微生物脂肪酶的性質及應用研究

楊 媛，張 劍

(山西大學化學化工學院，山西太原，030006)

微生物脂肪酶的性質及應用研究

楊 媛，張 劍

(山西大學化學化工學院，山西太原，030006)

脂肪酶是重要的工業(yè)酶制劑之一，微生物是其主要來源。脂肪酶廣泛應用于醫(yī)藥領域、食品工業(yè)、洗滌劑工業(yè)以及相關的領域。對脂肪酶的種類以及發(fā)酵過程中所涉及的基因工程菌的構建、優(yōu)化發(fā)酵工藝、分離提純等進行了綜述，并結合脂肪酶的分子結構，對脂肪酶的性質和應用方面進行了總結，為今后關于脂肪酶的進一步研究提供了便利。

脂肪酶；微生物；洗滌劑；發(fā)酵工藝

脂肪酶廣泛存在于動植物和微生物中。其最早是從動物中發(fā)現(xiàn)的，1834年發(fā)現(xiàn)了兔胰脂肪酶，1864年發(fā)現(xiàn)了豬胰脂肪酶，1871年在植物種子中發(fā)現(xiàn)了脂肪酶。直到1901年才發(fā)現(xiàn)微生物脂肪酶［1-3］。微生物中細菌、真菌和酵母中的脂肪酶含量較為豐富。微生物種類多、繁殖快、易發(fā)生遺傳變異，具有比動植物更廣的作用pH、作用溫度范圍以及底物專一性，其可以在不需要輔酶的條件下，催化酯類化合物的水解、醇解、酯化、轉酯化及酯類的逆向合成反應等，催化條件溫和、能耗低、副產物少，具有高效、高選擇性、環(huán)境友好等特點［4］，改變了傳統(tǒng)的酯化或轉酯化反應所需要的高溫、強酸、強堿等相對苛刻的條件。因此，微生物脂肪酶是工業(yè)用脂肪酶的重要來源。

1 微生物脂肪酶的種類

產生脂肪酶的微生物種類很多，迄今己報道的有65個屬［5］，其中細菌28個屬，酵母菌10個屬，放線菌4個屬，其他真菌23個屬。目前，脂肪酶產生菌中得到深入研究的主要集中在根霉［6］、曲霉［7-9］、青霉［10-11］、毛霉［12］、假單胞菌［13］等具有工業(yè)應用價值的菌種以及與醫(yī)學相關的金黃色葡萄球菌、鉤端螺旋體、粉刺狀桿菌等。

2 微生物脂肪酶的發(fā)酵

近20年來，微生物脂肪酶發(fā)酵研究［14-15］主要集中在高產菌株的篩選、常規(guī)誘變育種、基因工程菌的構建、發(fā)酵工藝條件優(yōu)化、發(fā)酵工藝放大和酶的分離純化等方面。

2.1 高產菌株的篩選

篩選脂肪酶高產菌［16-18］的方法常見的是采用含甘油三酯瓊脂平板。吳慧浩、陳強等人［17］在油脂培養(yǎng)基平板上進行培養(yǎng)初篩，在經(jīng)過培養(yǎng)后若培養(yǎng)基呈紅色（如圖1）,表明該菌株能產生脂肪酶。之后用聚乙烯醇選擇性培養(yǎng)基挑選菌株中產酶能力較高的菌株，利用透明光圈和菌落直徑比的大小能很清晰地了解菌株的產酶能力，直徑比越大表示其產酶能力越高（如圖2）。HaiKuan WANG等［19］研究4種產脂肪酶的不同菌株在維多利亞藍瓊脂平板上進行篩選，結果如圖3所示，圖3中，2是從洋蔥伯克霍爾德菌分離的lp08脂肪酶，1、3和4是其他菌株脂肪酶，A是在25℃，pH=8的條件下各菌株的反應，B是在25℃，pH=9條件下各菌株的反應，C是在35℃，pH=9條件下各菌株的反應。從圖3中得出菌株lp08在25℃，pH=9條件下有最大的酶活性。

