3種濃度乙醇提取的樟芝多糖對(duì)免疫缺陷小鼠模型免疫功能的調(diào)節(jié)作用研究

孔云 官俏兵 郭麗 李文燕 楊毅

有研究發(fā)現(xiàn)，雪靈芝多糖被證明有免疫增強(qiáng)作用[1-2]。樟芝作為臺(tái)灣地區(qū)獨(dú)有的一種天然多孔真菌，含有豐富的多糖、三萜、腺苷、氨基酸、蛋白質(zhì)類物質(zhì)[3]，其中多糖和三萜含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于靈芝，有著很好的研究價(jià)值和應(yīng)用前景[4-5]。但樟芝多糖在大陸分布較少，對(duì)于其多糖的作用尚未明確，因此筆者以多糖的免疫增強(qiáng)作用為切入點(diǎn)，進(jìn)一步研究其藥理作用，為樟芝多糖的開發(fā)研究提供借鑒，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)小鼠60只，體重（21±5）g，購置于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（浙）2013-0184]，小鼠分籠飼養(yǎng)，每籠 6只，共 10籠。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室溫度為 20～25℃，濕度為（70±5）%，依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物干燥飼料喂養(yǎng)，小鼠活動(dòng)、攝食自由。

1.2 試劑和儀器 固體樟芝總多糖（杭州眾芝康公司，純度85%），環(huán)磷酰胺（浙江海正藥業(yè)），K562細(xì)胞（武漢普諾賽生物技術(shù)有限公司），刀豆蛋白A（ConA，美國Sigma公司），胎牛血清（FBS，美國 Gbico公司），二甲基亞砜（DMSO，美國 Sigma公司），RPMI1640完全培養(yǎng)基（美國Gibco公司），Elisa試劑盒（南京建成生物優(yōu)先公司），CD3-FITC、CD4-PI、CD8-PerCP 單抗（美國 BioLegend公司），酶標(biāo)儀（美國Thermo公司，型號(hào)為Multuskan Go 1510），顯微鏡（Olympusix71，德國徠卡公司），流式細(xì)胞儀（FASCC，美國BD公司）。

1.3 水提醇沉法提取樟芝多糖 本實(shí)驗(yàn)采用已經(jīng)過初步提取和純化的樟芝總多糖，將30g 85%樟芝總多糖溶于100ml熱水，采用Sevag方法脫蛋白5次，提取水層后濃縮至原體積的10%，使用無水乙醇將樟芝多糖水溶液調(diào)節(jié)乙醇濃度為90%，4℃條件下靜置12h，獲得第一部分沉淀記為PW90，以此類推分別獲得70%乙醇沉淀多糖記為PW70、50%乙醇沉淀獲得的多糖記為PW50。采用硫酸-蒽酮法測定總多糖，BCA法測定總蛋白含量。

1.4 模型構(gòu)建和分組 將清潔級(jí)小鼠60只隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、總多糖組、PW90組、PW70組和PW50組，每組10只。除對(duì)照組外，其余5組小鼠按照50mg/kg的劑量，2d/次腹腔注射環(huán)磷酰胺-0.9%氯化鈉溶液（將1g環(huán)磷酰胺溶解于1 000ml的0.9%氯化鈉注射液，配制成1mg/ml的溶液）。而樟芝多糖的4組小鼠除注射環(huán)磷酰胺外，按100mg/（kg·d）的劑量腹腔注射含樟芝多糖的0.9%氯化鈉注射液（將1g樟芝多糖溶解于500ml的0.9%氯化鈉注射液，配制成2mg/ml的溶液）。其中總多糖組配制總多糖-0.9%氯化鈉注射液（2mg/ml），而PW90組、PW70組和PW50組分別使用分級(jí)沉淀的多糖組分配制成2mg/ml的樟芝多糖-0.9%氯化鈉注射液。對(duì)照組和模型組小鼠則每日注射等劑量的0.9%氯化鈉注射液，按照上述方法干預(yù)14d后，斷頸處死小鼠，無菌條件下分離脾臟、胸腺和外周血。

1.5 脾臟、胸腺指數(shù)的計(jì)算 脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量/小鼠的體重；胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量/小鼠體重。

