毒死蜱降解菌CD7的篩選與植物根際促生菌JD37的聯(lián)合應(yīng)用

蘇翠珠, 蔣秋悅, 章 麗, 羅 斯, 楊文武, 孫舒榮, 肖 明*

(1.上海師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 植物種質(zhì)資源開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心,上海 200234; 2.復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,上海 200438)

毒死蜱降解菌CD7的篩選與植物根際促生菌JD37的聯(lián)合應(yīng)用

蘇翠珠1?, 蔣秋悅1,2?, 章 麗1, 羅 斯1, 楊文武1, 孫舒榮1, 肖 明1*

(1.上海師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 植物種質(zhì)資源開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心,上海 200234; 2.復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,上海 200438)

篩得一株毒死蜱降解菌CD7,聯(lián)合植物根際促生菌JD37,研制了一種能修復(fù)土壤的農(nóng)藥污染,同時(shí)促進(jìn)植物生長的復(fù)合型土壤改良劑.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:將CD7和JD37發(fā)酵液按體積比1∶1使用,可以促進(jìn)植物生長,并在25 d內(nèi)降解土壤中約66.43%的毒死蜱.在載體量相同情況下,蚯蚓糞比滑石粉吸附更多混合菌株.在室溫貯藏一個(gè)月,活菌數(shù)為4.81×107CFU/g;制備的復(fù)合改良劑與土壤按質(zhì)量比1∶1使用時(shí),能促進(jìn)植物生長、提升土壤酶活性、增加土壤中微生物的數(shù)量.

植物根際促生菌; 毒死蜱降解菌 CD7; 土壤改良; 篩選

0 引 言

隨著人口的不斷增長,中國耕地資源日趨缺乏,施用化肥和農(nóng)藥是目前維持人口與糧食間平衡的主要手段之一[1].然而,大量使用化肥和農(nóng)藥會(huì)導(dǎo)致土壤板結(jié)、土壤酸化、地下水污染和農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留超標(biāo)等問題[2].其中,較普遍使用的有機(jī)磷農(nóng)藥“毒死蜱”在土壤中殘留時(shí)間長,使生態(tài)環(huán)境惡化[3-4].

植物根際微生物種類繁多且活躍,構(gòu)成了植物根際特有的微生物區(qū)系.植物根際促生菌(PGPR)是一類可以自由生活在土壤或定殖于植物根際的有益菌類[5].它能影響植物對(duì)礦質(zhì)營養(yǎng)的吸收與利用,保護(hù)植物免受不同土壤病原體的危害,從而促進(jìn)植物生長.同時(shí)它還能夠快速、高效地分解農(nóng)藥殘留物,改善土壤品質(zhì)[6].

本文作者在土壤中進(jìn)行毒死蜱降解菌的篩選與培育,并與植物根際促生菌復(fù)配,制備了微土壤改良劑.從毒死蜱降解與促進(jìn)植物生長能力方面,研究了兩株菌的最佳復(fù)配比例;研究不同載體對(duì)復(fù)配菌株的吸附能力和菌株貯藏時(shí)間的影響;通過盆栽實(shí)驗(yàn)研究所制備的微生物土壤改良劑的施用量,為微生物土壤改良的實(shí)際應(yīng)用提供參考.

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 土壤樣品

篩選毒死蜱降解菌的土樣采自上海市金山區(qū)廊下果蔬園藝有限公司植物根際土壤和園藝土壤.

栽培土取自上海師范大學(xué)徐匯校區(qū)植物園地表下10 cm處土壤,使用篩孔邊長為1.43 mm的標(biāo)準(zhǔn)篩過篩,121 ℃下滅菌20 min,重復(fù)3次,烘干備用.

1.1.2 供試菌株

桔黃假單胞菌JD37(PseudomonasaurantiacaJD37)由上海師范大學(xué)微生物分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離、純化、保藏.菌種保藏號(hào):CGMCC No.1.10967.