圖1 產脂肪酶菌株初篩結果［17］

圖2 產脂肪酶菌株復篩結果［17］

圖3 4種不同菌株產的脂肪酶在維多利亞藍瓊脂平板上形成的環(huán)的大小［19］

2.2 常規(guī)誘變育種

目前，脂肪酶菌株誘變育種中，物理誘變劑是以紫外線為主，紫外光譜的作用光譜正好與細胞內核酸的吸收光譜相一致，因此，在紫外光作用下能使DNA鏈斷裂、DNA分子內和分子間發(fā)生交聯(lián)形成嘧啶二聚體，從而，導致菌體的遺傳性狀發(fā)生改變。譚珍連、梁靜娟等人［20］以白地霉GXU08為出發(fā)菌，對其進行原生質體紫外誘變選育，其結果：篩選得到6株脂肪酶活力比出發(fā)菌株GXU08高的突變菌株，其中，菌株4-39的酶活比GXU08提高了63.2%。突變株經(jīng)9次傳代，3次搖瓶復篩，其脂肪酶的酶活性保持穩(wěn)定，為今后進一步研究不同的育種方法進一步提高脂肪酶的產量打下了基礎?；瘜W誘變劑常用的有亞硝酸、亞硝酸胍、硫酸二乙酯等，例如亞硝酸主要作用于DNA分子的嘌呤堿基。呂熹、王剛等人［21］以蠟狀芽孢桿菌SW06為出發(fā)菌株，通過紫外誘變篩選得到突變株BZ-3，其產脂肪酶的活力較SW06高2.49倍。再對BZ-3進行亞硝酸鈉誘變，得到突變株BF-3，產脂肪酶活力較SW06提高4.11倍。將BF-3傳到第5代，其產酶較穩(wěn)定。一般可以通過誘變育種將脂肪酶的產量提高1～10倍。

2.3 脂肪酶基因工程菌的構建

通常情況下，常規(guī)育種方法很難滿足工業(yè)化生產的需要，通過基因工程［22-23］手段克隆相應的脂肪酶基因，然后在異源宿主菌中實現(xiàn)大量表達，從而大幅提高脂肪酶的產量。1988年丹麥Novo公司成功將柔毛腐質霉的堿性脂肪酶基因克隆導入適合發(fā)酵生產的米曲霉工程菌株中，脂肪酶產量提高了近1000倍，實現(xiàn)了年產幾百噸的工業(yè)化生產［24］。這是第一個運用基因工程技術生產脂肪酶從實驗室走向市場的成功范例。Ma等采用強啟動子大量表達枯草芽孢桿菌（B.subtilis）脂肪酶，酶產量較原始菌株提高了100倍［25］。

2.4 脂肪酶培養(yǎng)基

工業(yè)發(fā)酵過程中，設計一個發(fā)酵培養(yǎng)基是至關重要的。培養(yǎng)基一般由碳源、氮源及無機鹽等組成。速效碳源有利于細菌脂肪酶的形成，黃家?guī)X［26］研究發(fā)現(xiàn)：細菌發(fā)酵產脂肪酶的最佳碳源和最佳氮源分別是蔗糖和酵母粉。有報道指出：當培養(yǎng)基中含有單糖、雙糖和甘油會抑制脂肪酶產生［27］。一般認為，復合氮源對微生物生長及產酶效果較好［28］。Rashid的研究表明：添加EDTA于反應體系中能完全抑制嗜冷假單胞菌KB700A所產的低溫脂肪酶的活力，而添加Ca2+能顯著提高酶活［29］。培養(yǎng)基的組成影響產品濃度、產量和效率；在商業(yè)化生產中，培養(yǎng)基的成本明顯影響總生產成本。優(yōu)化培養(yǎng)基涉及大量的實驗研究，是一個耗費時間精力的過程。

