兔脊髓缺血再灌注后小膠質(zhì)細(xì)胞活化及炎性細(xì)胞因子變化的研究

王昀璐，田蕾，劉詩瑤，馬志高，侯思雨，楊彥偉，李慧先，金沐，董秀華，盧家凱，程衛(wèi)平

兔脊髓缺血再灌注后小膠質(zhì)細(xì)胞活化及炎性細(xì)胞因子變化的研究

王昀璐，田蕾，劉詩瑤，馬志高，侯思雨，楊彥偉，李慧先，金沐，董秀華，盧家凱，程衛(wèi)平

目的：觀察兔脊髓缺血再灌注后小膠質(zhì)細(xì)胞活化及炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-10、核轉(zhuǎn)錄因子（NF）-κB的變化規(guī)律，為后處理干預(yù)時機(jī)提供理論依據(jù)。

方法：采用胸主動脈球囊阻斷法建立兔脊髓缺血再灌注損傷模型。36周健康成年雄性新西蘭大白兔54只，假手術(shù)組（n=6只）只置入球囊不阻斷；48只脊髓缺血再灌注家兔按再灌注時間點分為8組：再灌注0 h組、再灌注1 h組、再灌注2 h組、再灌注3 h組、再灌注8 h組、再灌注24 h組、再灌注48 h組、再灌注72 h組，每組6只。分別于再灌注后0 h、1 h、2 h、3 h、8 h、24 h、48 h和72 h檢測缺血段脊髓組織中正常神經(jīng)元、凋亡神經(jīng)元以及離子鈣結(jié)合接頭分子-1（Iba-1）、IL-6、IL-10、NF-κB的表達(dá)水平。

結(jié)果：正常神經(jīng)元數(shù)量隨再灌注時間延長而減少；脊髓缺血再灌注損傷后8 h原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記（TUNEL）陽性神經(jīng)元開始增多，再灌注24 h組的TUNEL陽性神經(jīng)元達(dá)高峰。再灌注2 h組的Iba-1表達(dá)開始增多，再灌注8 h組Iba-1表達(dá)達(dá)高峰；NF-κB于再灌注3 h組開始增高，再灌注8 h組NF-κB表達(dá)高峰；IL-6和IL-10表達(dá)均在再灌注24 h組達(dá)高峰。脊髓缺血再灌注后NF-κB、IL-6、IL-10的表達(dá)水平與Iba-1呈相近的變化趨勢。

結(jié)論：脊髓缺血再灌注后小膠質(zhì)細(xì)胞激活呈動態(tài)變化。NF-κB、IL-6、IL-10的表達(dá)水平與小膠質(zhì)細(xì)胞激活顯著正相關(guān)，在小膠質(zhì)細(xì)胞激活前給予后處理可降低神經(jīng)元損傷。

再灌注損傷；小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞；炎癥趨化因子類

脊 髓 缺 血 再 灌 注（spinal cord ischemia reperfusion，SCIR）損傷后的炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致大血管術(shù)后脊髓繼發(fā)性損傷的重要原因之一[1,2]。小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞（microglia cell，MC）是神經(jīng)系統(tǒng)中主要的炎癥細(xì)胞之一，激活后釋放促炎因子可導(dǎo)致組織損傷[3]。抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活可緩解SCIR損傷[4]。但有關(guān)SCIR損傷后MC激活和炎癥因子動態(tài)變化規(guī)律的研究較少。本研究將建立兔SCIR模型，多時點觀察兔SCIR損傷后MC的動態(tài)變化過程以及炎癥因子白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）和核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）的動態(tài)變化，為選擇合理的干預(yù)治療時機(jī)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

實驗動物、主要儀器：本實驗已獲得首都醫(yī)科大學(xué)動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)，實驗動物的福利遵照美國國家衛(wèi)生研究院（NIH）相關(guān)指南實施。健康成年新西蘭大白兔54只，體重2.5～3.0 kg，雄性，由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院動物中心提供[許可證編號：SYXK（京）2015-0023]。PHILIPS多道生理監(jiān)護(hù)儀（德國）。