1.1.3 供試植物

小青菜種子選用上海青(BrassicachinensisL.),購自上海白玉蘭蔬菜種子有限公司.

1.1.4 培養(yǎng)基和材料

無機(jī)鹽培養(yǎng)基和富集培養(yǎng)基,滅菌后加入經(jīng)氯仿抽濾滅菌的毒死蜱,質(zhì)量濃度為50 mg/L,用于毒死蜱降解菌的篩選與分離.

培養(yǎng)基包括:King′s B(KB)液體培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基、高氏(Gause)1號(hào)培養(yǎng)基、馬丁氏(Martin)培養(yǎng)基.

所有培養(yǎng)基使用前在121 ℃下高壓滅菌20 min.

載體材料:蚯蚓糞購于南京華墨現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司;滑石粉購于上海前進(jìn)化學(xué)試劑廠.載體在121 ℃下滅菌30 min,重復(fù)3次,烘干備用.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 供試菌株的活化與毒死蜱降解菌的篩選

將-80 ℃下貯藏的JD37菌株接種于KB液體培養(yǎng)基,置于28 ℃下?lián)u床振蕩培養(yǎng),轉(zhuǎn)速為200 r/min,活化3次,接種,接種量為1%.培養(yǎng)20 h后,取出處于對(duì)數(shù)生長期的種子液(生物量濃度約為109CFU/mL)接入裝有50 mL KB液體培養(yǎng)基的容量為250 mL的三角瓶中,置于搖床,28 ℃,轉(zhuǎn)速為200 r/min,震蕩培養(yǎng)20 h制備成JD37菌懸液.

將篩得并貯藏的CD7菌株接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基,置于搖床,30 ℃,轉(zhuǎn)速為200 r/min,震蕩培養(yǎng),按上述相同方法進(jìn)行菌株活化,制備CD7菌懸液.

采用土壤細(xì)菌篩選、分離的常規(guī)方法[7],利用含毒死蜱(質(zhì)量濃度為50 mg/L)的無機(jī)鹽培養(yǎng)基和富集培養(yǎng)基進(jìn)行毒死蜱降解菌的篩選.

1.2.2 菌株在培養(yǎng)基中降解能力測定

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制[7]

將毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品用石油醚溶解后確配制成質(zhì)量濃度為84 mg/L的25 mL毒死蜱母液,然后將母液稀釋成質(zhì)量濃度分別為0,8.4,16.8,25.2,33.6,42.0,50.4 mg/L的毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)液,并測定它們對(duì)293 nm波長光的吸光度.

1.2.2.2 菌株降解能力測定[8]

用富集培養(yǎng)基富集待測菌株,當(dāng)菌懸液的OD600為0.8時(shí),以5 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min后收集菌株,再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的NaCl沖洗2遍后重懸于無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,按1%的接種量轉(zhuǎn)接到毒死蜱質(zhì)量濃度為100 mg/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,培養(yǎng)72h后,取4 mL培養(yǎng)液加入等體積石油醚萃取2次,測定兩次得到的萃取液混合對(duì)293 nm波長光的吸光度,依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算毒死蜱質(zhì)量濃度.

菌株在培養(yǎng)基中的降解率為

(1)

式中C2為培養(yǎng)72h后對(duì)照組毒死蜱的質(zhì)量濃度,C1為培養(yǎng)72h后實(shí)驗(yàn)組毒死蜱的質(zhì)量濃度,C0為毒死蜱初始質(zhì)量濃度.

1.2.3 菌株在土壤中降解能力測定

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

用乙酸乙酯溶解毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品,并精確配制出25 mL質(zhì)量濃度為100 mg/L的毒死蜱母液.再用乙酸乙酯將已配制的母液稀釋成質(zhì)量濃度分別為0,1,5,10,50,80 mg/L的毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)液,并測定它們對(duì)293 nm波長光的吸光度.