2.5 發(fā)酵工藝優(yōu)化

影響發(fā)酵過程的因素有很多，主要包括培養(yǎng)基組成、接種量、種齡、培養(yǎng)溫度、轉速、裝液量、發(fā)酵周期、溶氧、pH值和通氣條件等，這些因素往往又不是獨立影響發(fā)酵過程的，常常是交互作用。除傳統(tǒng)的單因子法、正交設計法［30］在生物過程優(yōu)化中得到廣泛應用外，響應面法［31］在發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化及過程控制中逐步得到推廣應用，并日益顯示出優(yōu)越性。張蕾等人［32］通過單因素實驗、Plackett-Burrman設計及響應面法對芽孢桿菌T3-4的產脂肪酶條件進行優(yōu)化。確定最適C 、N 源分別為麥芽糖、蛋白胨+硫酸銨，碳氮比為1:3。其最適產酶條件為：七水硫酸鎂0.05%，蓖麻油1.5%，蛋白胨0.75%，磷酸氫二鉀0.1%，麥芽糖0.5%，硫酸銨0.3%，pH6.5 ，接種量10%。在此條件下，發(fā)酵脂肪酶活力可達 805.836 U／mL 。優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成搖瓶發(fā)酵酶活力與初始相比，約提高24.79倍 。

2.6 高密度發(fā)酵［33］

高效的表達手段是獲得足夠量目的產物的關鍵。畢赤酵母［35-36］(Pichia pastoris)能在廉價的培養(yǎng)基上生長至較高的細胞密度而被廣泛用于高密度發(fā)酵。由于甲醇能夠誘導畢赤酵母表達載體中醇氧化酶啟動子高效表達，柯鋒［34］對含有GCL B基因的重組畢赤酵母(Pichia pastoris)甲醇利用正型（Mut+）和甲醇利用慢型（Muts）工程菌進行研究發(fā)現(xiàn)：通過Mut+菌株的搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化得出其最佳產酶條件的甲醇添加量為1%，而后進行10L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵產酶條件優(yōu)化，酶活生產率為30.69U/(mL·h)；通過Muts菌株的搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化得出其最佳產酶條件的甲醇添加量為0.6%，10L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵后，酶活生產率為27.69U/(mL·h)。

2.6 酶的分離提純［37］

酶的分離純化一般包括3個基本步驟：即抽提、純化、結晶或制劑。首先，將所需的酶從原料中引入溶液，此時不可避免地夾帶著一些雜質。然后，再將此酶從溶液中選擇性地分離出來，或者從此溶液中選擇性地除去雜質。再其后，制成純化的酶制劑。

3 脂肪酶的分子結構

研究表明，多數(shù)脂肪酶是一種糖蛋白，其糖基部分占分子量的2%～15%，以甘露糖為主，整個分子由親水部分和疏水部分組成，活性中心靠近分子的疏水端；來源不同的脂肪酶，其氨基酸組成數(shù)目從270～641不等，從已報道的文獻來看，相對分子質量為16～200kD［38-39］。目前，脂肪酶蛋白分子的3D結構（見圖4）已經(jīng)得到初步的闡明，大多脂肪酶都具有水解酶折疊的結構特征，即α螺旋和β折疊（見圖5）［40］。典型的α/β水解酶折疊為一個八鏈的平行α/β結構。該結構包含一條反平行于其他鏈的β2。第一個和最后一個螺旋αA和αF位于折疊片的一面,其他的螺旋位于另一面。α/β折疊結構能夠為酶的活性位點提供一個穩(wěn)定的支撐結構。

雖然來源于不同微生物的脂肪酶在分子量、氨基酸序列、底物特異性及其他理化性質上存在較大的差異，但是它們都具有相似的α/β水解酶折疊。人們已經(jīng)利用X-衍射等手段和定向修飾等技術確定了組成脂肪酶活性中心的三元組(triad)結構。脂肪酶的催化活性中心是由絲氨酸（Ser）、 組氨酸（His）、 天冬氨酸（Asp）組成的催化三聯(lián)體結構［41］。

圖4 脂肪酶的3D結構［40］

圖5 α/β水解酶折疊圖解［40］

［40］

4 脂肪酶的特性［42-43］

4.1 催化特性

脂肪酶不同活性的發(fā)揮依賴于反應體系的特點，在油水界面促進酯水解，而在有機相中可以酶促合成和酯交換（圖6）。脂肪酶的催化特性在于：在油水界面上其催化活力最大，溶于水的酶作用于不溶于水的底物，反應是在兩個彼此分離的完全不同的相界面上進行［44］。這是脂肪酶區(qū)別于酯酶的一個特征。酯酶（EC3.1.1.1）作用的底物是水溶性的，并且其最適底物是由短鏈脂肪酸（≤C8）形成的酯［45］。

