苦玄參40個株系表型性狀遺傳多樣性分析

摘要： 植物遺傳多樣性一直以來是種質資源研究的熱點。為揭示苦玄參栽培種質的遺傳多樣性，該研究從苦玄參常年栽培種中根據形態(tài)學性狀差異選擇40個株系，以產量、藥效物質含量及莖、葉、花等形態(tài)學性狀為指標，進行物種變異和遺傳多樣性分析，并對其進行聚類分析，獲取各株系遺傳親緣關系。結果表明：苦玄參苷IA和IB含量的遺傳變異系數(shù)較高，分別為24.225%和17.853%；遺傳多樣性指數(shù)高，分別為1.920和2.075。產量遺傳變異系數(shù)較低，僅為3.637%，但遺傳多樣性指數(shù)較高，達到1.884。其余表型性狀指標遺傳變異系數(shù)均較高，其中花色高達127.794%。數(shù)值型性狀具有較高的遺傳多樣性，均大于1，但描述型指標遺傳多樣性指標較低，均小于1。聚類分析可將供試材料分為4個大的類群：第Ⅰ類群共有7個株系，此類群產量性狀及相關指標平均數(shù)較高；第Ⅱ類群有8個株系，莖節(jié)長度最長，其余指標中等偏下；第Ⅲ類群數(shù)量最多，有20個株系，各指標均較低；第Ⅳ類群有5個株系，苦玄參苷含量和產量均較高，綜合指標比較優(yōu)。相關分析結果表明，苦玄參苷IA的含量與葉緣性狀具有顯著相關，產量性狀與莖節(jié)長度、一級分枝和末級分枝數(shù)具有極顯著相關，選擇優(yōu)良種質應注重該4個性狀的選擇。該研究結果表明目前苦玄參栽培種具有廣泛的變異和較高的遺傳多樣性，為苦玄參資源的利用提供了參考依據。

關鍵詞： 苦玄參， 表型性狀， 變異， 遺傳多樣性， 聚類分析

中圖分類號： Q943.1

文獻標識碼： A

文章編號： 10003142（2017）03034808

Abstract： Plant genetic diversity has been one of the hot spots in the research into germplasm resources. To disclose the genetic diversity of cultivated germplasm of Picria felterrae， we selected 40 lines from perennially cultivated individuals based on morphological differences and analyzed species variation and genetic diversity with yield， active ingredient content as well as morphological characters including the stem， leaf and flower as the indicator； and wemade cluster analysis to obtain the genetic relationships between lines. The results showed that there was much genetic variance in the content of picfeltarraenins IA and IB， the coefficients being 24.225% and 17.853%， respectively； and the genetic diversity indexes were high， 1.920 and 2.075， respectively. For the yield， the coefficient of genetic variance was comparatively low， only 3.637%， and the genetic diversity index was 1.884. There was also much genetic variance in other phenotypic characters， among which the coefficient of genetic variance of flower color was 127.794%. All genetic diversity indexes for numerical characters were higher than one while those for descriptive characters were lower than one. The test materials were divided into four groups in the cluster analysis： Group Ⅰ consisted of seven lines which had a high yield and related indexes on average； Group Ⅱ included eight lines which had the longest stem nodes and whose other indexes were at or below the moderate level； Group Ⅲ comprised 20 lines with low indexes in all respects； and Group IV included five lines， all of which were high in yield and content of picfeltarraenins and had a better integrated index. The correlation analysis showed that the content of picfeltarraenin IA was significantly related to leaf margin characters， and the yield was significantly correlated to stem node length and primary and final branching numbers， so the above four characters should be given priority when selecting the best germplasm. The results indicate that extensive variation and high genetic diversity are present in current cultivated individuals of Picria felterrae， which can be used as a reference for the utilization of resources of that species.

Key words： Picria felterrae， phenotypic character， variation， genetic diversity， cluster analysis

苦玄參（Picria felterrae）是玄參科苦玄參屬唯一的一種植物，是中國藥典收錄的中藥材之一，具有重要的藥理作用（Dalimunthe et al， 2015；Lestari et al， 2015；Shi et al， 2016），在廣西作為藥用已有200 多年的歷史（蔣妮等，2013），是婦炎凈膠囊、萬通炎康片等知名中成藥的主要原料藥材之一?？嘈⒅饕乃幱没钚晕镔|為苦玄參苷IA和IB（王力生等，2004），其含量的多少是評價苦玄參藥材優(yōu)劣的重要指標。由于苦玄參野生資源隨著環(huán)境的破壞越來越少，不能滿足企業(yè)對藥材的需求，苦玄參藥材來源主要以人工種植為主。目前人工種植的苦玄參仍未經純化，品種混雜，質量不一；同時，與野生材料相比，苦玄參經人工種植后種質退化，藥材質量下降，因此通過各種途徑選育品種純度和藥材質量均高的優(yōu)良種質非常必要。藥材質量主要由基因型決定，同時受環(huán)境條件的影響，并表現(xiàn)為不同的表型特征。因此，植物品種改良是保證人工種植藥材質量的關鍵，而通過表型選擇進行品種改良是植物遺傳改良最傳統(tǒng)的方法（劉忠松，2014）。

