CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在致瘤病毒感染研究中的應(yīng)用

王玉，徐維禎，鐘照華

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室及伍連德研究所，哈爾濱 150081

·綜述·

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在致瘤病毒感染研究中的應(yīng)用

王玉，徐維禎，鐘照華

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室及伍連德研究所，哈爾濱 150081

成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列及其相關(guān)蛋白9〔clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)，CRISPR/Cas9〕基因編輯技術(shù)的發(fā)現(xiàn)源于真細(xì)菌和古細(xì)菌中CRISPR/Cas系統(tǒng)介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫機(jī)制研究。該技術(shù)利用特異性向?qū)NA識(shí)別靶點(diǎn)基因，引導(dǎo)核酸內(nèi)切酶Cas9對(duì)其切割，并通過(guò)同源重組或非同源末端連接完成對(duì)目的DNA的編輯。某些病毒感染機(jī)體后，可將其基因組整合到宿主細(xì)胞基因組中或潛伏于組織中而無(wú)法被徹底清除，從而引起持續(xù)性感染。本文參考2013年以來(lái)CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)的最新相關(guān)研究報(bào)道，重點(diǎn)綜述其在人類免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1，HIV-1)、人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV )、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)、 Epstein-Barr病毒(Epstein-Barr virus，EBV)等致瘤病毒感染相關(guān)疾病研究中的應(yīng)用，并概括其作用于這些病毒的有效靶點(diǎn)。

成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列及其相關(guān)蛋白9；基因編輯；病毒

致瘤病毒感染相關(guān)疾病傳染性強(qiáng)，危害大。如人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)雖不直接引發(fā)腫瘤，但HIV感染者易并發(fā)卡波西肉瘤(Kaposi’s sarcoma，KS)；乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)與肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生密切相關(guān)；人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV) 可引起宮頸癌等鱗狀上皮細(xì)胞癌；Epstein-Barr病毒(Epstein-Barr virus，EBV)感染機(jī)體后可引起伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)和鼻咽癌。這些病毒危害性大，但目前尚無(wú)有效的治療方法。近年來(lái)，人們開發(fā)出一種新型基因編輯技術(shù)，稱為成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列及其相關(guān)蛋白9〔clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)，CRISPR/Cas9〕。該技術(shù)源于細(xì)菌獲得性免疫系統(tǒng)，可切割外源性DNA[1]?；贑RISPR/Cas9系統(tǒng)的基因編輯技術(shù)因簡(jiǎn)單、高效、價(jià)廉、毒性小等優(yōu)點(diǎn)而成為新一代基因組定向編輯的有力工具。本文主要綜述CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在致瘤病毒HIV、HPV、HBV和EBV研究中的應(yīng)用；在其他致瘤病毒如卡波希肉瘤相關(guān)皰疹病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus, KSHV)、人類嗜T細(xì)胞病毒(human T cell lymphotropic virus，HTLV)、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)和傳染性軟疣病毒(molluscum contagiosum virus，MCV)研究中尚未見其應(yīng)用。

1 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)概述

CRISPR/Cas9源于細(xì)菌的Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)。外源噬菌體或質(zhì)粒入侵細(xì)菌后，細(xì)菌通過(guò)識(shí)別外源DNA的前間區(qū)序列鄰近基序(protospacer adjacent motif，PAM)，將外源DNA加工成間隔序列并插入CRISPR序列中。CRISPR轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生前體crRNA(pre-CRISPR RNA，pre-crRNA)與反式激活crRNA(trans-activating crRNA，tracrRNA)配對(duì)，在RNase Ⅲ作用下加工形成成熟的crRNA，并與Cas9蛋白形成復(fù)合物。復(fù)合物中的crRNA通過(guò)識(shí)別位于PAM 5′端互補(bǔ)的DNA序列，與基因組穩(wěn)定結(jié)合，并對(duì)目標(biāo)DNA進(jìn)行切割，導(dǎo)致基因組雙鏈斷裂。

2012年，Jinek等[2]根據(jù)crRNA∶tracrRNA復(fù)合體的結(jié)構(gòu)特征，人工合成crRNA序列，被稱為小向?qū)NA(small guide RNA，sgRNA)。sgRNA可被Cas9識(shí)別，形成sgRNA-Cas9復(fù)合物，并引導(dǎo)其結(jié)合于目標(biāo)DNA。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)可通過(guò)設(shè)計(jì)sgRNA，實(shí)現(xiàn)對(duì)含有PAM序列的任一目標(biāo)DNA進(jìn)行敲除、插入或定點(diǎn)突變(圖1)；同時(shí)具有易于構(gòu)建、打靶效率高、應(yīng)用范圍廣并可進(jìn)行多基因組編輯等優(yōu)點(diǎn)。自此，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)廣泛用于人類細(xì)胞及其他生物體研究[3-6]。