1.6 脾臟提取淋巴細(xì)胞 無菌條件下得到的小鼠脾臟，剔除脂肪、結(jié)締組織后用無菌手術(shù)剪剪成小塊，然后研缽中研磨，加入3ml的0.9%氯化鈉溶液后過濾，將過濾液1 500r/min離心5min，加入3倍體積的紅細(xì)胞裂解液后重新混懸，離心后棄上清液得到沉淀細(xì)胞，用PBS重懸后調(diào)整細(xì)胞密度為2×106/ml。

1.7 淋巴細(xì)胞的增殖指數(shù) 將上述得到的淋巴細(xì)胞按照100μl/孔接種于96孔板，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，加入0.5mg/ml的ConA培養(yǎng)液1μl，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h，利用CCK-試劑盒檢測450nm處吸光度（OD）。淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)=實(shí)驗(yàn)組OD/對(duì)照組OD。

1.8 NK細(xì)胞的殺傷活性檢測 將上述淋巴細(xì)胞200μl接種于96孔板，按照效-靶比為25∶1的比例加入等細(xì)胞數(shù)量的K562細(xì)胞8μl，設(shè)置效應(yīng)細(xì)胞組、靶細(xì)胞組和對(duì)照組，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48h后，以CCK-8法檢測OD值，NK細(xì)胞的殺傷活性=[1-（效-靶細(xì)胞OD-效應(yīng)細(xì)胞 OD）/靶細(xì)胞 OD]×100%。

1.9 T淋巴細(xì)胞亞群的檢測 上述淋巴細(xì)胞吸取100μl加入流式細(xì)胞測試管，分別加入CD3、CD4、CD8抗體各1μl，混勻后避光 20min，PBS洗后離心 2次，用 PBS重懸后上機(jī)檢測。

1.10 血清IL-2、IL-6、TNF-α 檢測 小鼠斷頸處死后，取小鼠外周血2ml，離心后取血清，按照ELISA試劑盒說明書操作。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較經(jīng)Bonferoni校正后采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乙醇沉淀多糖的純度和蛋白含量結(jié)果 PW90、PW70、PW50的多糖含量分別為92.3%、89.8%和91.6%，蛋白含量分別為2.17、1.86、1.95mg/g。多糖含量均高于總多糖的85%，純度較高。

2.2 各組小鼠胸腺、脾臟指數(shù)的比較 模型組小鼠胸腺、脾臟指數(shù)均低于對(duì)照組（均P＜0.05），3種樟芝多糖干預(yù)后可以不同程度提高胸腺、脾臟指數(shù)，且PW90組干預(yù)后胸腺、脾臟指數(shù)高于PW70組和PW50組（均P＜0.05）；3種多糖的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均高于總多糖（均P＜0.05），見表 1。

表1 各組小鼠胸腺、脾臟指數(shù)的比較（mg/g）

2.3 各組小鼠淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)及NK細(xì)胞殺傷活性的比較 模型組小鼠的淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)低于對(duì)照組（P＜0.05），而樟芝多糖干預(yù)后顯著提高了淋巴細(xì)胞的增殖指數(shù)。PW90組干預(yù)后可以顯著提高NK細(xì)胞的殺傷活性，與PW70組和PW50組、總多糖組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表2。

表2 各組小鼠淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)和NK細(xì)胞殺傷活性的比較

2.4 各組小鼠淋巴細(xì)胞亞群的比較 模型組CD3+、CD3+CD4+和CD3+CD8+的比例均顯著低于對(duì)照組（均P＜0.05），而樟芝多糖可以顯著提高3者的比例，且PW90組優(yōu)于PW70組和PW50組、總多糖組（均P＜0.05），見表 3。

表3 各組小鼠淋巴細(xì)胞亞群的比較

2.5 各組小鼠IL-2、IL-6、TNF-α的比較 模型組小鼠的IL-2、IL-6和TNF-α的表達(dá)均顯著低于對(duì)照組（均P＜0.05），而樟芝多糖可以顯著提高小鼠血清IL-2、IL-6和TNF-α的表達(dá)，與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），且PW90組優(yōu)于PW70組和PW50組、總多糖組（P＜0.05），見表 4。

