12種市售亞微乳制劑穩(wěn)定性評價及穩(wěn)定性考察方法研究Δ

陳 偉，周君卓，董武軍，王 宇，喬涌起，李國輝#（.國家癌癥中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院，北京000；.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，北京 00050）

12種市售亞微乳制劑穩(wěn)定性評價及穩(wěn)定性考察方法研究Δ

陳 偉1＊，周君卓2，董武軍2，王 宇1，喬涌起1，李國輝1#（1.國家癌癥中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院，北京100021；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，北京 100050）

目的：評價12種市售亞微乳制劑的穩(wěn)定性，并篩選穩(wěn)定性考察方法。方法：選取市售的12種亞微乳制劑，分別采用高壓滅菌（121℃，30m in）、高速離心（4 000 r/m in，15m in）、加速試驗[溫度（40±2）℃、相對濕度（75±5）%的條件下放置6個月]3種考察方法對亞微乳的pH、粒徑等指標進行測定，通過SPSS 22.0軟件進行粒徑分布方差、卡方檢驗并評價3種考察方法的相關(guān)性。結(jié)果：在穩(wěn)定性考察方面，12種亞微乳pH值在加速試驗后有不同程度下降，平均粒徑大于300 nm的亞微乳有6種；9種亞微乳的粒徑方差分布在0.05～0.15之間，8種亞微乳卡方檢驗結(jié)果分布在1以下；加速試驗后4種亞微乳平均粒徑變化大于10 nm。在穩(wěn)定性考察方法方面，高壓滅菌與加速試驗皮爾森（Pearson）卡方漸進顯著性為0.665＞0.05，表明兩者無相關(guān)性（沒有顯著性），高壓滅菌穩(wěn)定性結(jié)果并不能說明加速試驗的結(jié)果；高速離心與加速試驗Pearson卡方漸進顯著性為0.004＜0.05，表明高速離心穩(wěn)定性與加速試驗結(jié)果有顯著相關(guān)性。結(jié)論：市售亞微乳穩(wěn)定性評價結(jié)果均符合要求；高速離心可在一定程度上代替加速試驗。

亞微乳；穩(wěn)定性；高壓滅菌；高速離心；加速試驗；粒徑

亞微乳粒徑在0.1～1.0μm之間，為熱力學(xué)不穩(wěn)定體系，亞微乳的物理穩(wěn)定性往往成為制劑研發(fā)的瓶頸和關(guān)鍵因素。2015年版《中國藥典》未明確規(guī)定亞微乳的穩(wěn)定性評價方法。目前，多數(shù)研究通過測定粒徑、電位進行篩選[1-5]，但并不能準確地反映亞微乳穩(wěn)定性，而加速穩(wěn)定性試驗和長期穩(wěn)定性試驗卻又太過費時。有研究將各指標進行歸一化處理后計算幾何平均值[6]，但是，在未研究指標影響程度時，將指標加權(quán)處理數(shù)據(jù)用于處方篩選的依據(jù)不足。因此，探索快速、準確的穩(wěn)定性評價方法成為亞微乳研究過程中亟需解決的問題。本研究對12種市售亞微乳制劑的穩(wěn)定性進行了評價，并對3種穩(wěn)定性評價方法進行了篩選，以期找到能對亞微乳處方和工藝進行快速、準確篩選的穩(wěn)定性考察方法。

1 材料

1.1 儀器

SYQ-DSX-280B蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；KBF240恒溫恒濕箱（德國Binder公司）；HC-2518高速離心機（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；380ZLS粒度及Zeta電位檢測分析儀（美國PSS粒度儀公司）；FE20 pH計[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）]。