1.2.3.2 菌株降解能力測定

取1g實(shí)驗(yàn)土樣置于容量為50 mL的離心管中,加入25 mL乙酸乙酯浸泡.浸泡液經(jīng)裝有無水Na2SO4的漏斗至圓底燒瓶中,再依次用20,20,10 mL乙酸乙酯沖洗剩余土壤,合并沖洗液,置于45 ℃的真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至干,加入5 mL乙酸乙酯定容后于293 nm波長光下測定吸光度[10-11],依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算毒死蜱的質(zhì)量濃度.實(shí)驗(yàn)3次重復(fù).

1.2.4 復(fù)配菌株對(duì)植物生長的影響

將毒死蜱加至滅菌土壤,攪拌混勻,使土壤中毒死蜱的質(zhì)量濃度達(dá)到500 mg/L.

挑選健康飽滿、大小均一的小青菜種子,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的高錳酸鉀溶液浸泡20 min進(jìn)行表面消毒,用無菌水沖洗4～5遍,置于鋪有無菌濾紙的平皿中,注入15 mL無菌水,在28 ℃的光照培養(yǎng)箱內(nèi)暗培養(yǎng)3d后,挑選已發(fā)芽的健康小青菜種子,播種在含毒死蜱的土壤中,2粒/穴,6穴為1組,實(shí)驗(yàn)3次重復(fù).在播種后第1天,及之后每隔4d澆灌不同配比(體積比)的菌液,CD7和JD37菌液中菌體數(shù)量約為107CFU/mL.對(duì)照組澆灌無菌水.盆栽實(shí)驗(yàn)放置于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行,設(shè)定參數(shù)為30 ℃光照培養(yǎng)14 h,20 ℃暗培養(yǎng)10 h,實(shí)驗(yàn)期間澆灌無菌水保持土壤濕潤.于出苗后第25天取樣,統(tǒng)計(jì)小青菜幼苗的生長指標(biāo).

1.2.5 復(fù)配菌株對(duì)毒死蜱降解能力的測定

上述實(shí)驗(yàn)取樣結(jié)束后,收集種植過小青菜的土壤,采用1.2.3的方法分別測定播種第1天與第25天土壤中毒死蜱的殘留量.實(shí)驗(yàn)3次重復(fù).

1.2.6 不同載體材料吸水能力的測定

向不同載體材料中加無菌水,每次加入1 mL,充分?jǐn)嚢杌靹?使載體保持濕潤不結(jié)塊.實(shí)驗(yàn)3次重復(fù).

載體吸水率為

(2)

式中m1為添加無菌去離子水的質(zhì)量,m2=100 g為載體質(zhì)量.

1.2.7 不同載體材料對(duì)復(fù)配菌株吸附能力的測定

分別取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期的CD7和JD37菌液5,15,25,35,50 mL,4 ℃下,以10 000r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min,棄上清液,用無菌水沖洗1遍后將等體積的CD7和JD37菌液混合,用無菌水沖洗2～3遍,收集復(fù)配菌株并稱重,加入10 mL無菌水重懸.

分別將1g滑石粉和1 g蚯蚓糞加入到裝有40 mL無菌水的容量為250 mL的三角瓶中,再加入已制備的10 mL復(fù)配菌株懸液,置于磁力攪拌器上進(jìn)行復(fù)配菌株吸附能力實(shí)驗(yàn),吸附時(shí)間為30 min,然后過濾,將濾液離心后收集菌株并稱重.實(shí)驗(yàn)3次重復(fù).

復(fù)配菌株吸附率為

(3)

式中N為吸附前溶液中復(fù)配菌株的質(zhì)量濃度,N′為吸附后溶液中復(fù)配菌株的質(zhì)量濃度.

1.2.8 不同載體材料對(duì)復(fù)配菌株貯藏時(shí)間的影響

分別向滑石粉和蚯蚓糞中加入等體積的復(fù)配菌株懸液,攪拌混勻,于室溫密封貯藏.分別于實(shí)驗(yàn)后1,5,11,25,30 d取樣,采用稀釋涂布法測定樣品中的有效活菌數(shù).對(duì)照組為不添加載體的復(fù)配菌株發(fā)酵液,實(shí)驗(yàn)3次重復(fù).