建立兔SCIR損傷模型[5]：實驗動物行3%戊巴比妥耳緣靜脈注射麻醉（30 mg/kg），仰臥位固定，保留自主呼吸。耳緣中動脈置管測量近端動脈血壓，股動脈置管測量遠(yuǎn)端血壓。直腸內(nèi)置入溫度傳感器監(jiān)測體溫，應(yīng)用電熱毯維持核心溫度38 ℃左右。分別在阻斷前、阻斷后5 min及再灌注后15 min記錄近端、遠(yuǎn)端血壓和肛溫。在兔大腿內(nèi)側(cè)注射利多卡因局部浸潤麻醉，切開皮膚，分離左右側(cè)股動脈，耳緣靜脈注射肝素鈉125 U/kg，2 min后，經(jīng)右側(cè)股動脈置入2F Fogarty球囊導(dǎo)管（上海愛德華生命科學(xué)有限公司）約15 cm，前端到達(dá)兔左側(cè)腎動脈下0.5～1 cm腹主動脈處，左側(cè)股動脈明視下置入18號套管針監(jiān)測遠(yuǎn)端血壓。阻斷時充起球囊，主動脈遠(yuǎn)端血壓立即下降并維持在8 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）左右，血壓波形消失證明造模成功，開放時以股動脈波形迅速恢復(fù)為準(zhǔn)。22 min后，抽空球囊恢復(fù)水平體位，耳緣靜脈注入魚精蛋白（1 mg魚精蛋白中和100 U肝素鈉），縫合股動脈穿刺處。分別于阻斷前10 min和阻斷后15 min做動脈血氣分析。術(shù)畢肌注慶大霉素40000 IU預(yù)防感染，送回籠中飼養(yǎng)。

動物分組及處理方案：采用計算機(jī)隨機(jī)數(shù)法將實驗動物分為9組：假手術(shù)組（n=6）只置入球囊不阻斷；脊髓缺血再灌注家兔48只，缺血時間22 min，再灌注時間分為8個時間點，分為再灌注0 h組、再灌注1 h組、再灌注2 h組、再灌注3 h組、再灌注8 h組、再灌注24 h組、再灌注48 h組和再灌注72 h組，每組6只。分別在再灌注后0 h、1 h、2 h、3 h、8 h、24 h、48 h、72 h處死動物檢測相應(yīng)指標(biāo)。

神經(jīng)功能評分：所有動物于再灌注后4 h、8 h、24 h、48 h、72 h由不了解分組情況的觀察者進(jìn)行神經(jīng)功能評分，兔后肢運動功能評分采用Jacobs法[6]：0分：后肢完全癱瘓；1分：后肢嚴(yán)重癱瘓，針刺有反應(yīng)；2分：后肢可支撐行走但無法跳躍；3分：可齊足跳但伴共濟(jì)失調(diào)；4分：可奔跑但有輕微共濟(jì)失調(diào)；5分：完全正常。由于術(shù)后麻醉作用基本在3 h后消除，48只脊髓缺血再灌注家兔在再灌注后0 h、1 h、2 h、3 h不做評分。

標(biāo)本取材[7]：經(jīng)左心室注入冰鹽水灌洗后取出脊髓，L3-4節(jié)段脊髓置于4℃，4%多聚甲醛中固定，備行石蠟包埋后切片做HE染色及免疫組化。L4-5節(jié)段脊髓放于-80℃冰箱中保存，進(jìn)行蛋白免疫印跡法（western blot）檢測。

脊髓組織病理學(xué)觀察及前角運動神經(jīng)元計數(shù)：HE染色并采用盲法由不了解分組情況的觀察者在200倍光鏡下觀察脊髓組織病理學(xué)改變。光鏡下正常脊髓神經(jīng)元清晰，多極性，細(xì)胞質(zhì)中可見尼氏小體。損傷及壞死神經(jīng)元表現(xiàn)為細(xì)胞核固縮、碎裂、溶解，尼氏體消失。每個脊髓節(jié)段隨機(jī)抽取3張切片，沿中央導(dǎo)水管水平線以前計數(shù)前角正常神經(jīng)元數(shù)目并取3張切片平均值。

