腦缺血動物模型構(gòu)建的研究現(xiàn)狀與展望

朱穆楠　尚坤

[摘要]缺血性腦血管病（ICVD）是指局部腦組織包括神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞及聯(lián)系纖維由于供血障礙發(fā)生的病變、壞死或一過性的功能喪失。為了系統(tǒng)地研究缺血性腦血管病，建立一個接近臨床的，重現(xiàn)性好，可控的腦缺血模型是有必要的。筆者對大鼠腦缺血模型及體外模型的復(fù)制方法、模型特點(diǎn)及影響關(guān)系等方面進(jìn)行概述，發(fā)現(xiàn)存在兩大問題：一是目前大多數(shù)模型構(gòu)造以青年大鼠為研究對象，但缺血性腦血管病多發(fā)于老年人，青年大鼠的生理學(xué)和病理學(xué)與臨床腦血管病存在差異，存在青年大鼠模型的假陽性結(jié)果；二是臨床上缺血性腦血管病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，常伴有動脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病等疾病，但目前模型的復(fù)制往往采用單一因素導(dǎo)致腦缺血，與臨床實(shí)際存在差距。因此，現(xiàn)階段對于老年腦缺血模型的制備方法還很缺乏，建立一個符合臨床發(fā)病特點(diǎn)，操作簡便穩(wěn)定、重復(fù)性好的腦缺血動物模型刻不容緩。

[關(guān)鍵詞]缺血性腦血管??；老年大鼠；動物模型；體外模型

缺血性腦血管?。↖schemic Cerebrovascular Disease，ICVD）是指局部腦組織包括神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞及聯(lián)系纖維由于供血障礙發(fā)生的病變、壞死或功能瞬態(tài)損耗。目前，缺血性腦血管疾病在全部腦血管病中約占80%，并且腦缺血疾病有著發(fā)病率高，死亡率高，復(fù)發(fā)率高，致殘率高等特點(diǎn)。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，許多因素與此疾病的發(fā)生有著密切的關(guān)系。其中，可干預(yù)性因素有高血壓、心血管疾病、糖尿病、高血脂癥等；不可干預(yù)性因素有年齡、性別、種族和卒中家族史等。為了更加系統(tǒng)地研究缺血性腦血管病的發(fā)病機(jī)制、病理過程、診斷及觀察藥物的治療作用，建立一個接近臨床、重現(xiàn)性好且可控的腦缺血模型是很有必要的。

近5年的文獻(xiàn)研究表明，腦缺血模型的制備主要包括腦缺血動物模型和體外模型兩種類型，均以大鼠作為實(shí)驗(yàn)動物。本文將近5年的文獻(xiàn)進(jìn)行整理，對老年大鼠腦缺血模型及體外模型的復(fù)制方法、模型特點(diǎn)以及影響關(guān)系等進(jìn)行綜述。

1.老年大鼠腦缺血動物模型的制備

由于在臨床上，腦血管意外多發(fā)于老年人，因此本文重點(diǎn)關(guān)注老年大鼠腦缺血動物模型的制備。由于老年鼠的耐受性差，腦血管狹窄曲折和擴(kuò)張，導(dǎo)致動物死亡率高，模型重復(fù)性差，因此文獻(xiàn)中缺血性腦血管病的動物模型多以青年大鼠為主，這與臨床腦血管病多為老年人發(fā)病的實(shí)際不符，應(yīng)該引起相關(guān)研究人員的注意。

1.1老年大鼠局灶性腦缺血模型 局灶性腦缺血是指在某個特定腦區(qū)的腦血流量降低。文獻(xiàn)中采用的局灶性腦缺血模型的復(fù)制方法有開顱機(jī)械閉塞大腦中動脈法、微栓子栓塞法、線栓法、光化學(xué)法及化學(xué)物質(zhì)直接損傷法等。這些模型制備方法特點(diǎn)不盡相同，各有利弊。目前實(shí)驗(yàn)中常用的模型復(fù)制方法是光化學(xué)法和線栓法。

1.1.1光化學(xué)法 楊淵等建立了光化學(xué)誘導(dǎo)老年大鼠局灶腦缺血模型，該模型主要利用化學(xué)物質(zhì)刺激血管引起收縮，或通過直接引起血栓來復(fù)制腦缺血模型。選取雄性Wistar大鼠，26月齡（相當(dāng)于人類70歲），體重380～560g。用0.4%戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)麻醉后，縱向切開頭皮，暴露右側(cè)顱骨后分離骨膜，在顱骨表面覆以中間帶有圓孔的避光紙，孔徑為0.4cm，圓心位于前囪后約1.8cm，中線旁右側(cè)2.5cm，下為感覺運(yùn)動皮質(zhì)中樞。從股靜脈緩慢注入光敏染料Rose Bengal，之后將大鼠固定在立體定位儀上，用冷光源探頭接近暴露的顱骨，照射強(qiáng)度為300-320klx，照射時間為30min。

