GABAA受體激動(dòng)劑對(duì)AD模型配體門(mén)控氯通道的作用

黃玉雕， 王明華， 段 偉， 李明哲， 曹方圓

GABAA受體激動(dòng)劑對(duì)AD模型配體門(mén)控氯通道的作用

黃玉雕1， 王明華1， 段 偉1， 李明哲2， 曹方圓3

目的 觀察并分析GABAA受體激動(dòng)劑蠅蕈醇對(duì)GABA激活的配體門(mén)控氯通道的作用，為尋找新的抗阿爾茨海默病(AD)藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法 Aβ1-42誘導(dǎo)海馬神經(jīng)細(xì)胞作為AD細(xì)胞模型；通過(guò)膜片鉗(Patch clamp)技術(shù)在大鼠海馬神經(jīng)元上記錄配體門(mén)控氯通道瞬時(shí)外向電流，采用非特異性氯通道阻斷劑(NFA)和無(wú)GABA的細(xì)胞外液確定該電流成份為瞬時(shí)外向氯電流；通過(guò)膜片鉗技術(shù)觀察GABAA受體激動(dòng)劑蠅蕈醇對(duì)于在大鼠海馬神經(jīng)元上記錄瞬時(shí)外向電流的作用；向AD細(xì)胞模型中加入GABAA受體激動(dòng)劑，采用MTT觀察各組細(xì)胞活力。結(jié)果 加入GABAA受體激動(dòng)劑蠅蕈醇后GABA激活氯電流強(qiáng)度增加；加入濃度為1 mmol/L蠅蕈醇的AD模型細(xì)胞組存活率為(91.32±3.73)%，略高于未加入蠅蕈醇的模型細(xì)胞組，兩組對(duì)比P>0.05。結(jié)論 GABAA受體激動(dòng)劑蠅蕈醇對(duì)于AD細(xì)胞模型具有保護(hù)作用。

GABAA受體； 阿爾茨海默病； 配體門(mén)控氯通道； 膜片鉗

臨床上對(duì)于阿爾茨海默病(AD)的診斷主要是通過(guò)尸檢后發(fā)現(xiàn)胞外β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積和細(xì)胞內(nèi)的神經(jīng)元纖維纏結(jié)，另外大腦內(nèi)起到認(rèn)知和記憶功能作用的區(qū)域如大腦皮質(zhì)和海馬等部分損失了大量的神經(jīng)元和突觸[1]。本實(shí)驗(yàn)旨在探索GABAA受體在大鼠AD模型中的電生理機(jī)制，通過(guò)應(yīng)用膜片鉗技術(shù)觀察GABA受體門(mén)控氯通道在大鼠AD模型中的電流作用及其調(diào)節(jié)劑的作用。

1 材料與方法

1.1 AD細(xì)胞模型制備 健康SD新生24 h內(nèi)大鼠，體重約5～8 g。取出海馬并置于冰浴的PBS液中剝離其周?chē)M織和血管膜；剪成1 mm3的左右組織塊[2]。向組織內(nèi)加入100%DMEM/F12培養(yǎng)液+0.5%胰酶消化液，37 ℃水浴箱內(nèi)15 min，隨后加入含20%特級(jí)胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化；低溫高速離心機(jī)1000 r/min離心5 min；重懸計(jì)數(shù)后以2×106/ml的密度種植于35 mm培養(yǎng)皿內(nèi)；隨后置于37 ℃，95%O2+5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h～8 h；應(yīng)用98%NEUROBASAL TM AMediu+2%B27的維持培養(yǎng)液維持培養(yǎng)；每36 h～48 h全量換液。加入濃度為20 μmol/L Aβ1-42溶液培養(yǎng)72 h建立新生大鼠AD細(xì)胞模型。

1.2 膜片鉗記錄實(shí)驗(yàn) 采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)。硅酸硼玻璃電極充灌電極內(nèi)液后尖端電阻為2～3 MΩ。在形成電極細(xì)胞膜封接前校正液接電位，破膜后補(bǔ)償電容和串聯(lián)電阻。吉?dú)W封接，當(dāng)封接電阻達(dá)到2～8 GΩ，即完成巨歐姆封接，負(fù)壓破膜穩(wěn)定后記錄通道電流。GABA配體門(mén)控氯離子通道刺激程序?yàn)殂Q制電壓-60 mV，指令電壓-80～+80 mv，電壓持續(xù)時(shí)間800 ms，用躍階電壓的變化方式，躍級(jí)電壓+20 mv，間隔1 s[3～6]。通過(guò)膜片鉗技術(shù)在大鼠海馬神經(jīng)元上記錄配體門(mén)控氯通道的瞬時(shí)外向電流(transient outward current，Ito)，采用非特異性氯通道阻斷劑(NFA)和無(wú)配體GABA的細(xì)胞外液確定該電流成份為瞬時(shí)外向氯電流。將AD模型細(xì)胞分為添加GABA 50 μmol/L組、GABA100 μmol/L組、GABA 200 μmol/L組和GABA 300 μmol/L組。應(yīng)用膜片鉗技術(shù)記錄各組GABA配體門(mén)控氯通道記錄瞬時(shí)外向電流，隨后向各組以1 mmol/L的濃度添加GABAA受體激動(dòng)劑蠅蕈醇并記錄其GABA配體門(mén)控氯通道記錄瞬時(shí)外向電流的變化，每組3～5個(gè)。

