國內(nèi)近10年青錢柳多糖研究進展

汪榮斌 秦亞東 周娟娟

摘要：青錢柳多糖在降血脂、降血糖、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等方面表現(xiàn)出較強的生物學活性，其中降血脂和降血糖作用已成為近年來研究熱點。本文對國內(nèi)近10年報道的青錢柳多糖提取純化、含量測定及生物學活性研究進行綜述，以期為青錢柳多糖深入研究及產(chǎn)業(yè)開發(fā)提供參考。

關鍵詞：青錢柳；多糖；綜述

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.05.033

中圖分類號：R284.2；R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）05-0133-04

Research Progress in Cyclocarya paliurus （Batal.） Iljinsk. Polysaccharide in China in the Latest Dacade WANG Rong-bin1， QIN Ya-dong1， ZHOU Juan-juan2 （1. Anhui College of Traditional Chinese Medicine， Wuhu 241002， China； 2. Wuhu Hospital of Traditional Chinese Medicine， Wuhu 241000， China）

Abstracts： Cyclocarya paliurus （Batal.） Iljinsk. polysaccharide （CPPC） has various biological activities including hypolipemic effect， hypoglycemic effect， anti-oxidant effect， anti-tumor effect and immunomodulatiry； especially that hypolipemic effect and hypoglycemic effect have become the research hotspots in recent years. This article reviewed extraction， purification， content determination and biological activity of CPPC in the latest decade， with a purpose to provide references for the deep research and industrial development CPPC.

Key words： Cyclocarya paliurus （Batal.） Iljinsk.； polysaccharide； review

青錢柳Cyclocarya paliurus（Batal.）Iljinsk.為胡桃科Juglandaceae青錢柳屬落葉喬木，又名青錢李、搖錢樹、甜茶樹等，系雙子葉植物綱胡桃科植物。青錢柳葉有祛風止癢、清熱消渴、解毒等功效。中醫(yī)臨床用于治療糖尿病，具有較好的降血糖、降尿糖、降血脂效果。目前已知青錢柳化學成分主要有黃酮、三萜、酚、多糖等[1-4]。

安全性較高是多糖成分的優(yōu)點，一些中藥多糖已在臨床上廣泛使用，如靈芝多糖、香菇多糖、黃芪多糖等。但由于多糖是生物大分子，其提取分離、純化工藝、結構解析等比小分子有機化合物困難得多[5]，這給研究帶來阻礙，因此青錢柳多糖的相關報道較少。近年來，青錢柳多糖因其抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)，尤其是降血糖、降血脂方面的作用使其逐漸受到研究者重視，成為研究熱點[6]。因此，筆者就國內(nèi)近10年來青錢柳多糖的提取、純化、含量測定及生物學活性角度進行綜述，以期為青錢柳多糖深入研究提供參考。

基金項目：安徽省衛(wèi)生計生委中醫(yī)藥科研課題（2014zy45）；安徽高校自然科學研究重點項目（KJ2015A343）；安徽省高校學科（專業(yè)）拔尖人才學術資助重點項目（gxbjZD2016106）

1 工藝研究

1.1 含量測定

利用顯色原理測定是目前多糖含量測定主要方法，如硫酸-苯酚法或蒽酮-硫酸法，利用強酸水解多糖成單糖，形成糠醛化合物后與苯酚或蒽酮形成有色物質，然后利用其在可見光區(qū)的最大吸收波長作為檢測波長進行含量測定。而苯酚或蒽酮可與糠醛化合物成色，為獲得更接近真實的多糖含量，須去除供試多糖樣品中單糖、寡糖，否則測定的含量就是供試品中單糖、寡糖及多糖的含量之和，將導致含量測定結果偏高[7]。目前，青錢柳多糖含量測定文獻報道多以葡萄糖為對照品，采用紫外-可見分光光度法進行含量測定，檢測波長若用硫酸-苯酚法顯色是490 nm，硫酸-蒽酮法顯色是580 nm，結果較滿意。樣品的前處理多以石油醚、乙醇等有機溶劑進行脫脂處理，然后利用多糖溶解于水而難溶解于有機溶劑的原理進行水提純沉處理。文獻報道的青錢柳多糖的紫外-可見分光光度法含量測定條件見表1。