1.2.9 復(fù)合土壤改良劑的施用配比研究

將制備好的復(fù)合土壤改良劑與土壤按不同質(zhì)量比混合:(1)土壤對(duì)照組(CK組即不添加復(fù)合改良劑組);(2)m(復(fù)合土壤改良劑)∶m(土壤)=1∶2;(3)m(復(fù)合土壤改良劑)∶m(土壤)=1∶1;(4)m(復(fù)合土壤改良劑)∶m(土壤)=2∶1;(5)復(fù)合土壤改良劑載體.

在上述土壤中分別播種小青菜后置于光照培養(yǎng)箱培養(yǎng),期間澆灌無菌水保持土壤濕潤,實(shí)驗(yàn)3次重復(fù).于出苗后25 d取樣,測定土壤酶活性[12]、土壤微生物數(shù)量[7]和小青菜幼苗生長指標(biāo).

2 結(jié)果與分析

2.1 毒死蜱降解菌的篩選及降解能力的測定

表1 毒死蜱降解菌在培養(yǎng)基、土壤中的降解能力

從金山大田植物根際土壤和園藝土壤中,經(jīng)過篩選排重后,共得到11株毒死蜱降解菌.分別命名為:CD1～3,CD5～12.經(jīng)分離純化后測定11株菌對(duì)培養(yǎng)基和土壤中毒死蜱的降解效率如表1所示.從表1可知,與培養(yǎng)基中的菌株相比,在營養(yǎng)較差的土壤環(huán)境的多數(shù)菌株降解能力減弱,而CD5～7和CD10降解能力反而增強(qiáng),說明這4株菌適應(yīng)外界環(huán)境能力較強(qiáng).另外,可明顯看出CD7降解毒死蜱能力最強(qiáng),分別為29.35%和71.54%,故選用CD7菌株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).

提取CD7菌株的基因組DNA進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增,將擴(kuò)增得到的產(chǎn)物純化后測序,結(jié)果上傳至NCBI(National Center for Biotechnology Information)的Genbank中進(jìn)行BLAST比對(duì),鑒定其屬于伯克氏菌屬(Burkholderiasp.).

2.2 復(fù)配菌株對(duì)植物生長的影響

桔黃假單胞菌JD37從上海市郊農(nóng)作物根際土壤中篩選得到[13],相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)該菌株對(duì)玉米、小麥、小白菜和蕹菜等作物生長有促進(jìn)效果,還能高效抑制多種植物病原菌,例如小麥赤霉病(Fusariumgraminearum)、水稻紋枯病(Rhizoctoniasolani)、番茄灰霉病(Botrytiscinerea)及油菜菌核病(Sclerotiniasclerotiorum)等[14].

苗穴實(shí)驗(yàn)觀察CD7與JD37聯(lián)合接種對(duì)小青菜的促生效果,播種后25 d采樣,分別測定小青菜的根長、苗高、鮮重及干重(表2).單因素方差分析結(jié)果表明,CD7與JD37聯(lián)合接種對(duì)小青菜的苗高、鮮重和干重的促進(jìn)作用顯著大于單獨(dú)接種CD7或JD37(P<0.05).此外,CD7與JD37按1∶1體積比配比聯(lián)合接種小青菜的生長情況最好(圖1).

表2 不同配比復(fù)配菌株對(duì)小青菜幼苗生長的影響

圖1 不同配比復(fù)配菌株對(duì)小青菜幼苗生長的影響

2.3 復(fù)配菌株對(duì)毒死蜱降解能力的測定

圖2 不同配比復(fù)配菌株對(duì)毒死蜱的降解率

不同配比復(fù)配菌株對(duì)毒死蜱的降解率如圖2所示,從圖2可看出,在種植小青菜的土壤中單獨(dú)接種CD7或JD37可降解土壤中的毒死蜱,與對(duì)照組相比,降解率差異顯著.當(dāng)CD7與JD37按體積比1∶1配比聯(lián)合接種時(shí),對(duì)種植小青菜的土壤中的毒死蜱降解效果最好,降解率約66.43%,分別是單獨(dú)接種CD7或JD37的1.65倍和1.89倍.

