大巖桐試管正常苗與玻璃化苗葉表結構比較

韋梅琴 +唐楠++張文蓮+胡鮮寧

摘要：以大巖桐試管苗為試材，用改良過的過氧化氫-醋酸離析法制片，光學顯微鏡下觀察并比較試管正常苗與玻璃化苗的葉表結構。結果發(fā)現(xiàn)，2類試管苗的上下表皮均有氣孔器、腺毛、表皮毛的分布，但它們的數(shù)量與氣孔特征具有顯著差異。與試管正常苗相比，玻璃化苗上下表皮細胞單位面積表皮毛、腺毛、氣孔器密度減少，保衛(wèi)細胞形態(tài)異常，氣孔器的長度差異不明顯，但氣孔器寬度、相對開張度均較正常苗顯著增大，是正常試管苗的2倍。此外，玻璃化苗與外界進行氣體和水分交換量明顯大于正常苗，從而導致玻璃化苗持水能力弱、易失水，這是試管玻璃化苗在繼代、生根培養(yǎng)中不能正常生長、極易死亡的主要原因。

關鍵詞：大巖桐；試管正常苗；玻璃化苗；葉表皮；比較

中圖分類號： Q945.45文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）04-0093-03

大巖桐（Sinningia speciosa）屬苦苣苔科苦苣苔屬多年生草本植物，別稱落雪泥，原產(chǎn)于巴西，是點綴和裝飾室內(nèi)及窗臺的理想盆花。目前圍繞大巖桐做了過量表達CFL以及激素處理改變花的發(fā)育與調(diào)控作用及其機理研究、再生體系的建立和優(yōu)化及遺傳轉化等研究[1-9]；大巖桐常規(guī)的繁殖方法一般用播種、枝插、分球莖等方法來進行，但繁殖系數(shù)低，滿足不了人們的需求。而利用組織培養(yǎng)的方法可有效提高繁殖系數(shù)，為大巖桐的快繁提供保障；但在組織培養(yǎng)過程中不可避免地出現(xiàn)異常苗，胡鑫等對大巖桐再生植株經(jīng)過連續(xù)組織培養(yǎng)以后，發(fā)現(xiàn)了如葉序的改變和花的同源異型現(xiàn)象等表型突變[9]，在大巖桐后期的繼代培養(yǎng)中見到了玻璃化苗，其增殖能力較低，難以生根成苗，對組培體系的穩(wěn)定性和種苗生產(chǎn)造成嚴重的影響[2，9]。本試驗針對大巖桐試管正常苗和玻璃化苗的葉片，進行葉表結構比較，試圖從解剖學的角度探討試管玻璃化苗在繼代培養(yǎng)中不能正常生長、極易死亡的原因，為深入研究試管玻璃化苗的機理提供理論參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

取溫室中生長較為健壯的大巖桐莖尖，經(jīng)過初代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)獲得試管正常苗與試管玻璃化苗。

1.2方法

以大巖桐試管正常苗和試管玻璃化苗為試材，2類苗各取6株，從頂端向下取第3張葉片，將葉片中上部主葉脈兩側部位剪成1 cm左右的方塊。將上述葉片方塊用改良過的過氧化氫-醋酸離析法對上、下表皮進行離析，1%番紅染色，中性樹膠封片；在奧特BK-5000（OPTEC-BK5000）光學顯微鏡下觀察、拍照；利用測微軟件TSView對上、下表皮的氣孔進行觀察計數(shù)，測定氣孔的長和寬，氣孔開口長、開口寬等指標；所得數(shù)據(jù)均為20個視野下的平均值。

氣孔密度：

[JZ]D=S/M。

式中：D為氣孔器密度；S代表整個視野內(nèi)的氣孔數(shù)目；M代表每個視野的面積。

氣孔相對開張度：

[JZ]氣孔相對開張度=氣孔開口寬/氣孔開口長×100%。

1.3數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用Excel2003及SPSS 13軟件進行方差分析。

2結果與分析

2.1大巖桐試管正常苗和玻璃化苗形態(tài)特征

取溫室中生長的大巖桐莖尖，經(jīng)過離體培養(yǎng)獲得無菌初代培養(yǎng)物，在初期的培養(yǎng)中試管苗生長健壯無異?，F(xiàn)象，在后期的繼代培養(yǎng)中才可見玻璃化苗，并隨培養(yǎng)代數(shù)增加，玻璃化加重。離體培養(yǎng)條件下的試管正常苗和試管玻璃化苗的葉的形狀和株高差異不大，其株高均在7～8 cm左右，葉對生，卵圓形或長橢圓形，有鋸齒；但葉片的大小與顏色有明顯的不同，即試管正常苗的葉片小而厚、葉色呈深綠色，而玻璃化苗的葉片大而薄，整個葉片明顯失綠，色澤呈粉紅色，僅在葉片的葉脈附近可見少量綠色，未有腫脹或明顯的水浸狀，這類苗增殖分化能力較低，難以進行生根培養(yǎng)（圖1）。

2.2葉表結構

大巖桐的葉表結構由表皮細胞、表皮毛及氣孔器等幾部分組成。2類試管苗的葉表結構差異主要表現(xiàn)在表皮細胞的形狀、氣孔復合體的大小、密度等方面（表1、圖2）。

2.2.1表皮細胞的形狀及其附屬物

光學顯微鏡下2類試管苗葉的表皮細胞形狀明顯不同，即試管正常苗葉片的上、下表皮細胞呈多邊形，垂周壁平直或弓形；試管玻璃化苗的上、下表皮細胞呈不規(guī)則形狀其垂周壁上表皮的為淺波形，下表皮的為深波形。大巖桐試管苗表皮細胞上的附