1.2 藥品

ω-3魚油脂肪乳注射液[編號1，華瑞制藥有限公司，批號：16HG0101，規(guī)格：100m L∶10 g（精制魚油）∶1.2 g（卵磷脂）/瓶]；脂肪乳注射液（C14-24）[編號2，西安力邦制藥有限公司，批號：14112022，規(guī)格：250m L∶25 g（大豆油）∶3 g（卵磷脂）/瓶]；脂肪乳注射液（C14-24）[編號3，華瑞制藥有限公司，批號：80HC149，規(guī)格：250m L∶75 g（大豆油）∶3 g（卵磷脂）/瓶]；結(jié)構(gòu)脂肪乳注射液（C6-24）[編號4，華瑞制藥有限公司，批號：10HK1876，規(guī)格：250m L∶50 g（結(jié)構(gòu)三酰甘油）/瓶]；康萊特注射液（編號5，浙江康萊特藥業(yè)有限公司，批號：1410192-2，規(guī)格：100m L∶10 g/支）；鴉膽子油乳注射液（編號6，江蘇九旭藥業(yè)有限公司，批號：20141206，規(guī)格：10m L/支）；鴉膽子油乳注射液（編號7，廣州白云山明興制藥有限公司，批號：141005，規(guī)格：10 m L/支）；脂肪乳氨基酸（17）葡萄糖（11%）注射液（編號8，瑞典費森尤斯卡比公司，批號：10HK1998，規(guī)格：1 440m L/袋）；脂溶性維生素注射液（編號9，華瑞制藥有限公司，批號：80HL52901，規(guī)格：10 m L/支）；氟比洛芬酯注射液（編號10，北京泰德制藥股份有限公司，批號：2E015A，規(guī)格：5m L∶50mg/支）；腸內(nèi)營養(yǎng)乳劑（TPF-T）（編號11，德國費森尤斯卡比股份有限公司，批號：29H1654，規(guī)格：500 m L/瓶）；腸內(nèi)營養(yǎng)乳劑（TPF-D）（編號12，德國費森尤斯卡比股份有限公司，批號：29HL2052，規(guī)格：500m L/袋）。

2 方法

選取12種市售的亞微乳制劑，分別測定其pH值、粒徑，計算粒徑分布的方差和卡方檢驗。對每種亞微乳分別采取高壓滅菌（121℃，30min）、高速離心[半徑為10 cm、轉(zhuǎn)速4 000 r/min（約1 800×g）離心15min]、加速試驗[溫度（40±2）℃、相對濕度（75±5）%的條件下放置6個月]3種考察方法進行處理，處理后測定亞微乳平均粒徑，計算粒徑分布的方差和卡方檢驗等指標。

2.1 穩(wěn)定性考察項目

2.1.1 外觀 觀察亞微乳的外觀，應(yīng)為乳白色液體?？疾炝鲃有?，觀察與空氣接觸液體表面及與容器接觸液體表面有無油滴，是否分層。

2.1.2 pH值 使用pH計分別測定12種樣品原pH值，然后進行加速試驗，之后再次測定pH值。

2.1.3 粒徑 采用動態(tài)光散射原理進行粒徑測定。具體步驟如下：取亞微乳1m L，用適量純化水稀釋，稀釋液加入比色皿中，使用380ZLS粒度及Zeta電位檢測分析儀進行測定，記錄亞微乳平均粒徑等數(shù)據(jù)。

2.1.4 粒徑分布方差、卡方檢驗 在粒徑測定過程中，同時記錄粒徑分布方差、卡方檢驗結(jié)果來代表乳劑中乳滴的粒徑分布情況。其中，方差是衡量隨機變量或一組數(shù)據(jù)時離散程度的度量。此處方差值用來度量粒徑和平均粒徑之間的偏離程度，是各個粒徑分別與平均粒徑之差的平方和的平均數(shù)?？ǚ綑z驗是對樣本的頻數(shù)分布所來自的總體分布是否服從某種理論分布或某種假設(shè)分布所作的假設(shè)檢驗。此處卡方值代表粒徑分布是否服從正態(tài)分布。

2.2 穩(wěn)定性考察方法評價

通過SPSS 22.0分析粒徑分布方差、卡方檢驗并考察3種考察方法的相關(guān)性。

3 結(jié)果

3.1 外觀觀察結(jié)果

12種市售亞微乳制劑外觀觀察結(jié)果見表1。

表1 12種市售亞微乳制劑外觀觀察結(jié)果Tab 1 Observation resu lts of appearance of 12 kinds of subm icro emulsion inmarket

