HPLC法測(cè)定不同采收期云南甜柿葉中三種黃酮的含量

梅為云+李娜+劉錄+陳繼坤+黃靳翔+高汪榮+周志宏

【摘要】利用回流提取法對(duì)不同采收期的云南甜柿葉進(jìn)行預(yù)處理，采用高效液相色譜法測(cè)定樣品中山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-β-D-半乳糖苷和槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷的含量。提取條件為提取溶劑50%乙醇，液固比30∶1，提取3次，提取時(shí)間90 min；液相色譜條件為采用ZORBAX Eclipse XDB-C18 （250 mm×46 mm， 5μm）色譜柱分離，甲醇-04%磷酸溶液為洗脫系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)265 nm；三種黃酮的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于1%，平均回收率均在99%以上。該方法具有較好的分離效果和較高的穩(wěn)定性，適用于用來分析不同采收期的云南甜柿葉中上述三種黃酮的含量，測(cè)定結(jié)果表明三種黃酮在葉中積累具有規(guī)律性，隨柿果實(shí)成長(zhǎng)不斷積累，并且果實(shí)成熟時(shí)達(dá)到最高。

【關(guān)鍵詞】甜柿；高效液相色譜法； 山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷；山奈酚-3-O-β-D-半乳糖苷；槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷

【中圖分類號(hào)】R2842【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2017）08-0020-04

Abstract：A HPLC method was developed for determinating the contents of Kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside， Kaempferol-3-O-β-D-galactopyranoside， and Quercetin-3-O-β-D-glucopyranoside in the leaves of Yunnan Diospyros kaki in different harvest periods. The HPLC elution was carried out using methanol-04% phosphate system at a flow rate of 10 mL/min， the injection volume was 10 μL， and the detector wavelength was set at 265 nm. The RSD values of the three flavonoids were all less than 1% and the average recoveries were all above 99%. This method showed good separation effect and high stability， and could be used for determining the contents of the three flavonoids in the leaves of Yunnan Diospyros kaki in different harvest periods. The result showed that the accumulation of them in leaves of Yunnan Diospyros kaki exhibited regularity， and the contents were increasing along with fruit growing.

Keywords： Diospyroskaki；HPLC；Kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside；Kaempferol-3-O-β-D-galactopyranoside；Quercetin-3-O-β-D-glucopyranoside.

柿子為柿樹科（Ebenaceae）柿樹屬（Diospyros）植物柿Diospyros kaki的果實(shí)，是我國(guó)五大水果（葡萄、柑橘、香蕉、蘋果、柿子）之一[1]。近年來在各地均有大面積種植，市場(chǎng)上也出現(xiàn)了多種資源再利用的深加工產(chǎn)品。柿葉是大規(guī)模種植后產(chǎn)生的可持續(xù)利用資源，因其富含多種活性成分和營(yíng)養(yǎng)成分而倍受關(guān)注 [2-4] 。云南是甜柿水果規(guī)?；N植大省，甜柿葉資源的綜合利用尚處于起步階段，黃酮類成分是其主要功效成分[5]，目前對(duì)柿葉中總黃酮的提取工藝研究[6-8]，以及黃酮含量的測(cè)定[9-11]的文獻(xiàn)較多。但同時(shí)檢測(cè)柿葉中3種常見功效黃酮山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷（1） [12]、山奈酚-3-O-β-D-半乳糖苷 （2） [13]和槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷 （3） [14]尚屬首次，具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。本實(shí)驗(yàn)建立了一種HPLC色譜檢測(cè)方法，用于檢測(cè)不同采收期新鮮柿葉中三種黃酮類物質(zhì)的含量，并分析其在葉中積累的規(guī)律性，為合理利用柿葉提供科學(xué)依據(jù)。

1儀器與材料

11儀器島津LC-2010AHT高效液相色譜儀（日本島津公司）；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；DHG-9240A型恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）；SB-2000 EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛郎儀器有限公司）；AL204型分析天平（梅特勒-托利多上海有限公司）。