綜合2.2節(jié)和2.3節(jié)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,CD7與JD37最適復(fù)配比(體積比)為1∶1,該復(fù)配比可以降低土壤中毒死蜱含量,同時(shí)促進(jìn)含毒死蜱土壤中小青菜的生長.

2.4 不同載體材料吸水能力的測定

分別選用滑石粉和蚯蚓糞作為復(fù)配菌株的載體材料,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),滑石粉的吸水率為54.1%,蚯蚓糞的吸水率為23.4%.滑石粉的吸水能力高于蚯蚓糞.

2.5 不同載體材料對(duì)復(fù)配菌株吸附能力的測定

圖3 不同載體對(duì)復(fù)配菌株的吸附能力

不同載體對(duì)復(fù)配菌株的吸附能力如圖3所示.從圖3可以看出,當(dāng)載體用量相同時(shí),不同載體對(duì)復(fù)配菌株的吸附能力都隨復(fù)配菌株菌液量的增加而減少,2種載體的吸附率As都呈下降趨勢.當(dāng)復(fù)配菌液量為10 mL時(shí),復(fù)配菌株能完全被2種載體吸附,As=100%.當(dāng)菌液量為30 mL時(shí),蚯蚓糞仍然能完全吸附復(fù)配菌株,而滑石粉對(duì)菌株的吸附率下降為96.33%;當(dāng)菌液量為50 mL時(shí),滑石粉對(duì)菌株的吸附率下降至73.77%,變化較大,蚯蚓糞的吸附率也略有下降,約為89.70%;當(dāng)菌液量為100 mL時(shí),滑石粉的吸附率僅為42.31%.相比而言,蚯蚓糞的吸附率下降較緩慢,其吸附能力好于滑石粉,能吸附更多的混合菌株,這可能與蚯蚓糞的結(jié)構(gòu)性質(zhì)相關(guān).

2.6 不同載體材料對(duì)復(fù)配菌株貯藏時(shí)間的影響

圖4 不同載體對(duì)復(fù)配菌株貯藏時(shí)間的影響

在長期貯藏過程中,合適的載體是保障微生物活性的關(guān)鍵,它不僅會(huì)影響微生物的數(shù)量,還會(huì)影響成品的質(zhì)量.不同載體對(duì)復(fù)配菌株貯藏時(shí)間的影響如圖4所示.從圖4可知,不添加載體或以滑石粉為載體的復(fù)配菌株數(shù)量變化相似,室溫貯藏5 d后,復(fù)配菌株數(shù)量略有上升,第5～11 d,復(fù)配菌株數(shù)量呈明顯下降趨勢;以蚯蚓糞為載體的復(fù)配菌株數(shù)量在室溫貯藏5 d后急劇下降,從3.45×108CFU/g降至1.34×108CFU/g.室溫貯藏30 d后,添加滑石粉和蚯蚓糞作為載體更利于復(fù)配菌株的貯藏,菌株數(shù)量為2.47×107CFU/g和4.81×107CFU/g.

綜合2.5節(jié)和2.6節(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,蚯蚓糞更適合作為復(fù)配菌株的載體,既有利于復(fù)配菌株的吸附,又為復(fù)配菌株的長期貯藏提供保障.

2.7 復(fù)合土壤改良劑的制備方法

蚯蚓糞經(jīng)121 ℃滅菌30 min,重復(fù)3次,烘干備用.無菌條件下,分別取培養(yǎng)20 h,處于對(duì)數(shù)生長期的CD7菌懸液和JD37菌懸液500 mL,4 ℃下,以轉(zhuǎn)速1×104r/min離心10 min,棄上清液,用無菌水沖洗2～3遍后收集復(fù)配菌株,加入23.4 mL無菌水(吸水率為23.4%)和100 g蚯蚓糞,將載體與菌株充分混勻,裝入塑封袋中,室溫貯藏.