3.2 pH值測定結(jié)果

12種市售亞微乳制劑加速試驗前后pH值測定結(jié)果見表2。

表2 12種市售亞微乳制劑加速試驗前后pH值測定結(jié)果Tab 2 Determ ination results of pH value of 12 kinds of subm icro emu lsion in m arket before and after accelerated test

從表2可以看出，亞微乳加速試驗后pH值均出現(xiàn)不同程度下降，但使用多聚復(fù)合膜塑料袋包裝的編號4、8樣品的pH值下降最為顯著。

3.3 3種方法試驗評價結(jié)果

12種市售亞微乳制劑3種方法試驗評價結(jié)果見表3。

從表3可以看出，高速離心、高壓滅菌、加速試驗三者均會造成亞微乳的粒徑改變。比較三者結(jié)果，高壓滅菌后粒徑變化較大，該結(jié)果與加速試驗后粒徑變化結(jié)果相差較大，而加速試驗后粒徑變化較大的亞微乳在高速離心后粒徑也呈現(xiàn)了較大變化，說明兩者有一定相關(guān)性。各樣品測定結(jié)果中，平均粒徑大于300 nm的亞微乳有6種，而其中4種在加速試驗后粒徑變化較大，說明粒徑較大者穩(wěn)定性更差，更容易在儲存過程中出現(xiàn)粒徑增大的情況。9種亞微乳粒徑的方差主要分布在0.05～0.15之間，其中粒徑變大的4個品種中有3個品種方差在0.1以上，說明粒徑分布的差異越大越會增加亞微乳的不穩(wěn)定性。8種亞微乳卡方檢驗結(jié)果分布在1以下，只有4個品種卡方值大于1，其中3個品種大于2。所有加速試驗后粒徑增大的品種，都出現(xiàn)在卡方值大于2的范疇。從原理上來講，乳滴粒徑的分布越接近正態(tài)分布，說明乳滴生產(chǎn)過程中的均質(zhì)工藝和乳滴形成作用越均勻和全面，所以最后得到的亞微乳也越穩(wěn)定。因此，在生產(chǎn)亞微乳的處方和工藝篩選試驗中可以將粒徑分布的卡方檢驗結(jié)果作為評價指標之一。

表3 12種市售亞微乳制劑采用3種方法試驗的評價結(jié)果Tab 3 Investigation results of 12 kinds of subm icro emulsion inmarketby 3 kindsofmethod

3.4 平均粒徑等指標的頻數(shù)分析

應(yīng)用SPSS 22.0進行描述性統(tǒng)計分析，對平均粒徑、粒徑分布方差值、粒徑分布卡方值等數(shù)據(jù)進行頻數(shù)分析，結(jié)果見表4。

表4 3種方法考察下平均粒徑的頻數(shù)分析結(jié)果Tab 4 Frequency analysis resultsof the average particle size by 3 kindsofm ethod

從表4可以看出，高壓滅菌后粒徑變化平均數(shù)和標準差均顯著高于加速試驗后和高速離心后的相應(yīng)指標；從百分位數(shù)來看，高壓滅菌后粒徑變化的分布狀態(tài)與加速試驗后和高速離心后也有顯著區(qū)別。以上說明高壓滅菌對粒徑的影響更大。

3.5 高壓滅菌與加速試驗相關(guān)性分析

應(yīng)用SPSS 22.0對高壓滅菌與加速試驗粒徑差的相關(guān)性進行方差分析，結(jié)果顯示高壓滅菌和加速試驗后粒徑均未發(fā)生變化的有5個樣品（占41.67%），粒徑均發(fā)生變化的有1個樣品（占8.33%）。皮爾森（Pearson）卡方漸進顯著性為0.665，其值大于0.05，表明兩者無相關(guān)性（沒有顯著性），高壓滅菌穩(wěn)定性結(jié)果并不能說明加速試驗的結(jié)果。