圖1 sgRNA-Cas9復(fù)合物介導(dǎo)的靶向基因組編輯

Fig.1 Targeted genome editing by sgRNA-Cas9 complex

2 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在持續(xù)性病毒感染研究中的應(yīng)用

病毒持續(xù)性感染一直困擾著人類。盡管一般的抗病毒治療能抑制病毒復(fù)制，但不能徹底清除宿主體內(nèi)的病毒。因此，對(duì)許多病毒持續(xù)性感染缺乏有效治療手段。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的快速發(fā)展為抗病毒持續(xù)性感染研究提供了新的工具，目前主要應(yīng)用于HIV、HPV、HBV和EBV的持續(xù)性感染研究(表1)。

2.1 HIV-1

HIV分為HIV-1型和HIV-2型。HIV-1型是引起艾滋病的主要病原體。目前，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)應(yīng)用于HIV-1研究，主要是通過(guò)靶向ccr5阻止HIV-1對(duì)CD4+T細(xì)胞侵染，以及通過(guò)靶向HIV-1前病毒終止其持續(xù)性感染。

HIV-1通過(guò)與細(xì)胞表面CD4+受體和CCR5/CXCR4共受體結(jié)合而侵染CD4+T細(xì)胞[7]。2014年，Wang等[8]構(gòu)建3個(gè)靶向ccr5的sgRNA/Cas9慢病毒載體，并將其轉(zhuǎn)導(dǎo)入HIV-1易感人類CD4+細(xì)胞中。流式細(xì)胞儀分析顯示，綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)陽(yáng)性細(xì)胞比例從86.8%分別降至81.3%、78.2%和77.5%。2015年，Hou等[9]證明利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)靶向人類cxcr4基因可使CD4+T細(xì)胞抵御HIV-1入侵。

表1 已知CRISPR/Cas9抗病毒作用靶點(diǎn)

Tab.1 Known antiviral targets for CRISPR/Cas9

VirusTargetNucleotidepositionSequence(5'-3')ReferenceHIV-1LTRTAR171-193GTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGEbina,etalCCR55889-5911GCTTGTGACACGGACTCAAGTGGWang,etal,20145446-5468GGTCCTGCCGCTGCTTGTCATGG5831-5853TAAACTGAGCTTGCTCGCTCGGGLTRU3162-184ATCAGATATCCACTGACCTTTGGHu,etal,20149291-9313CCGGAGTACTTCAAGAACTGCTGCXCR44753-4775GCTTCTACCCCAATGACTTGTGGHou,etal,20154784-4806GTTCCAGTTTCAGCACATCATGGHPV18E6/E7109-131CGCGCTTTGAGGATCCAACACGGKennedy,etal,2014608-630CGAGCAATTAAGCGACTCAGAGGHPV16E6/E77065-7084CCGACTAAGGGCGTAACCGAAATZhen,etal,20147247-7266CCGCAACAGTTACTGCGACGTG7727-7747CCGTCCGGTTCTGCTTGTCCAGCHPV16E77589-7611AACCCAGCTGTAATCATGCATGGHu,etal,20147619-7641CCTACATTGCATGAATATATGTT7652-7674CCAGAGACAACTGATCTCTACTG7724-7746CCAGCTGGACAAGCAGAACCGGAHPV6/11E7485-507CCCTGTAGGGTTACATTGCTATGLiu,etal,2016518-540AGACAGCTCAGAAGATGAGGTGGHBVP11292-1314GTTTTGCTCGCAGCCGGTCTGGGLin,etal,2014XCp1742-1764GGGGGAGGAGATTAGGTTAAAGGRT729-750TTTCAGTTATATGGATGATGTGGKennedy,etal,2015ENII-CP/X3006-2987CATTCGGTGGGCGTTCACGGSeegerandSohn,2014HBsAg354-376CAACTTGTCCTGGTTATCGCTGGZhen,etal,2015HBx4034-4053CCTCTGCACGTCGCATGGAGCCP234-256TACCGCAGAGTCTAGACTCGTGGLiu,etal,20156465-6487CCCTCGCCTCGCAGACGAAGGTCX1523-1542GGGGCGCACCTCTCTTTACGCGGDong,etal,20151681-1700AATGTCAACGACCGACCTTGAGGC2336-2355ACTACTGTTGTTAGACGACGWang,etal,2015EBVBART137842-137863TAATTGCAGTGGACCCCGGAGGYuen,etal,2015138397-138418AAGAAGCTCCTCAGCAACATGG