2.8 復(fù)合土壤改良劑與土壤不同配比施用對(duì)土壤酶活性的影響

探究復(fù)合土壤改良劑的不同施用配比是后續(xù)實(shí)際施用實(shí)驗(yàn)的參考依據(jù).表3結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,按不同配比施用復(fù)合土壤改良劑能提高各種土壤酶的活性.復(fù)合土壤改良劑與土壤按1∶1(質(zhì)量比)配比施用對(duì)土壤蔗糖酶活性的增加效果最為明顯(P<0.05),且高于含豐富有機(jī)質(zhì)的蚯蚓糞處理組;同時(shí)也可以提高土壤脲酶和纖維素酶活性,并與其他處理組差異顯著.蚯蚓糞處理組的土壤過氧化氫酶活性最高,其次是復(fù)合土壤改良劑與土壤2∶1施用配比處理組.

表3 不同配比土壤改良劑對(duì)土壤酶活性的影響

2.9 復(fù)合土壤改良劑與土壤不同配比施用對(duì)土壤微生物數(shù)量的影響

圖5 不同配比土壤改良劑對(duì)土壤微生物數(shù)量的影響

從圖5結(jié)果可知,與對(duì)照組相比,不同配比復(fù)合土壤改良劑的施用能增加土壤中真菌數(shù)量,有機(jī)質(zhì)含量較高的蚯蚓糞反而會(huì)對(duì)真菌數(shù)量產(chǎn)生抑制作用.土壤中細(xì)菌數(shù)量變化不明顯,除復(fù)合土壤改良劑與土壤配比為2∶1(質(zhì)量比)的處理組會(huì)減少細(xì)菌數(shù)量,其他各處理組土壤細(xì)菌數(shù)量無顯著差異.土壤中放線菌數(shù)量變化較明顯,復(fù)合土壤改良劑與土壤配比為2∶1(質(zhì)量比)的處理組和蚯蚓糞處理組含放線菌數(shù)量最高,分別為6.6×106CFU/g和6.3×106/g,與其他各處理組均存在顯著差異.

2.10 復(fù)合土壤改良劑與土壤不同配比施用對(duì)植物生長的影響

表4 不同配比土壤改良劑對(duì)植物生長的影響

播種25 d后采樣,分別測定小青菜的鮮重、根長和苗長(表4).結(jié)果表明,復(fù)合土壤改良劑對(duì)小青菜的鮮重、根長和苗長有促進(jìn)作用,復(fù)合土壤改良劑與土壤1∶1(質(zhì)量比)配比施用對(duì)小青菜生長的作用效果顯著優(yōu)于對(duì)照組(P<0.05),鮮重、根長和苗長分別增加57.14%、64.88%和54.19%.

綜合2.8、2.9和2.10節(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,復(fù)合土壤改良劑與土壤按1∶1(質(zhì)量比)配比混合施用效果最佳,對(duì)土壤酶活性、土壤微生物數(shù)量和小青菜的生長都具有積極作用.

3 結(jié) 論

篩選得到的毒死蜱降解菌菌株CD7,其降解土壤中毒死蜱的效率為66.43%,雖單獨(dú)降解毒死蜱能力相較其他菌株略有不足[3],但與其他生物聯(lián)合作用較好.將其與植物根際促生菌JD37聯(lián)合后,不僅能夠降解土壤中殘留的毒死蜱,促進(jìn)作物的生長,還能增加部分土壤酶活性、維持土壤中微生物數(shù)量,從而改善土壤品質(zhì);而與小青菜聯(lián)合作用后也能降解毒死蜱,但降解能力有所下降,這很可能是因?yàn)槭艿叫∏嗖烁H分泌物的影響.