遺傳多樣性分析最傳統(tǒng)的手段即是表型性狀變異的分析。植物表型變異是一個傳統(tǒng)的研究領域，它能夠使人們初步了解不同類群遺傳變異情況，廣泛用于居群遺傳變異及表型特征的研究（馬麒等，2016）。植物的表型變異往往與其對環(huán)境的適應性和進化關系有關，如葉片表皮毛、晶體、蠟質等對干旱氣候的適應（朱廣龍等，2015）、株形變化對抗倒伏的適應等（劉暢和李來庚，2016），因此，表型的變異有助于對生物適應性及隨之而引起的遺傳變異的了解。通過環(huán)境選擇，植物基因組成會產生變異，其表型特征也將產生差異，其中表型差異與品種具有一定的相關性，因此可以通過與質量性狀相關聯(lián)的表型性狀選擇優(yōu)良種質（熊厚溪等，2014）。目前苦玄參栽培種質來源不明，遺傳基礎研究薄弱，對其遺傳多樣性進行研究，可為苦玄參資源的評價提供基礎，為苦玄參遺傳改良提供依據。目前苦玄參種質的遺傳多樣性仍未見公開報道，因此有必要對其進行研究，以解決苦玄參種質資源問題。試驗擬從苦玄參主產區(qū)選擇40個株系，根據其表型性狀差異，分析其品質性狀苦玄參苷IA、IB及產量與其它表型性狀的相關性，分析各表型性狀的變異度和遺傳多樣性，并基于各表型性狀對40個單株進行聚類，明確其遺傳親緣關系，為了解苦玄參遺傳特性及篩選遺傳改良材料提供基礎和依據。

1材料與方法

1.1 材料

2014年8月于苦玄參常年種植區(qū)廣西龍州和梧州，根據花、葉、莖的形態(tài)學性狀差異，選擇78個株系，記錄其形態(tài)學性狀特征，并采集種子用于后續(xù)試驗。苦玄參為雌雄同株，自花授粉植物，基于自花授粉植物經數(shù)代自交后趨于純合，自交時較少出現(xiàn)分離，其后代的表型性狀基本能反應親本性狀，且考慮到大田選擇單株時，苦玄參生長環(huán)境的差異對品質性狀（產量和苦玄參苷含量）會有一定影響，因此，為消除環(huán)境影響，收集的材料將于南寧統(tǒng)一種植后再測定所有表型性狀。

1.2 儀器與試劑

儀器：Agilent 1260高效液相色譜儀[包括四元低壓梯度泵，二極管陣列檢測器（DAD），HP化學工作站（Agilent）]。試劑：乙腈（色譜純試劑），甲醇（分析純試劑），水（超純水，自制）。

色譜條件：色譜柱為Agilent ZORBAX SBC18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流動相為乙腈∶水（35∶65）；檢測波長為264 nm；柱溫為35 ℃；流速為1.0 mL·min1。

標準品：苦玄參苷IA和IB，購于中國藥品生物制品檢定所；測試時制成混合標準溶液。

1.3 方法

1.3.1 田間試驗2015年于南寧進行，3月播種，采用水培法種植，水培裝置為定制的方形PVC水管，內徑20 cm，長度110 cm，孔徑8 cm，每個培養(yǎng)箱22個孔徑（株），每個株系設3次重復，每個重復22株（1個水培箱）。營養(yǎng)液為改良的霍格蘭氏營養(yǎng)液，每15 d更換一次，水泵驅動水循環(huán)解決供氧問題。

1.3.2 農藝性狀考察2015年8月苦玄參盛花期，經過觀察，剔除出現(xiàn)了較明顯分離的株系，從剩下的株系中隨機選取40個株系，從各株系的每個重復中隨機抽取5株，觀察其形態(tài)學性狀：花色、莖色、莖節(jié)長、分枝數(shù)、葉脈深淺、葉緣平尖、葉基平整性等；各株系如有極少數(shù)子代性狀不一致的，以90%以上性狀相同的子代及參考母株性狀確定所屬株系的特征。記錄形態(tài)學性狀后，取全株懸掛陰干，測平均干物質重量；粉碎過20目篩，用于測定苦玄參苷IA和IB的含量。

1.3.3 指標測定方法（1）莖長：莖節(jié)間的平均長度，為主莖長度加第一分枝長度除以總節(jié)數(shù)，采用卷尺測量。（2）葉片性狀：取主莖倒第二節(jié)上的葉片進行觀察。（3）干物重：隨機抽取的5株苦玄參陰干后的平均重量。（4） 苦玄參苷IA和IB含量測定方法：參照中國藥典2010版高效液相色譜法并進行優(yōu)化。

待測樣品提取和測定：60%甲醇，超聲提取30 min，0.45 μm微孔濾膜過濾，用60%的甲醇補足失去的重量。與標準溶液采用同樣的色譜條件測定，外標一點法計算樣品的含量。