12材料不同采收期的新鮮柿葉均有昆明石林綠汀甜柿產(chǎn)品開發(fā)有限公司提供；山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷 （1）、山奈酚-3-O-β-D-半乳糖苷 （2）和槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷 （3） （純度均≥999%）為實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)包括核磁共振、質(zhì)譜等多種波譜學(xué)鑒定。甲醇（色譜純）、乙醇（分析純）購(gòu)于天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

2方法

21樣品溶液的提取黃酮多為極性成分，易溶于醇和水中，為便于工業(yè)化生產(chǎn)，本工藝采用常規(guī)的乙醇水為溶劑進(jìn)行回流提取。設(shè)計(jì)不同溶劑比例，溶劑倍量（液固比）、提取時(shí)間、提取次數(shù)四因素三水平L9（34）正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行工藝參數(shù)優(yōu)化 （見因素水平表1），考察指標(biāo)為提取物中1～3質(zhì)量之和（K1），據(jù)此得到最佳提取條件，提取溶劑為50%乙醇，液固比為30∶1，一次提取時(shí)間為90min，提取次數(shù)為3次。詳見表1。

22對(duì)照品溶液的配制分別取山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷（1）、山奈酚-3-O-β-D-半乳糖苷（2）和槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷（3），置于干燥器中于室溫（25℃）下干燥12 h，精密稱定各化合物，用甲醇配制成單品對(duì)照品溶液和混合對(duì)照品（質(zhì)量比1∶1∶1）溶液。

23樣品溶液的配制將不同采收期的新鮮柿葉自然曬干后于50℃下烘干至恒重，粉碎后過60目篩，稱取10000g，按照“21”中的提取方式，將三次過濾收集的濾液合并，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在70℃下減壓濃縮，甲醇定容至25mL，經(jīng)045μm膜過濾，待測(cè)。

24色譜條件色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18 （250 mm×46 mm，5 μm）；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：265nm；柱溫30℃；甲醇-04%磷酸溶液為洗脫系統(tǒng)。見表2。

3結(jié)果與分析

31單因素分析

311乙醇濃度的選擇選取40%～100%的乙醇以10%為1個(gè)梯度，來考察3種黃酮的得率。發(fā)現(xiàn)用50%乙醇提取時(shí)，得率最高，故提取溶劑選擇50%的乙醇水溶液。

312液固比的選擇精密稱取等量的干燥柿葉的樣品，分別按照液固比（體積：質(zhì)量）為20∶1、30∶1、40∶1條件下加入50%乙醇水，各提取30min，經(jīng)抽濾、濃縮、定容，取適量過045μm濾膜，進(jìn)行HPLC測(cè)定，結(jié)果表明液固比在30∶1時(shí)得率較大，綜合考慮選取液固比為30∶1。

313提取時(shí)間的選擇精密稱取等量的干燥柿葉樣品，按液固比30∶1用50%乙醇水提取，提取時(shí)間分別為30、60、90 min，經(jīng)抽濾、濃縮、定容，取適量過045 μm濾膜，進(jìn)行HPLC測(cè)定。結(jié)果表明3提取時(shí)間為90min時(shí)得率較高，故提取時(shí)間選擇為90min為宜。

314提取次數(shù)的選擇按照311、312、313中優(yōu)選的方法，根據(jù)以上思路最后確定提取次數(shù)3次為宜；4次時(shí)，得率與3次基本沒有變化。

32正交實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取影響三種黃酮得率的乙醇濃度，液固比，提取時(shí)間，提取次數(shù)四因素，設(shè)計(jì)四因素三水平的L9（34）正交實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行工藝參數(shù)優(yōu)化，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析見表3。

由表3可見，以K1為指標(biāo)時(shí)，適宜的提取工藝為A2B1C3D3，與正交實(shí)驗(yàn)分析所得最佳工藝條件一致，所以選擇A2B1C3D3為提取柿葉中黃酮的適宜提取工藝條件，即提取溶劑為50%乙醇，液固比為30∶1，每次提取時(shí)間為90min，提取次數(shù)為3次。

33色譜分離參數(shù)的確定

331檢測(cè)波長(zhǎng)的確定采用雙光束紫外可見分光光度計(jì)對(duì)化合物1～3進(jìn)行掃描，1～3均在265nm附近有最大吸收。故選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為265nm進(jìn)行檢測(cè)。