脊髓組織原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)（TUNEL）檢測細(xì)胞凋亡程度：采用TUNEL檢測試劑盒（Roche，德國）進(jìn)行染色，顯微鏡下觀察細(xì)胞核中有棕褐色顆粒者為陽性細(xì)胞。由不了解分組情況的觀察者在200倍光鏡下觀察，每個脊髓節(jié)段隨機(jī)抽取3張切片計數(shù)凋亡神經(jīng)元，每組6只動物。

免疫組化法觀察小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化：采用SP法染色，一抗為離子鈣結(jié)合接頭分子1（ionized calcium-binding adaptor molecule 1，Iba-1）羊多抗（abcam，英國），以試劑公司提供的免疫組化圖片為陽性對照，呈棕黃色的小膠質(zhì)細(xì)胞為陽性細(xì)胞，每只家兔選一張切片在高倍鏡下（×400）隨機(jī)選取5個不同視野計算陽性積分光密度值。

Western blot 檢測蛋白表達(dá)：剪碎標(biāo)本，裂解，冰上勻漿，離心取上清液，測定蛋白質(zhì)濃度，按每個電泳孔道加入50 μg蛋白混合樣品進(jìn)行聚丙烯酰氨凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜。先后加入一抗IL-6、IL-10、Iba-1（abcam，英國，稀釋度1：1000）及NF-κB[天德悅（北京）生物科技公司，中國，稀釋度1：2000]和羊抗兔或羊抗鼠二抗（稀釋度1：10000）進(jìn)行雜交。應(yīng)用圖像分析軟件Total lab quant分析各電泳條帶的蛋白含量。

統(tǒng)計學(xué)方法：樣本量運用NCSS-PASSv11.0.7進(jìn)行估算，結(jié)果為每組6只（各組監(jiān)測指標(biāo)差異20%，power=90%，P＜0.05）；采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，運動功能評分采用中位數(shù)（P25，P75）表示。參數(shù)檢驗采用完全隨機(jī)設(shè)計的單因素方差分析統(tǒng)計；非參數(shù)檢驗采用非參數(shù)秩和Kruskal-Wallis法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。脊髓缺血再灌注后Iba-1表達(dá)水平分別與IL-6，IL-10，NF-κB進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析，P＜0.01為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1各組兔的生理參數(shù)及動脈血氣分析結(jié)果比較（表1、2）

除假手術(shù)組外的各組阻斷后5 min遠(yuǎn)端血壓與同組阻斷前比較明顯降低（P＜0.05）。各組兔阻斷前、后的其他生理參數(shù)值在組內(nèi)、組間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；各組兔阻斷前10 min和再灌注后15 min的血氣分析結(jié)果組內(nèi)、組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 各組兔的生理參數(shù)值比較

表1 各組兔的生理參數(shù)值比較

注：與同組阻斷前比*P＜ 0.05。1 mmHg=0.133 kPa

?