1.3 MTT法檢測(cè)GABAA受體激動(dòng)劑對(duì)于AD細(xì)胞模型的作用 原代海馬神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)5 d進(jìn)行分組。對(duì)照組(A組)為正常培養(yǎng)的海馬原代細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)1組(B組)為加入濃度為20 μmol/LAβ1-42溶液培養(yǎng)72 h建立新生大鼠AD細(xì)胞模型；實(shí)驗(yàn)2組(C組)為加入濃度為20 μmol/LAβ1-42溶液+濃度為1 mmol/L的蠅蕈醇溶液。培養(yǎng)72 h后應(yīng)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。向每孔內(nèi)加入濃度為5 mg/ml MTT液20 μl，調(diào)零孔內(nèi)只加入維持培養(yǎng)液。繼續(xù)將其置于95%O2+5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 h后以扣板法扣除孔內(nèi)液體，隨后向各孔內(nèi)加入DMSO150 μl，于37 ℃下震蕩10～15 min以促進(jìn)其溶解。待藍(lán)色結(jié)晶充分溶解后將96孔板置于酶標(biāo)儀上，以570 nm的濾過(guò)波長(zhǎng)測(cè)定各孔的光吸收值(OD值)。以細(xì)胞存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100%為公式進(jìn)行計(jì)算。各設(shè)置3個(gè)平行組，最后取其均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠海馬神經(jīng)元AD模型細(xì)胞配體門(mén)控氯通道電流記錄

2.1.1 GABA激活的配體門(mén)控氯通道電流的鑒定 采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，應(yīng)用實(shí)驗(yàn)方法中設(shè)計(jì)的膜片鉗記錄方法并在細(xì)胞外液中添加200 μmol/LGABA記錄到(見(jiàn)圖1A)中的電流，而后在細(xì)胞外液中加入了1 mmol/L GABAA受體激動(dòng)劑蠅蕈醇使電流強(qiáng)度增加，記錄到了(見(jiàn)圖1C)中的電流。記錄到的電流是否為GABA激活的氯通道電流呢？隨后在細(xì)胞外液中去除GABA記錄到了(見(jiàn)圖1B)中的電流，電流強(qiáng)度明顯降低；在另一細(xì)胞外液添加200 μmol/LGABA記錄到的電流中添加非特異性氯通道阻斷劑NFA 5 min后記錄到了(見(jiàn)圖1D)中的電流，電流強(qiáng)度明顯降低。由于NFA為非特異氯通道阻斷劑，在添加記錄到的電流可能未完全阻斷海馬神經(jīng)元上的電流(如鉀通道電流、鈉通道電流、鈣通道電流和鈣敏感氯電流等)。由以上結(jié)果可推斷實(shí)驗(yàn)中記錄到的電流為GABA激活的氯通道電流。

2.1.2 GABAA受體激動(dòng)劑對(duì)于GABA激活的配體門(mén)控氯通道電流的影響 將AD模型細(xì)胞分為添加GABA 50 μmol/L組、GABA 100 μmol/L組、GABA 200 μmol/L組和GABA 300 μmol/L組，分別記錄各組及以1 mmol/L的濃度添加GABAA受體激動(dòng)劑蠅蕈醇后的電流，每組記錄3～5個(gè)細(xì)胞。電流變化結(jié)果(見(jiàn)表1～表4)。

2.2 GABAA受體激動(dòng)劑對(duì)于AD細(xì)胞模型作用的MTT檢測(cè)結(jié)果 經(jīng)MTT法檢測(cè)關(guān)于GABAA受體激動(dòng)劑蠅蕈醇對(duì)于AD細(xì)胞模型影響的結(jié)果顯示，加入蠅蕈醇濃度為1 mmol/L的實(shí)驗(yàn)1組AD模型細(xì)胞的存活率為(91.32±3.73)%，與對(duì)照組相比P<0.05,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；不加入蠅蕈醇的實(shí)驗(yàn)2組模型細(xì)胞存活率為(89.37±3.25)%，與對(duì)照組相比P<0.05,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；實(shí)驗(yàn)1組與實(shí)驗(yàn)2組相比P>0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)表5)。