表4 各組小鼠IL-2、IL-6、TNF-α的比較

3 討論

免疫系統(tǒng)是人抵御細(xì)菌、病毒感染的重要防線，而自身免疫功能的降低或者亢進(jìn)都會(huì)引起一系列疾病的發(fā)生，比如類風(fēng)濕性疾病、細(xì)菌感染、病毒感染等，臨床中腫瘤的輔助性化療亦會(huì)引起不同程度的免疫抑制，所以免疫增強(qiáng)藥物的問世和應(yīng)用就顯得十分的必要[6-7]，環(huán)磷酰胺是一種常用細(xì)胞毒性藥物，臨床應(yīng)用于各種惡性腫瘤的化療和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療，也常被用于免疫抑制模型的構(gòu)建[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)磷酰胺可以全面抑制小鼠的細(xì)胞免疫和體液免疫，這一模型可以廣泛的應(yīng)用于免疫抑制或缺陷疾病病理和藥物的研究。

多糖作為一個(gè)大家族的天然藥物，有著多樣的生理活性和作用，目前黃芪多糖、靈芝多糖和香菇多糖已經(jīng)被開發(fā)成藥物應(yīng)用于免疫性疾病的輔助治療，且獲得了良好的效果，而樟芝作為大陸不常見的多孔真菌，與靈芝、云芝等有著很大的相似性，且天然的樟芝多糖含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于靈芝，有著巨大的開發(fā)價(jià)值。以往有文獻(xiàn)報(bào)道樟芝胞內(nèi)和胞外多糖對(duì)于免疫抑制小鼠有著一定的免疫調(diào)節(jié)功能[9]，但是對(duì)于其確切的有效多糖成分未見說明，且多糖未經(jīng)過除蛋白等純化工藝，不能明確其有效的藥理成分。鑒于此，本研究利用水提醇沉法對(duì)樟芝子實(shí)體的多糖進(jìn)行提取純化獲得了3種多糖，分別為90%、70%、50%乙醇沉淀所得，通過多糖、蛋白含量檢測，得到的3種多糖純度較高，且糖蛋白含量較低。以免疫小鼠模型作為干預(yù)對(duì)象，結(jié)果顯示3種多糖對(duì)于環(huán)磷酰胺構(gòu)建免疫缺陷性的小鼠均有一定免疫增強(qiáng)作用。首先3種多糖均可以提高免疫抑制小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，胸腺是產(chǎn)生T淋巴細(xì)胞的主要器官，還可以分泌胸腺素，所以可以直接反映小鼠機(jī)體細(xì)胞免疫的強(qiáng)弱，而脾臟中有豐富的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，2種指數(shù)結(jié)合可以一定程度上反映免疫功能的強(qiáng)弱[10]，通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)，PW90多糖對(duì)于2種指數(shù)提高效果較為明顯。在淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，3種多糖均可以促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖，也可以增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷能力，這證明了樟芝多糖可以改善NK細(xì)胞的殺傷作用，對(duì)機(jī)體的細(xì)胞免疫有著很好的增強(qiáng)作用，淋巴細(xì)胞亞群的變化也很好地印證了上述細(xì)胞免疫增強(qiáng)的結(jié)果[11]。在體液免疫方面可以提高血清中IL-2、IL-6和TNF-α的表達(dá)，IL-2是T細(xì)胞生長因子，活化Th1細(xì)胞，促進(jìn)CTL的增殖，對(duì)機(jī)體的抗體反應(yīng)有著重要的作用，IL-6促進(jìn)T細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生淋巴因子，增強(qiáng)NK細(xì)胞的功能[12]。樟芝多糖對(duì)于3者的促表達(dá)作用，提高了機(jī)體體液免疫功能，所以樟芝多糖對(duì)于免疫抑制小鼠的細(xì)胞免疫和體液免疫都有很好的調(diào)節(jié)作用，且PW90效果優(yōu)于其他2種多糖和總多糖。

綜上所述，本研究分離獲得了3種樟芝多糖均可以提高免疫抑制小鼠的免疫功能，且對(duì)于細(xì)胞免疫和體液免疫均有增強(qiáng)作用，其中90%乙醇沉淀獲得的多糖效果最佳，但是其確切的組成成分還有待進(jìn)一步研究。

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