表2 各組兔在阻斷前10 min和再灌注后15 min的動脈血氣分析結(jié)果比較（

表2 各組兔在阻斷前10 min和再灌注后15 min的動脈血氣分析結(jié)果比較（

注： 1 mmHg=0.133 kPa

再灌注72 h組(n=6)血酸堿度阻斷前10 min 7.38±0.04 7.37±0.06 7.40±0.03 7.40±0.08 7.38±0.02 7.39±0.04 7.41±0.03 7.36±0.02 7.37±0.04再灌注后15 min 7.38±0.04 7.39±0.06 7.40±0.03 7.40±0.05 7.41±0.07 7.41±0.08 7.43±0.09 7.39±0.05 7.37±0.04動脈血氧分壓 (mmHg)阻斷前10 min 87±3.6 84±3.9 86±2.1 86±4.5 88±3.4 89±6.1 85±4.3 84±2.2 85±3.1再灌注后15 min 87±4.0 83±4.6 86±1.6 87±5.2 87±6.2 87±5.5 83±4.4 84±2.1 83±3.2動脈血二氧化碳分壓 (mmHg)阻斷前10 min 38±2.6 40±4.3 35±3.1 34±2.1 41±5.7 36±2.2 39±5.7 41±4.9 40±5.1再灌注后15 min 38±3.2 39±6.0 35±3.1 35±2.4 40±5.3 35±2.1 40±5.8 43±5.1 40±5.3項目 假手術(shù)組(n=6)再灌注0 h組(n=6)再灌注1 h組(n=6)再灌注2 h組(n=6)再灌注3 h組(n=6)再灌注8 h組(n=6)再灌注24 h組(n=6)再灌注48 h組(n=6)

2.2不同再灌注時間點的兔后肢運動功能評分（表3）

采用Jacobs法，假手術(shù)組均為5分，脊髓缺血再灌注后，隨著時間的推移評分越來越低，各時間點的評分與假手術(shù)組比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），再灌注后24 h、48 h、72 h評分分別與再灌注后4 h相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 不同再灌注時間點的兔后肢運動功能評分（分）

2.3各組兔神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞組織學(xué)變化及凋亡情況比較（圖1）

假手術(shù)組脊髓前角神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)元胞質(zhì)可見尼氏小體，核仁清楚。隨著再灌注時間延長，正常神經(jīng)元數(shù)量逐漸減少，體積縮小，細(xì)胞外空泡增多，膠質(zhì)細(xì)胞向損傷區(qū)聚集。再灌注72 h組正常神經(jīng)元數(shù)目與其他各組比均明顯減少（P＜0.05）。假手術(shù)組不存在TUNEL陽性細(xì)胞，其他8組均存在TUNEL陽性細(xì)胞，再灌注3 h組脊髓前角開始出現(xiàn)散在凋亡神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，再灌注8 h組凋亡神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞增多，再灌注24 h組凋亡神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞最多，之后逐漸減少。

2.4各組兔損傷節(jié)段脊髓切片Iba-1免疫組化結(jié)果（圖2）

假手術(shù)組Iba-1陽性細(xì)胞少，包體細(xì)小呈橢圓形，多分支；再灌注2 h組的Iba-1陽性細(xì)胞開始增多，形態(tài)改變不明顯，再灌注8 h組Iba-1陽性細(xì)胞增生達(dá)到高峰，胞體變大變圓，突起減少或消失，呈阿米巴樣，染色加深并聚集在神經(jīng)元周圍，再灌注72 h組的Iba-1陽性細(xì)胞數(shù)量下降。

2.5Western blot檢測結(jié)果（圖3）

假手術(shù)組Iba-1蛋白低表達(dá)，再灌注2 h組Iba-1表達(dá)開始增多，再灌注8 h組達(dá)到高峰，再灌注72 h組明顯減少。假手術(shù)組NF-κB蛋白幾乎無表達(dá)，再灌注3 h組NF-kB表達(dá)量明顯上升，再灌注8 h組NF-κB蛋白表達(dá)達(dá)高峰，之后下降，但仍明顯高于假手術(shù)組。假手術(shù)組IL-6蛋白表達(dá)低，再灌注3 h組IL-6表達(dá)開始增多，再灌注24 h組IL-6表達(dá)達(dá)高峰，之后下降。假手術(shù)組IL-10蛋白表達(dá)低，再灌注后IL-10呈上升趨勢，再灌注24 h組IL-10蛋白表達(dá)量最多，顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05）。

圖1 兔損傷節(jié)段脊髓切片HE、TUNEL染色結(jié)果（×200）及神經(jīng)元計數(shù)結(jié)果

2.6兔脊髓缺血再灌注后Iba-1與NF-κB、IL-6、IL-10蛋白表達(dá)隨再灌注時間變化的關(guān)系（圖4）

脊髓缺血再灌注后Iba-1與NF-κB、IL-6及IL-10呈相近的變化趨勢。Iba-1與NF-κB從再灌注后2 h開始明顯升高，8 h達(dá)到高峰。IL-6從再灌注后1h開始明顯升高，IL-10于再灌注后1 h開始緩慢上升，最后均于24 h達(dá)到高峰。