在復(fù)制此模型時應(yīng)注意：①戊巴比妥鈉的用量應(yīng)調(diào)整為青年大鼠的80%；②在注射Rose Bengal時，速度應(yīng)慢，約為3～5min勻速注入，否則易引起呼吸困難甚至死亡；③當(dāng)金屬鹵鎢燈使用一段時間后，照射強(qiáng)度會衰減，當(dāng)?shù)陀?50klx時，很難形成病灶，為使病灶穩(wěn)定性好，應(yīng)提前測量照射強(qiáng)度，并勤換燈泡，維持病灶恒定出現(xiàn)。

光化學(xué)法復(fù)制模型的特點(diǎn)是可任意選定栓塞部位，且部位恒定、栓塞大小及部位重復(fù)性好，大鼠存活率高，可有效避免年齡錯配，與臨床發(fā)病生理學(xué)和病理學(xué)不符等缺點(diǎn)，更適合于驗(yàn)證老年人缺血性腦血管病干預(yù)治療的研究。

1.1.2線栓法 1985年，Koizumi等在日本卒中會議上首次提出利線栓法恢復(fù)腦血流的大鼠局灶眭造血模型。劉宗濤等用同側(cè)頸總動脈永久結(jié)扎大腦中動脈線栓法制備出老年大鼠腦中動脈梗死模型。具體方法是選取28月齡健康雄性SD大鼠，仰臥固定，做頸部正中切口并分離頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）和頸內(nèi)動脈（ICA），結(jié)扎頸外動脈分支，用0.28mm的尼龍線由ECA插入ICA，當(dāng)?shù)竭_(dá)大腦中動脈起始處時，停止插入，向外稍稍拉出一點(diǎn)，即可實(shí)現(xiàn)從大腦中動脈起始端堵塞大腦中動脈所有的血液來源，隨后將頸總動脈與尼龍線一起結(jié)扎，扎緊備線，關(guān)閉并縫合頸部的手術(shù)切口。即復(fù)制局灶性腦缺血預(yù)處理模型或腦卒中模型。

線栓法復(fù)制模型的特點(diǎn)是不需要開顱手術(shù)，避免手術(shù)對老年大鼠腦組織的創(chuàng)傷和刺激作用，方法簡便，重現(xiàn)性好，易于掌握，與臨床指標(biāo)的吻合度高，是目前應(yīng)用廣泛的腦血管疾病模型的復(fù)制方法。

1.2老年大鼠全腦缺血模型 全腦缺血是指全部或大部分腦區(qū)的血流量降低。全腦缺血模型大致可分為蒙古沙鼠兩血管阻斷模型、大鼠兩血管阻斷模型、大鼠三動脈阻斷（3-VO）前腦缺血模型、大鼠四血管阻斷（4-VO）前腦缺血模型以及斷頭缺血模型等。這些模型都是通過閉塞相應(yīng)血管造成永久性全腦缺血，或通過反復(fù)閉塞造成短暫性全腦缺血反復(fù)發(fā)作來模擬人類全腦缺血的過程。這些方法對于慢性腦缺血、腦缺血的藥物以及某些特殊領(lǐng)域研究具有較高的價(jià)值。但因其對全身影響大，僅有四血管阻斷（4-VO）前腦缺血模型可用于老年大鼠的全腦缺血模型復(fù)制。

賈彥芳等參考Pulsineli法復(fù)制了老年大鼠的全腦缺血模型。選用19-21個月（相當(dāng)于人類60歲）、體重為520～750g的雄性Wistar大鼠使用水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，俯臥固定于實(shí)驗(yàn)臺上，逐層暴露直至第一頸椎雙側(cè)翼孔，用電凝針尖端探入翼孔燒灼經(jīng)翼孔走行的椎動脈，縫合切口。后將大鼠仰臥固定，分離雙側(cè)頸動脈并置線結(jié)成線環(huán)，縫合切口。24h后，重新解開切口，提起線環(huán)并暴露雙側(cè)頸總動脈，用血管夾同時夾閉雙側(cè)頸總動脈，達(dá)到預(yù)定缺血時間后撤去血管夾，造成老年大鼠的全腦缺血模型。

四血管阻斷（4-VO）復(fù)制模型的特點(diǎn)是操作簡便易掌握，大鼠可在清醒狀態(tài)下操作，避免麻醉對老年大鼠帶來的影響及損傷，同時也與臨床上因低血壓休克或心肺腦復(fù)蘇而造成的全腦缺血性損傷過程相似。本法更方便運(yùn)用于大型實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，并可對嚴(yán)重的前腦缺血進(jìn)行再灌注實(shí)驗(yàn)。

2.體外模型的制備

動物模型雖然更接近疾病的實(shí)際情況，但操作復(fù)雜，容易受到其他因素干擾。建立一種方便有效的體外模型是研究腦缺血損傷的一種行之有效的方法。體外模型主要是通過細(xì)胞培養(yǎng)獲得單一的細(xì)胞群體，根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需求控制神經(jīng)細(xì)胞的生長，排除不利的干擾因素，從而獲得優(yōu)質(zhì)的腦缺血模型。體外模型的制備主要采用的是體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，是指將有機(jī)體的活細(xì)胞放于模擬體內(nèi)環(huán)境的體外環(huán)境中生長和發(fā)育。由于此法的細(xì)胞成分單一，具有易于控制環(huán)境因素、重復(fù)性好等特點(diǎn)，故而近年來成為疾病研究的重要手段。