3.6 高速離心與加速試驗相關(guān)性分析

應(yīng)用SPSS 22.0對高速離心與加速試驗粒徑差的相關(guān)性進行方差分析，結(jié)果顯示高速離心和加速試驗后粒徑均未發(fā)生變化的有7個樣品（占58.33%），粒徑均發(fā)生變化的有4個樣品（占33.33%）。Pearson卡方漸進顯著性為0.004，其值小于0.05，表明高速離心檢測粒徑變化與加速試驗結(jié)果有顯著相關(guān)性，高速離心可以在一定程度上代替加速試驗的結(jié)果。

4 討論

4.1 影響pH值的因素和pH值對穩(wěn)定性的影響

亞微乳中含有磷脂分子，其在存儲過程中可能發(fā)生酯鍵水解，會產(chǎn)生脂肪酸，亦或發(fā)生氧化則會產(chǎn)生溶血卵磷脂和脂肪酸等，這些變化中產(chǎn)生的酸性成分會導(dǎo)致pH值下降。所以，pH值下降可以作為磷脂分子變化程度的度量指標。

pH值對于亞微乳的穩(wěn)定性有雙重影響，適宜的pH值可使卵磷脂膜表面上的磷酸基團電離，從而得到最佳的表面電位；適宜的pH值還可以減少卵磷脂水解，從而保證亞微乳穩(wěn)定性[7]。低pH值（低于5）可以導(dǎo)致乳化油滴之間的靜電斥力減小，從而導(dǎo)致乳滴尺寸的增大和聚合幾率升高。

從表2結(jié)果可見，編號4、8的樣品pH值下降最為顯著，兩者均為多聚復(fù)合膜塑料袋包裝。其原因可能由于多聚復(fù)合膜塑料袋的透氧和透濕性高于其他材質(zhì)，導(dǎo)致氧氣和水分透入，造成亞微乳中三酰甘油和卵磷脂快速水解釋放出游離脂肪酸，從而導(dǎo)致pH快速下降。國外已有研究證實，包裝容器對于亞微乳有較大影響。Driscoll DF等[7-8]比較了使用塑料容器和玻璃容器包裝的脂肪乳，證明使用塑料容器包裝的靜脈注射脂肪乳，在24 h后大粒子明顯增加。Martin CR等[9]研究發(fā)現(xiàn)，與玻璃容器相比，塑料容器包裝的脂肪乳給藥以后患者高三酰甘油血癥發(fā)生率升高。pH的顯著變化可能是由于不同塑料包裝的影響，但證實此結(jié)論有待進一步研究。

4.2 影響穩(wěn)定性的因素

乳劑的穩(wěn)定性與粒徑及其分布有關(guān)，粒徑越小、粒徑分布越窄，乳劑越穩(wěn)定[10]。粒徑的大小和變化是反映亞微乳穩(wěn)定性的另一項重要指標，亞微乳制備完成后粒徑較小，說明其油水表面張力在乳化劑的作用下得到了更好的緩解和釋放，因此可以說明其乳化效果更好、穩(wěn)定性增加。同時，亞微乳粒徑也能說明其在存儲過程中的穩(wěn)定性，存儲過程中發(fā)生乳滴合并和破乳必然會導(dǎo)致粒徑的改變。因此，檢測粒徑的變化就顯得尤為重要。

平均粒徑變化的數(shù)據(jù)可以在一定程度說明乳劑的穩(wěn)定性，然而，如果乳劑在制備、滅菌、存儲過程中分布在平均粒徑兩側(cè)的乳滴同時出現(xiàn)增大或減小，或者出現(xiàn)多峰現(xiàn)象，雖然平均粒徑有可能沒有發(fā)生顯著變化，但是此種情況同樣會造成乳劑的穩(wěn)定性降低。

4.3 高壓滅菌與加速試驗的可替代性

高壓滅菌不能替代加速試驗用于穩(wěn)定性研究，其原因可能在于高壓滅菌過程中發(fā)生了重新乳化，乳化劑在油相與連續(xù)介質(zhì)水相間重新分布，再次形成亞微乳的乳滴[11]。同時，由于高壓滅菌溫度過高、壓力過大，顯著超過了亞微乳的日常存儲溫度，顯著加劇了乳化劑中化學(xué)成分之間的化學(xué)反應(yīng)。另外，張娜等[12]考察了滅菌工藝對不同乳化劑及油相所制亞微乳物理穩(wěn)定性的影響，證明了處方不同也會造成高壓滅菌與加速試驗的差異。以上替代加速試驗因素均導(dǎo)致不確定性增加，因而無法使用高壓滅菌替代加速試驗來檢驗亞微乳的穩(wěn)定性。