圖2 兔損傷節(jié)段脊髓切片Iba-1染色結(jié)果（×200）

圖3 兔脊髓缺血再灌注后Iba-1、NF-κB、IL-6、IL-10的表達(dá)水平

圖4 兔脊髓缺血再灌注后Iba-1與NF-κB、IL-6、IL-10蛋白表達(dá)隨再灌注時間變化的關(guān)系

3 討論

腦缺血再灌注后即刻后處理可以減少神經(jīng)功能損傷和神經(jīng)元死亡[8]，而延遲后處理同樣有神經(jīng)保護(hù)作用[9]。本研究前期發(fā)現(xiàn)再灌注1 h行氙氣后處理能降低大鼠脊髓神經(jīng)元的凋亡數(shù)量[10]，說明神經(jīng)元存在延遲性死亡的現(xiàn)象，可能有多種因素在不同時間段分別介導(dǎo)神經(jīng)元的死亡。小膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)固有的炎性細(xì)胞，MC的增殖和活化會產(chǎn)生細(xì)胞毒性[11]，可能是促使神經(jīng)元死亡的因素之一。觀察SCIR后MC及炎癥因子的變化對了解延遲后處理的脊髓保護(hù)機(jī)制及把握干預(yù)時機(jī)有重要意義。

脊髓損傷可使小膠質(zhì)細(xì)胞激活[12]，MC參與損傷后的炎癥反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，再灌注3 h后MC明顯增生，8 h達(dá)到高峰，細(xì)胞變圓變大，呈阿米巴樣，染色加深，24～48 h仍呈激活態(tài)。激活后的MC可能產(chǎn)生IL-6、IL-1、TNF-α等有害因子造成組織損傷，抑制MC將明顯降低脊髓缺血再灌注損傷[4,13]。

脊髓缺血再灌注損傷可使炎癥因子水平升高，如IL-6在小鼠脊髓缺血再灌注后表達(dá)明顯增高并于36 h到達(dá)頂峰[14]，IL-10也有所上升。本研究中IL-6從2 h開始顯著升高，24 h達(dá)到高峰，IL-10同樣在24 h達(dá)到高峰。目前，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為促炎癥因子IL-6的釋放對脊髓組織有不利影響。Hasturk等[15]指出脊髓缺血后促炎因子如IL-6的升高與組織損傷有關(guān)，其實驗中炎性細(xì)胞因子的升高與脊髓出血、神經(jīng)元減少等病理損害并行出現(xiàn)。而IL-10的升高可能由于缺血激活了機(jī)體的內(nèi)源性保護(hù)反應(yīng)所致[16]。

MC的炎癥反應(yīng)過程與細(xì)胞內(nèi)多種調(diào)節(jié)通路有關(guān)，目前認(rèn)為NF-κB是該過程中最為重要的介導(dǎo)分子。非激活狀態(tài)下，NF-κB與抑制蛋白IκB結(jié)合存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)存在損傷因素時，IκB磷酸化并脫離復(fù)合物，活化的NF-κB借助暴露出來的核定位信號轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，與相應(yīng)靶序列結(jié)合，調(diào)節(jié)相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄活性。有研究表示，NF-κB可能調(diào)控著MC中IL-6的表達(dá)[17]，本研究發(fā)現(xiàn)，SCIR損傷后NF-κB于再灌注后3 h開始上升，8 h達(dá)到高峰，而IL-6、IL-10表達(dá)整體稍晚。將Iba-1分別與IL-6，IL-10及NF-κB進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)三者在脊髓缺血再灌注后的表達(dá)規(guī)律均與MC有相關(guān)性，其中NF-κB（r=0.71）和IL-6（r=0.72）的表達(dá)趨勢與MC相關(guān)性很高，說明SCIR損傷后MC的確可能通過NF-κB介導(dǎo)了IL-6、IL-10等炎癥因子的釋放。