在制備土壤改良劑的過程中,采用不同載體材料研究了載體對(duì)復(fù)配菌株貯藏時(shí)間的影響.發(fā)現(xiàn)復(fù)配菌株在蚯蚓糞中貯藏5 d后活菌數(shù)量急劇下降,這是因?yàn)轵球炯S顆粒大且多孔導(dǎo)致細(xì)菌吸附在其中,不易洗出.

通過探究CD7和JD37的最佳配比、不同載體對(duì)聯(lián)合菌株的吸附能力和菌株貯藏時(shí)間的影響,選擇將CD7和JD37按1∶1的體積比吸附于蚯蚓糞中制備出復(fù)合菌種改良劑;通過盆栽實(shí)驗(yàn)得出將土壤與改良劑按質(zhì)量比1∶1使用時(shí)改善土壤品質(zhì)效果最佳,且小青菜的生長情況最好,這為復(fù)合微生物土壤改良劑的實(shí)際應(yīng)用奠定基礎(chǔ).但是,有關(guān)CD7菌株的對(duì)毒死蜱的降解機(jī)制、如何提高其降解效率有待深入研究,有關(guān)保護(hù)劑的選擇、制備條件的優(yōu)化也需要進(jìn)一步的探討.

[1] 鄭偉.中國化肥施用區(qū)域差異及對(duì)糧食生產(chǎn)影響的研究 [D].北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué),2005.

Zheng W.Regional differences of chemical fertilizer application in China and its influence on food production [D].Beijing:China Agricultural University,2005.

[2] 李竹林.農(nóng)藥化肥施用存在的問題及對(duì)策 [J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2014(16):217,226.

LI Z L.Problems and countermeasures of using pesticide and fertilizer [J].Modern Agricultural Sciences and Technology,2014(16):217,226.

[3] 楊麗,趙宇華,張炳欣,等.一株毒死蜱降解細(xì)菌的分離鑒定及其在土壤修復(fù)中的應(yīng)用 [J].微生物學(xué)報(bào),2005,45(6):89-93.

Yang L,Zhao Y H,Zhang B X,et al.Isolation and characterization of a chlorpyrifos degrading bacteria and its biorediation application in the soil [J].Acta Microbiologica Sinica,2005,45(6):89-93.

[4] Rani M S,Lakshmi K V,Devi P S,et al.Isolation and characterization of a chlorpyrifos-degrading bacterium from agricultural soil and its growth response [J].African Journal of Microbiology Research,2008,2(2):26-31.

[5] De-bashanL E,Hernandez J,Bashan Y.The potential contribution of plant growth-promoting bacteria to reduce environmental degradation-A comprehensive evaluation [J].Applied Soil Ecology,2012,61:171-189.

[6] 王靜巖,傅營,王斌.微生物降解農(nóng)藥研究 [J].北京農(nóng)業(yè),2015(8).

Wang J Y,Fu Y,Wang B.Study on microbial degradation of pesticides [J].Beijing Agriculture,2015(8).

[7] 肖明,王雨凈.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn) [M].北京:科學(xué)出版社,2008.

Xiao M,Wang Y J.Microbiology experiments [M].Beijing:Science Press,2008.

[8] 金鑫,冉雪琴,王嘉福.農(nóng)田土壤中毒死蜱降解菌的分離與鑒定 [J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(4):103-106.

Jin X,Ran X,Wang J.Isolation and identification of chlorpyrifos degradation bacteria in soil [J].Guizhou Agricultural Sciences,2010,38(4):103-106.

[9] 王金花,朱魯生,王軍,等.3株真菌對(duì)毒死蜱的降解特性 [J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2005,11(2):211-214.

Wang J,Zhu L,Wang J,et al.Degradation characteristics of three fungi to chlorpyrifos [J].Chinese Journal of Applied & Environmental Biology,2005,11(2):211-214.