研究表明，在嚙齒類動物的腦缺血模型中，海馬是最易損傷的腦區(qū)之一。海馬神經(jīng)元通過體外培養(yǎng)能夠發(fā)育成熟，表達(dá)神經(jīng)元的抗體，并具有成熟的神經(jīng)元形態(tài)。因此，離體培養(yǎng)海馬腦片廣泛用于腦損傷的研究中，是模擬腦缺血常用的一種體外模型制備方法，已經(jīng)開始應(yīng)用于病理、電生理和藥理學(xué)的研究中。

2.1海馬神經(jīng)細(xì)胞的原代培養(yǎng)法 選取孕期為17～20d的Wistar孕鼠，用CO2麻醉孕鼠，頸椎脫臼處死，切開腹部皮膚，暴露子宮，取胎鼠于解剖液中，剪開顱骨去除全腦放于解剖液培養(yǎng)皿中，分離海馬組織除去血管后剪碎組織置于15mL的離心管中，離心后去上清液加25%tryp-sin 3mL，在37℃溫育15min，吸出胰蛋白酶消化液，加入3mL種植液，搖勻后靜置，吸除上清液，重復(fù)操作一次，徹底去除胰蛋白酶，最后加入3mL種植液，吹打分散組織制成細(xì)胞懸液，過200目篩。計(jì)數(shù)細(xì)胞后，按1×10接種在多聚賴氨酸培養(yǎng)板中置于CO，培養(yǎng)箱中，第二天換用Neurobasal TM Media培養(yǎng)基，每3d換半兩培養(yǎng)基，2周后即可。

原代培養(yǎng)法為缺氧袋結(jié)合血糖剝奪法，是通過延長缺血缺氧的時間，從而建立不同程度的腦缺血損傷模型，可用于研究腦缺血損傷的發(fā)生及發(fā)展機(jī)制。此模型的特點(diǎn)是可直接在正?？諝猸h(huán)境下培養(yǎng)，不需要特殊的裝置且不需要加入呼吸鏈來阻斷藥物。

2.2海馬組織切片培養(yǎng)法 切片培養(yǎng)法可用于研究神經(jīng)元死亡的細(xì)胞和分子機(jī)制，也是研究神經(jīng)損傷、神經(jīng)保護(hù)、神經(jīng)修復(fù)及突觸可塑性的良好模型。近年來，海馬組織切片培養(yǎng)也用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究。

選取出生6～7d的Wistar大鼠，斷頭快速取出腦組織并置于冰冷解剖液中，快速分離海馬，用Mclllwain切片組織刀將海馬切片，將海馬切片置于Millicell多空插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿中，并放入含lmL培養(yǎng)液的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。置于35℃的5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～14d。培養(yǎng)12～14d后，用脫氧的無糖無血清培養(yǎng)基沖洗培養(yǎng)的海馬腦片或神經(jīng)細(xì)胞，然后換培養(yǎng)基。將培養(yǎng)的組織移至恒溫的小室，將空氣換成95%N2/5%CO2，將海馬切片暴露10min，隨后用正常培養(yǎng)基沖洗組織，放回正常條件的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

切片培養(yǎng)法主要是模擬整體動物的缺氧缺血狀態(tài)，是常用的腦缺血損傷的體外模型，可用于篩選神經(jīng)保護(hù)劑，也可用于闡述藥物的作用機(jī)制。

值得注意的是，體外培養(yǎng)技術(shù)雖然具有能夠長時間直接觀察活體細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生命活動、易于施用物理化學(xué)或生物等實(shí)驗(yàn)條件、便于藥物篩選、用藥損耗少、出結(jié)果快等優(yōu)點(diǎn)，但神經(jīng)細(xì)胞離體后，獨(dú)立存在的培養(yǎng)環(huán)境與真正的體內(nèi)環(huán)境相比，仍有一定的差異，因此不能與體內(nèi)細(xì)胞真正地等同起來，同時還要注意配合進(jìn)行體內(nèi)動物的研究。

3.展望

通過對腦缺血動物模型構(gòu)建的相關(guān)文獻(xiàn)的整理研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)前此存在有兩大問題：一是目前大多數(shù)模型復(fù)制以青年大鼠為主，青年大鼠的生理學(xué)、病理學(xué)特點(diǎn)與老年大鼠存在差異，而臨床上缺血性腦血管病多發(fā)于老年人，因此以青年大鼠模型開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究容易出現(xiàn)假陽性的結(jié)果；二是臨床上缺血性腦血管病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，常伴有動脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病等疾病，但目前模型的復(fù)制方法較為簡單，往往采用單一因素導(dǎo)致腦缺血，與臨床實(shí)際存在著一定的差距。因此，雖然現(xiàn)階段對于腦缺血動物模型構(gòu)建的相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)量較多，但是大部分均脫離了臨床實(shí)際，建立一套符合臨床發(fā)病特點(diǎn)，操作簡便穩(wěn)定、重復(fù)性好的腦缺血動物模型刻不容緩。