1.2 提取和純化

大多數(shù)植物多糖存在于細胞壁內(nèi)（又稱胞內(nèi)多糖），因此為了使多糖從細胞壁內(nèi)更好溶出，首先須將植物體粉碎處理，再用有機溶劑破壞包圍細胞壁的脂質層。不同的提取方式，如微波提取、熱水提取、超聲提取的原理和特點各不相同，其提取效果亦存在差異。上官新晨等[12]使用微波提取法提取青錢柳多糖，并采用單因素及正交試驗優(yōu)化了提取工藝，在最佳提取工藝條件下提取率為2.55%，其優(yōu)點是時間短、提取率高。謝建華等[13]采用傳統(tǒng)水提醇沉法，并通過單因素及正交試驗確定了最佳提取工藝，獲得青錢柳多糖提取率為6.54%。超聲波法也被應用于青錢柳多糖的提取，文獻報道超聲功率和超聲時間對多糖提取的影響較大，也有縮短提取時間、提高得率的優(yōu)點[14]。

目前關于青錢柳提取工藝的文獻報道較少，且因試驗所用青錢柳樣品產(chǎn)地不同、前處理有差異，因此其結果直接比較可信度不高。另外，衡量提取效果的指標較為單一，可從多糖得率、多糖純度等方面進行更全面考察。

本文所述純化工藝是指從多糖樣品中除去雜質的過程。這些雜質包括單糖、寡糖、蛋白質、色素、無機鹽等，而非為獲得均一多糖所采用的各種分離技術和手段。陳木森等[15]使用8種樹脂對青錢柳多糖的靜態(tài)吸附做了研究，發(fā)現(xiàn)D301R型樹脂對青錢柳多糖吸附量最大，在30 ℃、pH=7、濃度為4 mg/mL、吸附流速為1.5 mL/min時吸附較強；0.4 mol/L氯化鈉洗脫效果較好，洗脫率可達82.12%。謝建華等[16]報道了青錢柳多糖的活性炭脫色研究，以脫色率和保留率為指標，采用單因素和正交試驗優(yōu)化脫色工藝，在溫度40 ℃、時間40 min、活性炭用量1%、pH=3.5時脫色率可達80.3%、保留率為55.6%。

目前，青錢柳去除雜質的研究文獻較少，如脫蛋白質的研究尚未見報道。純化工藝手段可以脫色率、脫蛋白率、多糖純度等為指標，使用方法可對樹脂、化學試劑（過氧化氫、次氯酸鈉）、物理吸附（活性炭等）進行考察，目前尚未見文獻報道。

2 生物學活性研究

2.1 免疫調(diào)節(jié)

T淋巴細胞在機體細胞免疫、體液免疫過程中起著重要作用，通過T免疫細胞的激活，可以增加機體免疫細胞的吞噬能力，從而增強機體免疫功能。樹突狀細胞是功能最強的專職抗原提呈細胞，能有效刺激初始型T細胞的增殖，提高機體免疫應答。黃丹菲等[17]研究了青錢柳多糖對小鼠骨髓來源的樹突狀細胞的細胞形態(tài)及表面分子表達的影響，表明青錢柳多糖能顯著促進樹突狀細胞表面MHCⅡ表達，且在一定范圍呈現(xiàn)濃度依賴，說明青錢柳多糖可促進樹突狀細胞的成熟。

2.2 抗腫瘤

多糖對腫瘤細胞的抑制作用可以直接抑制腫瘤細胞的生長、提高機體免疫功能而發(fā)揮間接抗腫瘤作用（如激活吞噬細胞、促進細胞因子分泌等）等途徑實現(xiàn)對腫瘤細胞的抑制作用。劉昕等[18]研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度、不同制備方法所得青錢柳多糖對人宮頸癌HeLa細胞生長有顯著抑制作用，而對人臍帶內(nèi)皮細胞的生長抑制率較低。韓澄等[19]報道了青錢柳多糖在一定濃度下對人胃癌MGC-803細胞生長抑制率可達65.07%，細胞凋亡率達25.44%。推測其機制可能是使細胞在S期發(fā)生阻滯，同時引起細胞p21、bax的基因表達量增多，細胞bcl-2的基因表達量建設有關。

2.3 抗氧化

研究多糖抗氧化作用可分為體內(nèi)抗氧化和體外抗氧化2種模式。體外抗氧化多以模擬的化學自由基環(huán)境，如對二苯代苦味?；杂苫―PPH自由基）、過氧化氫與催化劑Fe2+構成的氧化體系（Fenton體系）等對多糖抗氧化能力進行評價；體內(nèi)抗氧化作用多在氧化模型小鼠或大鼠體內(nèi)進行，并以氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）等或清除體內(nèi)自由基的各種酶如超氧歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的活性作為指標[20-21]。青錢柳多糖濃度為0.4 mg/mL時對DPPH自由基的清除率可達71.8%，濃度為1.2 mg/mL時對羥基自由基的清除率可達68.1%，表明青錢柳多糖對DPPH自由基的清除率較高[22]。葛霞等[22]以高脂小鼠為指標，采用青錢柳多糖進行干預，發(fā)現(xiàn)能顯著降低肝臟MDA、游離脂肪酸的含量，提高肝臟SOD、GSH-Px的活性。段小群等[23]研究發(fā)現(xiàn)，青錢柳多糖可減輕小鼠肝組織自發(fā)性及四氯化碳、過氧化氫、亞鐵離子-維生素C所誘導小鼠肝臟脂質過氧化的程度，且呈一定的濃度依賴。上述研究表明，青錢柳多糖對體外、體內(nèi)均體現(xiàn)出一定的抗氧化作用。