332流動(dòng)相的確定為了獲得較好的分離度，參照文獻(xiàn)的報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)選取了6組不同的流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行比較：乙腈-水，乙腈-1‰磷酸水溶液，乙腈-04‰磷酸水溶液，甲醇-水，甲醇-1‰磷酸水溶液，甲醇-04‰磷酸水溶液。分別對(duì)不同采收期的柿葉中三種黃酮的含量進(jìn)行測(cè)定，通過比較各化合物的分離度、保留時(shí)間和峰形，最終選用甲醇-04‰磷酸水溶液系統(tǒng)。見表2。

34對(duì)照品和樣品溶液的色譜分離圖取供試樣品溶液適量，參照上述液相方法進(jìn)行HPLC分析，記錄譜圖1。供試品中三種黃酮的色譜峰分離度及峰形均較好，符合高效液相色譜定量分析的一般要求?；衔?～3的保留時(shí)間分別為4714、3639、2448 min，均與單獨(dú)分析時(shí)保留時(shí)間一致。

35線性關(guān)系、定量限及檢出限的考察精密稱取化合物1～3的質(zhì)量，分別配制成濃度為1370 μg/mL，613 μg/mL和1239 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，用甲醇對(duì)其進(jìn)行不同倍數(shù)的稀釋，經(jīng)HPLC分析，以對(duì)照品的峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表4所示。三種黃酮在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0999以上。

取各單品對(duì)照品溶液，用甲醇稀釋后進(jìn)行HPLC分析，調(diào)整溶液濃度得出信噪比為3和10時(shí)，即可得樣品的最低檢出限和定量限，結(jié)果見表4。

36精密度及穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取適量已經(jīng)配制好的混合對(duì)照品溶液，過濾后進(jìn)行HPLC分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，化合物1～3三種對(duì)照品相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為026%、059%和019%，表明儀器精密度良好。

37重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取同一供試品溶液，平行測(cè)定6次，考察HPLC測(cè)定的重復(fù)性，三種黃酮的RSD分別為095%，089%和078%，符合要求。

38穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取同一供試品溶液，據(jù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)所得條件，于0、2、4、8、12、18、24h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果表明，三種黃酮的RSD分別為084%、080%和068%，符合要求。說明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

39加樣回收率實(shí)驗(yàn)取已知含量的供試品9份，精密加入1～3對(duì)照品，按實(shí)驗(yàn)所得方法測(cè)定，結(jié)果表明，該分析方法回收率9768～10033%，平均回收率9887%，RSD值為100%；9208～10156%，平均回收率9672%，RSD值為331%；9136%～10011%，平均回收率9518%，RSD值為320%。故該方法可以滿足分析測(cè)試的要求。

310不同采收期的柿葉中三種黃酮含量的測(cè)定按照前面的方法，對(duì)不同采收期的甜柿葉13批樣品進(jìn)行三種黃酮含量的測(cè)定，結(jié)果見表5。從表5中可以看出，9月、10月采收的柿葉，三個(gè)黃酮的含量均高。

4討論

通過對(duì)云南甜柿葉中黃酮提取工藝的研究，適宜的提取工藝條件：提取溶劑50%乙醇，液固比30∶1，提取3次，提取時(shí)間90min。云南甜柿葉中三種黃酮1～3高效液相色譜分析條件：ZORBAX Eclipse XDB-C18 （250 mm×46 mm， 5 μm）色譜柱分離，甲醇-04%磷酸溶液為洗脫系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)265 nm；三種黃酮的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于1%，平均回收率均在99%以上。

通過對(duì)不同采收時(shí)間的甜柿葉進(jìn)行三種黃酮成分的測(cè)定表明，三種黃酮在葉中的積累具有規(guī)律性：隨著柿葉采收不斷積累，至9月、10月份達(dá)到最高值，隨后開始降低，即隨著果實(shí)成長(zhǎng)不斷累積，果實(shí)成熟時(shí)達(dá)到最高。因此，對(duì)柿葉黃酮的利用可以在果實(shí)成熟后采摘同時(shí)進(jìn)行，一方面不影響果實(shí)采收，另一方面提高柿葉的綜合利用效率。參考文獻(xiàn)

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（收稿日期：2017-02-23編輯：梁志慶）