活化MC介導(dǎo)炎癥因子釋放可能促進(jìn)了神經(jīng)元的凋亡。本研究中，Iba-1于再灌注8 h達(dá)到高峰，8 h后我們觀察到兔后肢運動功能評分逐漸下降，脊髓前角正常神經(jīng)元數(shù)量比假手術(shù)組明顯減少，凋亡神經(jīng)元比假手術(shù)組明顯增多，并與炎性因子均在24 h達(dá)到高峰，這可能是MC激活對神經(jīng)元產(chǎn)生損害作用的原因之一。因此，MC可能參與了脊髓組織損傷后神經(jīng)元凋亡的過程，如果在MC激活前進(jìn)行后處理干預(yù)，抑制MC激活則能夠減少神經(jīng)元凋亡的數(shù)量，對脊髓形成保護(hù)作用。

[1] Li Y, Si R, Feng Y, et al. Myocardial ischemia activates an injurious innate immune signaling via cardiac heat shock protein 60 and Tolllike receptor 4. J Biol Chem, 2011, 286: 31308-31319.

[2] 彭靜, 楊貴芳, 彭文, 等. 主動脈夾層免疫炎癥機(jī)制研究進(jìn)展. 中國循環(huán)雜志, 2015, 30: 924-925.

[3] Pineau I, Lacroix S. Proinflammatory cytokine synthesis in the injured mouse spinal cord: multiphasic expression pattern and identification of the cell types involved. J Comp Neurol, 2007, 500:267-285.

[4] Smith PD, Bell MT, Puskas F, et al. Preservation of motor function after spinal cord ischemia and reperfusion injury through microglial inhibition. Ann Thorac Surg, 2013, 95: 1647-1653.

[5] Watanabe K, Kawaguchi M, Kitagawa K, et al. Evaluation of the neuroprotective effect of minocycline in a rabbit spinal cord ischemia model. J Cardiothorac Vasc Anesth, 2012, 26: 1034-1038.

[6] Jacobs TP, Shohami E, Baze W, et al. Deteriorating stroke model: histopathology, edema, and eicosanoid changes following spinal cord ischemia in rabbits. Stroke, 1987, 18: 741-750.

[7] 劉詩瑤, 侯思雨, 楊彥偉, 等. 氙氣延遲后處理誘導(dǎo)蛋白激酶B信號通路活化對大鼠脊髓缺血再灌注損傷的保護(hù)作用. 中國循環(huán)雜志, 2015, 30: 498-502.

[8] Rehni AK, Singh N. Role of phosphoinositide 3-kinase in ischemic postconditioning-induced attenuation of cerebral ischemia-evoked behavioral deficits in mice. Pharmacol Rep, 2007, 59: 192-198.

[9] Burda J, Danielisova V, Nemethova M, et al. Delayed postconditionig initiates additive mechanism necessary for survival of selectively vulnerable neurons after transient ischemia in rat brain. Cell Mol Neurobiol, 2006, 26: 1141-1151.

[10] Yang YW, Cheng WP, Lu JK, et al. Timing of xenon-induced delayed postconditioning to protect against spinal cord ischaemia-reperfusion injury in rats. Br J Anaesth, 2014, 113: 168-176.

[11] Tikka T, Fiebich BL, Goldsteins G, et al. Minocycline, a tetracycline derivative, is neuroprotective against excitotoxicity by inhibiting activation and proliferation of microglia. J Neurosci, 2001, 21: 2580-2588.

[12] Matsumoto S, Matsumoto M, Yamashita A, et al. The temporal profile of the reaction of microglia, astrocytes, and macrophages in the delayed onset paraplegia after transient spinal cord ischemia in rabbits. Anesth Analg, 2003, 96: 1777-1784.

[13] Cho DC, Cheong JH, Yang MS, et al. The effect of minocycline on motor neuron recovery and neuropathic pain in a rat model of spinal cord injury. J Korean Neurosurg Soc, 2011, 49: 83-91.