半數(shù)清除率（IC50）是衡量物質對某一抗氧化體系能力評價的重要指標，關于青錢柳多糖IC50的研究尚未見文獻報道。多糖屬于大分子物質，進入體內(nèi)后機體對大分子物質的吸收情況迄今罕見報道；另外，關于體內(nèi)、體外抗氧化作用也應屬于相關研究重點。

2.4 降血糖

中藥降血糖機制主要從提高胰島素含量、增加胰島素敏感性、抑制葡萄糖的吸收、對受體后糖代謝的影響及提高機體自由基清除能力和抗脂質過氧化等方面實現(xiàn)。目前有關青錢柳多糖降血糖作用研究均采用尾靜脈或腹腔注射四氧嘧啶建立糖尿病模型小鼠，以格列本脲或二甲雙胍為陽性對照組，灌胃給藥一段時間后測定血清中血糖（Glu）、胰島素（Ins）、C肽、血漿胰高血糖素（Gln）及胰島組織形態(tài)為考察指標評價青錢柳多糖的降血糖效果。青錢柳多糖不同劑量組均可顯著降低模型組小鼠的Glu[24-26]、Ins、C肽、Gln，且高劑量組效果更優(yōu)[24]；青錢柳多糖可顯著提高小鼠對葡萄糖、淀粉的糖耐量，對蔗糖影響不顯著[25]；有文獻報道HE染色顯示，青錢柳多糖對四氧嘧啶引發(fā)的胰島組織損傷有一定的保護作用[26]。

從上述文獻可以發(fā)現(xiàn)，青錢柳多糖降血糖作用顯著，但其降糖作用機制研究未見文獻報道。上官新晨等[25]通過預實驗發(fā)現(xiàn)，青錢柳多糖對α-D-葡糖糖苷酶活性具有顯著的抑制作用，進而抑制機體對葡糖糖的吸收，這極有可能是青錢柳多糖降糖作用實現(xiàn)的途徑。需要進一步說明的是，通過多糖預先給藥模型，有學者提出多糖給藥時間至少需要20 d以上，否則多糖在動物體內(nèi)的效果可能尚未體現(xiàn)出來[5]，應引起足夠重視。

2.5 降血脂

高血脂癥及其所發(fā)生的脂質過氧化反應與與心腦血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生有密切關系。血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、中密度脂蛋白（MDL）、低密度脂蛋白（LDL）常作為高脂血癥判斷的重要指標；SOD、過氧化氫酶（CAT）、GSH-Px及MDA水平常作為判斷體內(nèi)發(fā)生脂質過氧化及抗氧化能力的重要指標。研究表明，青錢柳多糖可顯著降低高脂血癥大鼠血清TC、TG、LDL、MDA含量，提高血清HDL、SOD、GSH-Px、總抗氧化能力[27-28]，提示青錢柳多糖具有降脂和抗脂質氧化作用，但不同文獻報道最佳給藥劑量不同。也有報道青錢柳多糖對脂肪酶的活性體現(xiàn)出抑制作用[28]。

青錢柳多糖可降低四環(huán)素建立的人肝L-02細胞變性模型細胞內(nèi)TG含量，且呈現(xiàn)濃度依賴[29]。脂肪細胞的增殖分化失?？芍轮窘M織堆積、細胞內(nèi)分泌紊亂等，3T3-L1前脂肪細胞在脂肪細胞功能性評價中占有重要作用。研究表明，青錢柳多糖經(jīng)D301-R、DEAE樹脂純化后能夠降低3T3-L1脂肪細胞對葡萄糖的消耗，降低3T3-L1脂肪細胞細胞外甘油的含量[30]，提示青錢柳多糖能夠促進脂肪細胞的增殖，促進細胞分化的作用。研究表明，促進過氧化物酶體增殖劑激活受體（PPAR）γ和C/EBPα mRNA與蛋白質表達是多糖或蒲黃總黃酮促進3T3-L1前脂肪細胞增殖和分化的機制[31]。但青錢柳多糖是否也通過該途徑實現(xiàn)促進脂肪細胞增殖、促進細胞分化尚待深入研究。