4.4 高速離心與加速試驗的可替代性

高速離心可以在一定程度上代替加速試驗，其原因在于高速離心增加了乳滴之間的碰撞幾率，碰撞的幾率增加可以在短時間內(nèi)達到模擬乳劑長期存放后乳滴間碰撞、合并的結(jié)果，所以高速離心法能比較準確地測定乳劑的穩(wěn)定性。

綜合考慮上述試驗結(jié)果，市售亞微乳穩(wěn)定性評價結(jié)果均符合要求，高速離心可在一定程度上代替加速試驗，對處方和工藝進行快速、準確的篩選。研究過程中，為了快速篩選穩(wěn)定的亞微乳，可以考慮在處方和工藝篩選時選擇乳化劑粒徑小于300 nm的亞微乳；同時，選擇粒徑方差分布小于0.1的亞微乳也會有更好的穩(wěn)定性。并且采用在高速離心后測定平均粒徑差的方法來代替加速試驗進行快速的處方篩選。本研究建立了快速確定亞微乳穩(wěn)定性的篩選條件，為亞微乳的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。然而，由于受到經(jīng)費和時間等原因限制，本研究考察樣本數(shù)量有限。因此，此快速篩選條件有一定局限性，尚需進一步研究予以證實。

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Study on the Stability Evaluation of 12 K inds of Subm icro Emulsion in M arket and the Test M ethod for the Stability

CHENWei1，ZHOU Junzhuo2，DONGWujun2，WANG Yu1，QIAO Yongqi1，LIGuohui1（1.National Cancer Center/ Cancer Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100021，China；2.Institute of Materia Medica，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100050，China）

OBJECTIVE：To evaluate the stability of 12 kinds of submicro emulsion in market，and screen the testmethod for the stability.METHODS：12 kinds of subm icro emulsion in market were selected，high pressure sterilization（121℃，30 min），high speed centrifugation（4 000 r/m in，15 m in），accelerated test[placing 6 months under temperature of（40±2）℃，relative humidity of（75±5）%]were conducted to investigate the pH，particle size and other indexes，and SPSS 22.0 was used to analyze the distribution variance and chi-square test，and investigate the correlation of 3 evaluation methods.RESULTS：In terms of stability investigation，the pH value of 12 kinds of subm icro emulsion decreased to some extent after accelerated test，average particlesize of 6 kinds of subm icro emulsion sampleswere greater than 300 nm，the variance of the particle size distribution of 9 kinds appeared in 0.05-0.15，the chi-square test results of 8 kinds distributed below 1.The average particle size of 4 kinds of subm icro emulsions changed more than 10 nm after accelerated test.In terms of stability testmethod，Pearson chi-square progressive significance of high pressure sterilization and accelerated test was 0.665，which was higher than 0.05，indicating there was no correlation（no significance），the stability results of high pressure sterilization can not represent the results of accelerated test；that of high speed centrifugation and accelerated testwas 0.004，which was lower than 0.05，indicating stability results between high speed centrifugation and accelerated test results were significantly correlated.CONCLUSIONS：The subm icro emulsion in market can meet the requirements of stability.To a certain extent，high speed centrifugation can replace the acceleration test.

Subm icro emulsion；Stability；High pressure sterilization；High speed centrifugation；Accelerated test；Particle size

R944.1

A

1001-0408（2017）13-1769-05

2016-08-30

2017-02-09）

（編輯：余慶華）

中國癌癥基金會“北京希望馬拉松”專項基金資助項目（No.LC2014B05）

＊碩士。研究方向：藥物制劑、藥動學(xué)、臨床藥學(xué)。電話：010-87788577。E-mail：sorros900@126.com

#通信作者：主任藥師。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)。電話：010-87788574。E-mail：lgh0603@126.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.13.12