[14] Smith PD, Puskas F, Meng X, et al. The evolution of chemokine release supports a bimodal mechanism of spinal cord ischemia and reperfusion injury. Circulation, 2012, 126(11 Suppl): S110-S117.

[15] Hasturk A, Atalay B, Calisaneller T, et al. Analysis of serum proinflammatory cytokine levels after rat spinal cord ischemia/reperfusion injury and correlation with tissue damage. Turk Neurosurg, 2009, 19:353-359.

[16] Fan L, Wang K, Shi Z, et al. Tetramethylpyrazine protects spinal cord and reduces inflammation in a rat model of spinal cord ischemiareperfusion injury. J Vasc Surg, 2011, 54: 192-200.

[17] Lu DY, Tang CH, Yeh WL, et al. SDF-1alpha up-regulates interleukin-6 through CXCR4, PI3K/Akt, ERK, and NF-kappaB-dependent pathway in microglia. Eur J Pharmacol, 2009, 613: 146-154.

Investigation of Microglia Activation and Inflammatory Cytokine Changes in Experimental Rabbits After Spinal Cord Ischemia Reperfusion

WANG Yun-lu, TIAN Lei, LIU Shi-yao, MA Zhi-gao, HOU Si-yu, YANG Yan-wei, LI Hui-xian, JIN Mu, DONG Xiu-hua, LU Jia-kai, CHENG Wei-ping.
Department of Anesthesiology, Beijing Anzhen Hospital and Beijing Institute of Heart, Lung and Blood Vessel Diseases, Capital Medical University, Beijing (100029), China

CHENG Wei-ping, Email: ch_eng9735@sina.com

Objective: To observe the activation of microglia and the changing rule of inflammatory cytokine as IL-6, IL-10 and nuclear factor-κB (NF-κB) in experimental rabbits after spinal cord ischemia reperfusion (SCIR) injury in order to provide theoretical basis for post-conditioning time.

Methods: Rabbit SCIR injury model was established by thoracic aorta balloon occlusion. 54 New Zealand male adult white rabbits were divided into 9 groups: Sham group (the animals received balloon implantation without occlusion), SCIR-0h group (reperfusion was conducted at 0 hour of spinal cord ischemia), SCIR-1h, -2h, -3h, -8h, -24h, -48h and -72h groups. n=6 in each group. The number of normal and apoptosis neurons, the levels of Iba-1, IL-6, IL-10 and NF-κB in spinal tissue were examined and compared among different groups respectively.

Results: The number of normal neuron was decreasing with the extended reperfusion time, TUNEL-positive neuron began to increasing in SCIR-8h group and the peak was reached in SCIR-24h group. The expression of Iba-1 began toelevating in SCIR-2h group and the peak was obtained in SCIR-8h group; NF-κB began to rising in SCIR-3h group and the peak was observed in SCIR-8h group; both IL-6 and IL-10 arrived the peak in SCIR-24h group. The expressions of NF-κB, IL-6 and IL-10 were positively related to Iba-1 level.

Conclusion: Microglia activation had dynamic changes in experimental SCIR rabbits and the expression levels of NF-κB, IL-6 and IL-10 were positively to microglia activation; post-conditioning time at front and back to microglia activation may reduce neuron injury.

Reperfusion injury; Microglia cell; Inflammatory Chemokine

(Chinese Circulation Journal, 2017,32:395.)

2016-10-13）

（編輯：許菁）

國家自然科學(xué)基金（面上項目81271387）；國家衛(wèi)生和計劃生育委員會：公益性行業(yè)科研專項項目（201402009）

100029 北京市，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院 北京市心肺血管疾病研究所 麻醉科

王昀璐 碩士研究生 研究方向:心血管麻醉及圍術(shù)期臟器功能保護(hù) Email:Wang_YL073@163.com 通訊作者：程衛(wèi)平Email: ch_eng9735 @sina.com

R54

A

1000-3614（2017）04-0395-06

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.04.020