[10] 趙萍,亓文靜,王雅,等.兩株有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌的分離鑒定及降解特性 [J].蘭州理工大學(xué)學(xué)報(bào),2010,36(3):86-90.

Zhao P,Qi W J,Wang Y,et al.Isolation and identification of two strains capable of degrading of organophosphorus pesticides and their biodegradation abilities [J].Journal of Lanzhou University of Technology,2010,36(3):86-90.

[11] 謝慧,朱魯生,王軍,等.真菌WZ-1對(duì)有機(jī)磷殺蟲劑毒死蜱的酶促降解 [J].環(huán)境科學(xué),2005,26(6):164-168.

Xie H,Zhu L S,Wang J,et al.Enzymatic degradation of organophosphorus insecticide chlorpyrifos by fungus WZ-I [J].Environmental Science,2005,26(6):164-168.

[12] 關(guān)松蔭.土壤酶及其研究法 [M].北京:農(nóng)業(yè)出版社,1986.

Guan S Y.Method of soil enzyme study [M].Beijing:Agriculture Press,1986.

[13] 王慧捷,宋璟,朱玉兵,等.1株拮抗植物病原真菌的細(xì)菌篩選及其抑菌機(jī)理的初步研究 [J].微生物學(xué)雜志,2010,30(2):7-13.

Wang H J,Song J,Zhu Y B,et al.Screening of an antagonistic bacterial strain against plant pathogenic fungi and its antimicrobial mechanism [J].Journal of Microbiology,2010,30(2):7-13.

[14] Fang R,Lin J,Yao S,et al.Promotion of plant growth,biological control and induced systemic resistance in maize byPseudomonasaurantiacaJD37 [J].Annals of Microbiology,2013,63(3):1177-1185

(責(zé)任編輯：顧浩然)

Screening of chlorpyrifos degrading bacteria CD7 andits combined application with PGPR JD37

Su Cuizhu1, Jiang Qiuyue1,2?, Zhang Li1, Luo Si1, Yang Wenwu1, Sun Shurong1, Xiao Ming1*

(1.Development Center of Plant Germplasm Resources,College of Life and Environmental Sciences, Shanghai Normal University,Shanghai 200234,China; 2.School of Life Sciences,Fudan University,Shanghai 200438,China)

We screened a chlorpyrifos degrading bacteria,Burkholderiasp.CD7.Joint with plant growth-promoting rhizobacteria(PGPR) JD37 to produce a compositesoil amendment,which could restorethe pesticides polluted soil and promote plant growth.Results showed that CD7 and JD37 (at the volume ratio of 1∶1) can promote the growth of plants,and within 25 days degrade about 66.43% chlorpyrifos in the soil.Further research found that under the same conditions of carrier dosage,vermicompost can adsorbed more bacteria than talcum powder;after a month preservation at room temperature,the number of living bacterium still maintained about 4.81×107CFU/g.Carrier and soil,at the mass ratio of 1∶1,could optimally promote plant growth,improve soil enzyme activities and increase the number of microorganisms in soil.

plant growth-promoting rhizobacteria; chlorpyrifos degrading bacteria CD7; soil amendment;screening

2016-10-31

上海市科委重點(diǎn)項(xiàng)目(16391902100)

蘇翠珠(1991-),女,碩士研究生,主要從事土壤有益微生物方面的研究.E-mail:czsu2012@126.com

導(dǎo)師簡介: 肖 明(1961-),男,博士后,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事環(huán)境微生物、分子生物學(xué)以及微生物與植物相互關(guān)系方面的研究.E-mail:xiaom88@shnu.edu.cn

Q 939.96

A

1000-5137(2017)02-0311-08

*通信作者

?并列第一作者: 蔣秋悅設(shè)計(jì)了本研究的主要研究技術(shù)路線及初稿的撰寫；蘇翠珠進(jìn)行了本研究的相關(guān)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容并統(tǒng)計(jì)分析了相關(guān)數(shù)據(jù)，完成了論文的終稿及相關(guān)修改工作.