圖1 膜片鉗實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證AD模型細(xì)胞GABA激活配體門(mén)控氯通道電流

電壓(mV)對(duì)照組(pA/pF)加藥組(pA/pF)P值F值t值-80-60-40-20020406080-5.45±1.77-4.10±0.82-2.98±2.31-1.35±2.620.27±1.431.87±0.773.35±0.674.79±0.746.15±1.04-14.53±1.46**-9.86±1.35**-6.02±1.07*-2.56±0.590.84±0.313.96±0.68**6.94±1.23**10.15±2.06**13.21±1.77**<0.001<0.0010.0290.3470.4060.002<0.0010.0010.0018.8528.1586.04915.31544.4910.0520.9776.234.8487.6321.3412.6640.998-0.876-4.567-5.735-5.472-5.328

與對(duì)照組相比*P<0.05,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；**P<0.01，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

表2 GABA 100 μmol/L組添加GABAA受體激動(dòng)劑蠅蕈醇前后電流變化結(jié)果

與對(duì)照組相比*P<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；**P<0.01，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

表3 GABA 200 μmol/L組添加GABAA受體激動(dòng)劑蠅蕈醇前后電流變化結(jié)果

與對(duì)照組相比*P<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；**P<0.01，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

表4 GABA 300 μmol/L組添加GABAA受體激動(dòng)劑蠅蕈醇前后電流變化結(jié)果

與對(duì)照組相比*P<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；**P<0.01，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

表5 各組阿爾茨海默病模型細(xì)胞存活率結(jié)果(%)

與對(duì)照組相比*P<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；實(shí)驗(yàn)2組與實(shí)驗(yàn)1組相比P>0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

3 討 論

AD患者的基底前腦膽堿能神經(jīng)元、腦干去甲腎上腺素和五羥色胺能神經(jīng)元及海馬谷氨酸能細(xì)胞群特別容易受到損傷，而調(diào)節(jié)這些興奮性系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡主要是通過(guò)GABA介導(dǎo)的GABAA受體的抑制作用。AD患者GABAA受體相對(duì)較少，其可能的原因是GABAA受體的特殊亞基成分在疾病發(fā)展過(guò)程中發(fā)生改變，大量基礎(chǔ)及臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)GABA能神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)參與AD的發(fā)生和發(fā)展并已確定GABA受體與AD的神經(jīng)退行性變相關(guān)[7～10]。

有學(xué)者通過(guò)膜片鉗技術(shù)記錄了缺氧后神經(jīng)元的GABA配體門(mén)控氯通道的全細(xì)胞電流，認(rèn)為GABAA受體的功能與L型電壓依賴鈣通道密切相關(guān)，L型電壓依賴鈣通道被激活后Ca2+內(nèi)流增加進(jìn)而引起GABAA受體發(fā)揮作用[3]。L型鈣通道的阻斷劑尼莫地平廣泛應(yīng)用于腦缺血的臨床治療，具有改善腦血管的血液循環(huán)和腦保護(hù)的作用，但治療效果不佳；同時(shí)在腦缺血治療中，興奮性氨基酸受體阻斷劑和自由基清除劑等腦保護(hù)藥物也被廣泛應(yīng)用與臨床，但其效果均不理想。而GABA門(mén)控氯通道與鈣通道這種密切的關(guān)系，以及GABA受體激動(dòng)劑的神經(jīng)保護(hù)作用，使我們推測(cè)這將會(huì)是一種大有潛力的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制[11,12]。Zhou等通過(guò)對(duì)GABA門(mén)控氯通道電生理研究肯定了雙(7)-他克林治療AD的有效性,證實(shí)了GABAA受體這種配體門(mén)控氯通道發(fā)揮作用與細(xì)胞內(nèi)外的離子濃度和電流方向密切相關(guān)[13]。受以上研究的啟發(fā)，本實(shí)驗(yàn)旨在探索GABAA受體在AD中的電生理機(jī)制，為AD的治療提供新的靶點(diǎn)。

