)β-1,3-葡聚糖酶誘變、酶分離與性質(zhì)研究及菌株鑒定[D］.揚(yáng)州，揚(yáng)州大學(xué)：2010，26.

[5］王春蘭，郭順星，等.粉紅粘帚霉化學(xué)成分的研究[J］.微生物學(xué)通報(bào),2001，28（4）：24-26.

[6］馬桂珍，王淑芳，等.土壤因子對(duì)生防真菌粉紅粘帚霉67-1消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)的影響 [J］.中國(guó)生物防治學(xué)報(bào)，2013，29（1）：97-103.