HIV-1前病毒可整合至宿主DNA并隨之復(fù)制，這是HIV-1持續(xù)性感染的主要原因。其長(zhǎng)末端重復(fù)序列(long terminal repeat，LTR)區(qū)含有順式調(diào)控序列，可控制前病毒基因表達(dá)。因此，有研究通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)靶向前病毒LTR區(qū)，流式細(xì)胞儀分析顯示GFP陽(yáng)性細(xì)胞比例從97.8%降至35.5%[10]。2014年，又有研究證實(shí)CRISPR/Cas9技術(shù)能高效靶向HIV-1前病毒LTR區(qū)U3啟動(dòng)子，從而使小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和T細(xì)胞系中的HIV-1失活[11]。以上研究表明，CRISPR/Cas9技術(shù)可能成為抗HIV持續(xù)性感染的有力工具。

2.2 HPV

E6和E7是HPV的主要致癌基因。E6可與腫瘤抑制蛋白p53結(jié)合使其降解，E7則與腫瘤抑制蛋白pRb結(jié)合使其失活，引起細(xì)胞惡性增生。

2014年，Hu等[12]和Kennedy等[13]先后證明利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向E6或E7基因可誘導(dǎo)HPV基因組切割及E6、E7基因突變，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞周期阻滯并發(fā)生細(xì)胞凋亡。同年，Zhen等[14]將構(gòu)建的靶向E6和E7的sgRNA和Cas9轉(zhuǎn)染入人子宮頸鱗癌細(xì)胞SiHa，注射到小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組小鼠的腫瘤體積顯著減小，體重也顯著低于對(duì)照組。2015年，Liu等[15]構(gòu)建了針對(duì)HPV6/11靶向E7基因的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，將其轉(zhuǎn)染至能穩(wěn)定表達(dá)HPV6E7或HPV11E7的角質(zhì)細(xì)胞中，48 h后蛋白免疫印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)E7表達(dá)量減少，并引起細(xì)胞凋亡。以上研究顯示，CRISPR/Cas9技術(shù)可通過(guò)靶向兩種關(guān)鍵的原癌基因E6和E7，從而達(dá)到抑制細(xì)胞惡性增生的目的，使其成為研究治療HPV所致宮頸癌的潛在工具。

2.3 HBV

HBV基因組包含4個(gè)開放讀碼框：S基因區(qū)、C基因區(qū)、P基因區(qū)和X基因區(qū)。這4個(gè)基因區(qū)分別負(fù)責(zé)編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白。理論上，靶向破壞任何一個(gè)基因區(qū)均可有效抑制病毒蛋白的表達(dá)和復(fù)制。

Lin等[16]首次構(gòu)建了靶向HBV基因組的sgRNA/Cas9質(zhì)粒，并將其與HBV表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至Huh7細(xì)胞中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了sgRNA/Cas9的細(xì)胞上清液中HBV表面抗原(HBV surface antigen，HBsAg)明顯減少。隨后，他們將這些質(zhì)粒與HBV表達(dá)質(zhì)粒共同注射入小鼠尾靜脈，小鼠血清HBsAg水平和肝內(nèi)HBV表達(dá)水平均明顯下降。Kennedy等[17]利用慢病毒載體，將靶向HBV的sgRNA/Cas9轉(zhuǎn)導(dǎo)入慢性HBV感染模型(HepAD38 細(xì)胞)和再次感染模型(HepaRG 細(xì)胞)中，發(fā)現(xiàn)HBV DNA復(fù)制和共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)積聚被有效抑制。Seeger和Sohn也證明，靶向HBV的sgRNA可高效抑制HBV感染[18]。在另一項(xiàng)研究中，Liu等[19]提出靶向HBV的sgRNA/Cas9 能造成HBV DNA模板的突變和清除，體內(nèi)和體外HBV復(fù)制減少，且適用于不同的HBV基因型。Zhen等[20]將靶向HBV S基因區(qū)的sgRNA/Cas9用于HepG2.2.15細(xì)胞和小鼠模型，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)上清液及小鼠血清中HBsAg表達(dá)明顯降低。Dong等[21]證明，利用CRISPR/Cas9技術(shù)能在肝細(xì)胞及攜帶HBV cccDNA的一種新型小鼠模型中減少HBV cccDNA的復(fù)制。Ramanan等[22]設(shè)計(jì)了一系列靶向HBV保守序列的sgRNA，能在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中高效抑制病毒復(fù)制。Wang等[23]利用雙gRNA使細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的HBsAg、HBV e抗原(HBV e antigen，HBeAg)、HBV DNA和cccDNA均減少，且適用于HBV A～D基因型。以上研究表明，CRISPR/Cas9技術(shù)可在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中靶向破壞HBV cccDNA，有望在未來(lái)成為治療HBV持續(xù)性感染的新策略。