圖6 油脂酯交換反應過程中脂肪酶在油水界面被活化的示意圖［45］

4.2 底物特異性

不同來源的脂肪酶對底物油脂中脂肪酸的鏈長、不飽和度及不飽和脂肪酸的雙鍵位置表現(xiàn)出不同的脂肪酸特異性［46］。例如圓弧青霉脂肪酶對短鏈(C8以下)脂肪酸形成的甘油三油酸酯有特異性，黑曲霉脂肪酶對C2-C18范圍的脂肪酸均可水解，根霉和白地霉脂肪酶對中等鏈長(C8-C12)脂肪酸有強烈特異性。玉米、蓖麻子、油菜籽等植物種子的脂肪酶分別對三癸酸和三亞麻酸甘油酯、三蓖麻醇酸甘油酯、廿二碳酸甘油酯有很高的水解活力.豬胰脂肪酶對短鏈酸(特別是三丁酸甘油酯)水解特異性高。

4.3 位置特異性［46］

大部分脂肪酶作用于三脂酰甘油的初級位（1 位或3 位）酯鍵。研究發(fā)現(xiàn):豬胰脂肪酶僅水解1位和3位酯鍵；Noma用放射性標記法研究蓖麻子脂肪酶特異性發(fā)現(xiàn)：其對1或3和2位酯鍵水解速度相同；Okumura研究了4種微生物脂肪酶水解甘油三油酸酯的位置特異性，結果如圖7所示：黑曲霉和根霉脂肪酶僅催化1或3位酯鍵水解，對2位酯鍵無作用；白地霉和圓弧青酶脂肪酶無位置特異性，能水解甘油三酯的所有酯鍵。

圖7 四種微生物脂肪酶水解甘油三酯機制［46］

來源于卡門柏青霉 U-150 和米曲霉的脂肪酶存在一類較特殊的脂肪酶，它僅作用于單脂?；蚨８视停鴮θ８视屯耆黄鸫呋饔?，與三脂酰甘油脂肪酶一起使用時，能協(xié)助或加速三脂酰甘油的徹底水解，所以被稱為單-雙脂酰甘油脂肪酶［47］。

4.4 立體特異性

酶作用的底物應具有特定的立體結構才能被催化。脂肪酶對三脂酰甘油立體對應結構1 位和3位具有選擇性水解能力，并且能夠以不同的反應速率選擇性催化兩種對映體。Akesson 等發(fā)現(xiàn)：來源于熒光假單胞菌脂肪酶水解2 位和3 位酯鍵的二?；视捅人馑膶w速度快得多。因此，可利用脂肪酶這種立體選擇性進行動力學拆分得到高產率的光學活性產物［48］。

5 脂肪酶的應用

5.1 在醫(yī)藥中的應用

脂肪酶是脂肪代謝最基本的酶，它的缺乏必將引發(fā)嚴重的健康問題。脂肪酶的外部調節(jié)可以幫助消化，此外，脂肪酶還是一種重要的中間體標記物或藥物靶［49］。作為診斷工具，脂肪酶的活性水平和血液中脂肪酶的水平可分別用于心臟疾病和胰臟疾病的診斷和預測，脂肪酶還用于消化不良、腸胃功能紊亂和惡性腫瘤等的治療。

5.2 在食品中的應用

國內外大量的研究表明:sn-1，3位專一性脂肪酶適用于生產結構脂質、母乳脂肪替代品、類可可脂和甘油二酯等［50-51］。利用脂肪酶作用反應后,釋放出鏈較短的脂肪酸能增加和改進食品的風味和香味，特別是奶油和奶酪的風味在人造黃油、點心和冷糕點等的制作中是不可缺少的；利用脂肪酶催化的醇解和醋(酯)化反應生產各種香精醋(酯)作調料劑；用有專一性的微生物脂肪酶，如使用青霉屬的絲狀菌產生的脂肪酶將二酰甘油選擇性水解成甘油和脂肪酸，從而，增加油脂中三酰甘油的含量，提高棕櫚油等食用油的營養(yǎng)價值，制備精制油脂，改善面包質量，添加脂肪酶防止來自蛋黃的污染脂肪混入產品中引起發(fā)泡能力的下降，改善蛋白的發(fā)泡等。