為研究GABAA受體激動(dòng)劑對(duì)于AD細(xì)胞模型作用，本實(shí)驗(yàn)中采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄GABA激活的氯通道電流，應(yīng)用NFA和無(wú)配體GABA的細(xì)胞外液以確定記錄到的電流成份為GABA激活的瞬時(shí)外向氯電流。由于NFA為非特異氯通道阻斷劑，在添加記錄到的電流可能未完全阻斷海馬神經(jīng)元上其他電流如鉀通道電流、鈉通道電流、鈣通道電流和鈣敏感氯電流等，其可能成為影響記錄到的GABA激活瞬時(shí)外向氯電流真實(shí)性的因素之一。確定電流成分后將AD模型細(xì)胞以添加GABA濃度的不同將其分成4組，記錄各組電流后以1 mmol/L的濃度添加GABAA受體激動(dòng)劑蠅蕈醇后的電流，每組記錄3～5個(gè)細(xì)胞。通過(guò)對(duì)結(jié)果的分析顯示添加GABAA受體激動(dòng)劑蠅蕈醇后，各組記錄的電流顯著增加。GABA為抑制性遞質(zhì)，GABAA受體激動(dòng)劑可以增強(qiáng)GABA與GABAA受體結(jié)合，更強(qiáng)的發(fā)揮其抑制作用。其抑制作用可能減少AD患者基底前腦膽堿能神經(jīng)元、腦干去甲腎上腺素神經(jīng)元和五羥色胺能神經(jīng)元及海馬谷氨酸能細(xì)胞群受到損傷，從而發(fā)揮其保護(hù)作用。

另外本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用GABAA受體激動(dòng)劑蠅蕈醇體外添加后繼續(xù)培養(yǎng)的方式探討GABAA受體激動(dòng)劑對(duì)于AD細(xì)胞模型作用，經(jīng)MTT法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞存活率。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示加入蠅蕈醇濃度為1 mmol/L的實(shí)驗(yàn)1組和不加蠅蕈醇的實(shí)驗(yàn)2組的AD模型細(xì)胞的存活率分別為(91.32±3.73)%和(89.37±3.25)%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)1組與實(shí)驗(yàn)2組相比P>0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但實(shí)驗(yàn)1組細(xì)胞存活率高于實(shí)驗(yàn)2組。如上所述原代海馬神經(jīng)元體外培養(yǎng)細(xì)胞減少的主要方式包括主動(dòng)性凋亡和繼發(fā)性壞死兩種，在對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)環(huán)境、條件和方法相同情況下可相對(duì)排除主動(dòng)性凋亡因素。結(jié)合上述膜片鉗的研究結(jié)果考慮GABAA受體激動(dòng)劑對(duì)于AD細(xì)胞模型具有保護(hù)作用，可設(shè)想GABAA受體激動(dòng)劑可參與AD的發(fā)病機(jī)制，對(duì)于阿爾茨海默病具有保護(hù)作用。

綜上所述，GABAA受體激動(dòng)劑蠅蕈醇對(duì)于SD大鼠AD細(xì)胞模型具有保護(hù)作用，同時(shí)對(duì)于AD進(jìn)程的抑制性作用。由以上結(jié)果可推斷GABAA受體對(duì)于改善及治療AD的認(rèn)知功能障礙有潛在的治療作用，從而改善AD患者治療效果不佳的窘境。

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The role of GABAA receptor agonist for the ligand-gated chloride channels in the model of Alzheimer’s disease

HUANGYudiao,WANGMinghua,DUANWei,etal.

(DepartmentofNeurology,the5ndAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Daqing163319,China)

Objective To observe and analyze the role of the GABAAreceptor agonist muscimol on the GABA-activated ligand gated chloride channel,in order to provide experimental basis for finding new anti-Alzheimer’s disease drugs.Methods Add Aβ1-42to induce the hippocampal neurons as Alzheimer’s disease cell model.Record the transient outward current of ligand-gated chloride channel in rat hippocampal neurons by the technique of patch clamp.Then use non-specific chloride channel blockers (NFA) and non-GABA extracellular fluid to determine the currents recorded in was the transient outward chloride current.Through patch-clamp technique to observe the role of the GABAAreceptor agonist muscimol for the transient outward currents in the cell model of Alzheimer’s disease.Add GABAAreceptor agonist to the cell model of Alzheimer’s disease and observe the cell viability of each group by the method of MTT.Results The GABA-activated chloride current intensity was increased by adding the GABAAreceptor agonist of muscimol.The survival rate of the rats cell in model of Alzheimer’s disease was (91.32±3.73)% by adding a concentration of 1mmol/L muscimol,it was slightly higher than the model cell group without muscimol,the compared result of two groups wasP>0.05.Conclusions The GABAA receptor agonist of muscimol has protective effect for the rats cell model of Alzheimer’s disease.

GABAAreceptor; Alzheimer’s disease; Ligand-gated chloride channels; Patch clamp

1003-2754(2017)04-0308-04

2016-12-07；

2017-03-30

(1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江 大慶 163319；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院，黑龍江 大慶 163319；3.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)(大慶)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院形態(tài)實(shí)驗(yàn)中心，黑龍江 大慶 163319)

曹方圓，E-mail:1554293985@qq.com

R749.1

A