從氣孔長/寬的值看，大巖桐試管正常苗上表皮比值為0.96，下表皮比值為1.01，比值都在1左右，說明大巖桐試管正常苗的氣孔器近乎圓形；玻璃化苗上表皮比值為0.72，下表皮比值為0.88，可見氣孔形狀呈扁圓形（表2、圖2）。同時還存在氣孔發(fā)育不完善現(xiàn)象：（1）氣孔器開口極大，開口形狀有長方形、月牙形與圓形等；（2）2個保衛(wèi)細胞發(fā)育不平衡，大小不等（圖2-E至圖2-H）。試管正常苗下氣孔的相對開張度0.51，玻璃化苗的0.98，開口近乎圓形；試管正常苗上氣孔的相對開張度0.34，玻璃化苗的0.64，二者差異顯著?？梢?，不論是上表皮還是下表皮，玻璃化苗的氣孔的相對開張度是正常試管苗的2倍。

2.2.2.2氣孔密度

大巖桐試管正常苗的上表皮氣孔密度（188.66±14.13）個/mm2，下表皮氣孔密度（191.46±21.90）個/mm2，上、下表皮細胞之間氣孔密度差異不明顯；試管玻璃化苗的上表皮氣孔密度為（135.31±20.67）個/mm2，下表皮氣孔密度（175.66±15.36）個/mm2（表2）。由此可見，同一類型的試管苗表現(xiàn)為下表皮氣孔數(shù)量大于上表皮的；不同類型的試管苗，不論上表皮還是下表皮均表現(xiàn)為試管正常苗的氣孔密度多于試管玻璃化苗的氣孔密度，兩者差異顯著，這與槐樹和絲石竹中的結果[10-11]相反。

3結論與討論

玻璃化苗是植物組織培養(yǎng)中特有的一種生理性病變，在組織培養(yǎng)中普遍存在[10-11]。它作為一種畸型苗，在形態(tài)特征上一般表現(xiàn)為植株矮小、莖葉腫脹畸形、組織半透明水浸狀、葉色為海綠色、組織質脆易斷等[12]。大巖桐玻璃化苗外部形態(tài)與正常苗無明顯差異，植株具有明顯的節(jié)與節(jié)間，葉片大而薄，沒有腫脹多汁現(xiàn)象，整個葉片明顯失綠，色澤呈粉紅色，僅在葉片的葉脈附近可見少量綠色，未有腫脹或明顯的水浸狀。P[KG-*5]a[DD（-1*2][HT6]^[DD）]ques認為，玻璃化苗可分為外觀形態(tài)明顯異常與基本無異常2種類型，大巖桐玻璃化苗形態(tài)與后者相似，屬于基本無異常類型[13]。這可能受培養(yǎng)條件的影響，使得外植體在培養(yǎng)基中分別導致非多汁和多汁玻璃苗的產(chǎn)生[14]，同時也與植物種類、基因型的差異有關，長期的組織培養(yǎng)導致內(nèi)源激素水平發(fā)生改變，隨著培養(yǎng)時間的延長，瓶內(nèi)氣體積累不斷增加，引起植物對物質的利用受阻，從而導致試管玻璃化的發(fā)生[15]。

葉片表皮是植物體和外界環(huán)境接觸的最外層組織，氣孔器是調(diào)節(jié)氣體出入和水分蒸騰的重要結構，與植物的光合作用、蒸騰作用直接相關[16]。2類試管苗氣孔器的長度變化不明顯，而氣孔器的寬度和長寬比差異顯著，玻璃化苗的氣孔相對開張度較正常苗顯著增大，是正常試管苗的2倍，說明環(huán)境對2類試管苗的氣孔特性的影響程度不同?；睒?、絲石竹、蘋果的離體培養(yǎng)研究表明，玻璃化后葉片上、下表皮氣孔數(shù)明顯增多[10-11，17]，而筆者的結果與之相反，但與芥菜的玻璃苗結論[18]一致，即單位面積內(nèi)氣孔數(shù)減少，這可能與玻璃化苗葉片的大小有關。與試管正常苗相比，大巖桐玻璃化苗葉面積顯著增大，使得氣孔在單位葉面積內(nèi)的分布量下降，可見氣孔密度的變化與葉面積的變化有一定的聯(lián)系。

此外，玻璃化苗與正常苗在內(nèi)部解剖結構上也存在明顯差異。與正常試管苗相比，玻璃苗葉片的機械組織較弱、維管束組織發(fā)育不良[11，17，19-20]，從而影響體內(nèi)生長素的極性運輸，使得玻璃化苗的內(nèi)源生長素分布狀況發(fā)生改變，導致營養(yǎng)物質和水分運輸不暢通[20-21]；葉表附屬物——表皮毛及腺毛較少；氣孔器異常、發(fā)育不完全，開口較大。這些特點顯示出玻璃化苗與外界進行氣體（包括水、氣）交換的途徑明顯較正常苗的增大[14]，持水能力較弱；同時葉片葉色褪綠，不能行使正常的光合作用，最終導致其新陳代謝和生理功能失調(diào)[22-23]，這是試管玻璃化苗在繼代培養(yǎng)、生根培養(yǎng)中不能正常生長，極易死亡的主要原因之一[17]。因此，在大巖桐試管苗的培養(yǎng)過程中，控制繼代培養(yǎng)次數(shù)對減少玻璃化的發(fā)生至關重要。玻璃化的產(chǎn)生也與培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件等密切相關，因此如何控制這類物質的用量以防止大巖桐試管苗玻璃化的發(fā)生有待進一步研究。

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