5.3 在造紙工業(yè)與皮革加工中的應用

脂肪酶在造紙工業(yè)上的應用主要集中在廢紙脫墨和樹脂控制這兩方面。研究表明:脂肪酶能直接分解廢紙上的油墨、涂料及色料，達成脫墨效果；去除紙漿中的樹脂，去除造紙用白水及冷卻水的黏泥。使用脂肪酶對廢紙進行脫墨，不但脫墨效果較好，而且可以顯著減少化學制劑如燒堿、硅酸鈉、雙氧水的使用，對紙漿纖維無損傷，大大減輕污水處理的壓力，綜合成本顯著降低［52-53］。

作為一種高效無污染的脫脂劑，脂肪酶在皮革脫脂工藝上尤其具有重要的用途，在堿性條件下使得脂肪更易從皮中除去［54］。黃建忠等人［55］的研究表明:堿性脂肪酶不僅可以脫盡皮板深層油脂，而且可以軟化皮板。酶法脫脂的皮革其抗張強度、伸長率、撕裂強度以及崩裂高度均優(yōu)于堿法和表面活性劑法，提高了皮革的等級率。酶法脫脂皮板柔軟、富有彈性、粒面毛孔清晰,且毛光亮柔軟，對皮革質量有明顯的提高。

5.4 在洗滌工業(yè)中的應用［56-57］

對人們衣服所附污垢進行詳細分析發(fā)現(xiàn)：脂肪污垢約占總污垢的3/4。以前的洗滌劑主要靠表面活性劑和助劑的作用去除，效果不是很理想，尤其是甘油三脂［58］。由于脂肪酶能高效地將甘油三酯分解為容易去除的脂肪酸和甘油，因此，在洗滌劑中添加脂肪酶可以大大提高對脂肪污垢的去除效果。此外，由于添加酶制劑，可以減少洗滌劑中的表面活性劑及無機助劑(尤其是三聚磷酸鈉)的用量，可以大大減少環(huán)境污染。

5.5 催化合成生物柴油

如今，人類對不可再生能源的依賴不斷增強，以生物手段研發(fā)新的可再生能源成為人們關注的課題，生物柴油就是其中一種。它是指以可產生油料的動物、植物、微生物及各種油脂（如動物油脂、油料作物、垃圾油等）為原料，以合適的生物手段將其轉化成為可再生性柴油燃料，而最典型的生物柴油是脂肪酸甲酯［59］。姚志龍、 閔恩澤［60］在研究中指出，生物柴油是以動植物油脂、餐飲業(yè)廢油或工程微藻等為原料制成的高級脂肪酸甲酯。由于脂肪酶較多適用于長鏈脂肪醇的轉酯化反應，對短鏈脂肪醇的效果不甚明顯，所需酶類的成本較高，重復利用率又不高等缺點，目前,國內外都尚未將脂肪酶催化合成生物柴油進行較大規(guī)?；墓I(yè)生產。

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Study on Properties and Application of Microbial Lipase

Yang Yuan, Zhang Jian
(College of Chemistry and Chemical Engineering, Shanxi University, Taiyuan030006, Shanxi, China)

Lipase is one of the important industrial enzymes. Microorganism is the main source of the lipase. Lipase is widely used in the field of medicine, food industry, washing industry and related areas. Types of lipase and the construction of genetic engineered bacteria, optimization of fermentation, separation and purification involved in fermentation process were reviewed, and properties and application of lipase were summarized based on the molecular structure of lipase, which provides convenience for further study of lipase in the future.

microorganism; lipase; detergent; fermentation

TQ925；TQ649

A

1672-2701（2017）04-47-08

2016年度山西省重點研發(fā)計劃國際合作資助項目(201603D421029)。

楊 媛女士，研究生； E-mail：1162403532@qq.com。

張 劍女士，教授，博士； E-mail：zhangjian0923@vip.sina.com。