2.4 EBV

EBV多表現(xiàn)為持續(xù)性感染，主要發(fā)生于病毒潛伏期。此階段病毒基因組以游離附加體形式存在于宿主細(xì)胞中，迄今還沒(méi)有任何治療方法能將其完全清除。

2014年，有研究者構(gòu)建了7個(gè)靶向EBV基因組的sgRNA/Cas9質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)染入EBV慢性感染細(xì)胞(Raji細(xì)胞)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EBV基因組的靶位點(diǎn)發(fā)生突變，同時(shí)轉(zhuǎn)染了sgRNA/Cas9的細(xì)胞增殖效率降低。定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)顯示，在sgRNA/Cas9轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，25%細(xì)胞中檢測(cè)不到EBV基因組，50%細(xì)胞中EBV基因組拷貝數(shù)明顯減少[24]。

2015年，有研究利用兩個(gè)gRNA直接靶向刪除人類EBV持續(xù)性感染上皮細(xì)胞中負(fù)責(zé)編碼病毒微小RNA(microRNA，miRNA)BART(BamHI A rightward transcript)區(qū)啟動(dòng)子的558 bp序列，導(dǎo)致病毒不能表達(dá)BART miRNA，表明利用CRISPR/Cas9技術(shù)可有效靶向編輯EBV基因組[25]。

3 結(jié)語(yǔ)

CRISPR/Cas9作為一種新型基因編輯技術(shù)，具有簡(jiǎn)單、精確、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，但其仍存在脫靶問(wèn)題。目前，減少CRISPR/Cas9技術(shù)脫靶的措施主要有3種：①使Cas9蛋白的HNH或RuvC核酸酶結(jié)構(gòu)域失活，產(chǎn)生功能缺陷的Cas9(D10A)，這種Cas9只能產(chǎn)生DNA單鏈斷裂[26]。有研究者在靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)了兩條sgRNA，分別與正負(fù)鏈配對(duì)，使突變型Cas9對(duì)兩條鏈分別切割，引發(fā)特定位點(diǎn)的雙鏈斷裂，實(shí)驗(yàn)證明該方法提高了CRISPR/Cas9的特異性[27]。②通過(guò)截短sgRNA長(zhǎng)度，提高其識(shí)別靶序列的特異性[28]。③將無(wú)活性的Cas9蛋白與FokⅠ內(nèi)切酶融合[29]，構(gòu)建sgRNA引導(dǎo)的FokⅠ基因編輯技術(shù)。以上3種方法均能有效降低CRISPR/Cas9技術(shù)的脫靶率。

雖然CRISPR/Cas9技術(shù)在應(yīng)用中仍有許多需要解決的問(wèn)題，但與其他基因編輯技術(shù)相比，其更簡(jiǎn)單、廉價(jià)、快速、靈活。最近，有報(bào)道稱CRISPR/Cas9技術(shù)不僅可對(duì)DNA進(jìn)行編輯，還可對(duì)RNA進(jìn)行編輯[30]?？傊?，CRISPR/Cas9技術(shù)作為一種新型基因編輯工具，在病毒持續(xù)性感染研究中具有巨大潛能。

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. ZHONG Zhaohua, E-mail：zhongzh@hrbmu.edu.cn

Application of CRISPR/Cas9 gene editing technology in tumorigenic virus infection

WANG Yu, XU Weizhen, ZHONG Zhaohua

DepartmentofMicrobiologyandWuLien-TehInstitute,HarbinMedicalUniversity,Harbin150081,China

Clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) (CRISPR/Cas9) gene editing technology was originated from the study of microbial CRISPR adaptive immune system, by using a specific guide RNA to identify target genes and guide endonuclease of Cas9. Some viral genomes are integrated into the cellular genome or lurk in the organization resulting in persistent infection. This review refers to the latest research results since 2013, focusing on the applications of CRISPR/Cas9 technology in tumorigenic virus infection, such as human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1), human papillomavirus (HPV), hepatitis B virus (HBV), and Epstein-Barr virus (EBV).

Clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9); Gene editing; Virus

國(guó)家自然科學(xué)基金(81271825、81571999)

鐘照華

2016-12-01)