1.3.4 數(shù)據統(tǒng)計分析將花色、莖色、葉形、葉脈深淺、葉緣形狀、葉基對稱性等描述型性狀進行賦值處理（表1），對數(shù)量性狀進行質量化處理，根據其平均值（x）和標準差（s）將供試材料劃分為10級，從第1級 [Xi <（x-2s）]到第10級 [Xi>（x+2s）]，中間每隔0.5s為1級（表2），依據每一級的相對頻率計算多樣性指數(shù)，公式：

H′=-ΣPilnPi式中，H′為多樣性指數(shù)，Pi表示第i個級別的出現(xiàn)頻率，ln為自然對數(shù)（王瑾等，2015）。

所有數(shù)據進行標準化轉換后，利用SPSS13.0軟件對其進行相關分析和聚類分析。聚類分析距離測量選擇平方歐式距離（Squared euclidean distance），聚類方式選擇組間平均連鎖距離法（Betweengroups linkage），將距離最近的兩個樣品合并為一類。

2結果與分析

2.1 苦玄參表型性狀遺傳多樣性

苦玄參主要品質性狀由主要藥效物質含量和生物產量組成， 其中主要藥效物質為苦玄參苷IA和IB。

40個株系苦玄參苷含量及干物質產量統(tǒng)計結果見表3，各表型性狀變異系數(shù)和遺傳多樣性指數(shù)見表4和表5。由表3可知，40個株系的苦玄參苷IA、IB及平均單株干物質產量之間具有顯著差異。表4和表5顯示，三個品質性狀中苦玄參苷IA和IB含量具有最高的變異，平均單產的變異系數(shù)較低，其結果說明藥效物質苦玄參苷含量具有較大的遺傳改良潛力，品質改良可優(yōu)先考慮苦玄參苷含量性狀的改良。除三個品質性狀外，其余幾個數(shù)值型性狀及描述型性狀的變異系數(shù)均較高，表明各株系間各性狀均具有較高的變異。遺傳多樣性方面，除一級分枝外，幾個數(shù)值型性狀均具有較高的遺傳多樣性，其中苦玄參苷IB的遺傳多樣性最高，其次為苦玄參苷IA；幾個描述型性狀的遺傳多樣性均較低。其結果表明針對苦玄參苷含量性狀的品質改良具有較好的遺傳基礎。

2.2 苦玄參表型性狀相關性

由表6可知，苦玄參苷IA的含量與葉緣性狀具有顯著負相關，葉片葉緣鋸齒較圓的苦玄參苷IA含量較高，表明葉形可作為篩選高苦玄參苷IA含量優(yōu)良種質的一個參考指標?？嘈④誌B的含量與任何表型性狀的相關性均較低。產量性狀與莖節(jié)長度成極顯著負相關，與一級分枝和末級分枝數(shù)成極顯著正相關，表明高產株系可通過株型進行選擇，其中莖節(jié)較短、分枝較多的株系，其生物產量較高。

2.3 各株系聚類分析結果

選擇平方歐式距離和組間平均連鎖距離法對40個株系進行聚類分析，結果見圖1，各類群數(shù)量及表型性狀平均值見表7。由圖1可知，40個株系可分成4個大的類群：第Ⅰ類群共有7個株系，此類群產量性狀及與產量相關的指標平均數(shù)均較高。第Ⅱ類群有8個株系，莖節(jié)長度最長，其余指標中等偏下。第Ⅲ類群數(shù)量最多，有20個株系，品質指標數(shù)值均較低。第Ⅳ類群有5個株系，苦玄參苷含量、產量及與產量相關的品質指標均較高，綜合指標比較優(yōu)。

3討論

3.1 苦玄參栽培種質資源多樣性水平

種質資源是作物育種的基礎，種質資源庫越豐富，可供選擇的優(yōu)良種質越多。而遺傳多樣性是種質資源研究的重要內容之一。目前，苦玄參種質資源的相關研究仍未進行，其種質資源的物種變異和遺傳多樣性尚不明確，因此，對苦玄參資源遺傳多樣性進行研究，可為了解苦玄參種質資源概況提供參考，為苦玄參優(yōu)良種質的篩選和品種的遺傳改良提供依據，對苦玄參栽培質量的提高具有重要意義?？嘈⑷斯しN植區(qū)域主要有廣西梧州和龍州，經民間調查，廣西梧州種植的品種為20世紀50年代由龍州引入，龍州種則經由野生種質馴化而來，一直以來未經品種純化。經過多年的種植，苦玄參種質可能發(fā)生了較大變異。本研究結果顯示，兩個種植區(qū)域的栽培種質存在較大的變異和較高的遺傳多樣性，這應該與苦玄參種植多年未進行品種純化且?guī)捉浺N異地種植有關。其中，苦玄參數(shù)量性狀的變異沒有描述型性狀（主要為質量性狀）的高，但遺傳多樣性高于描述型性狀，這與馬麒等（2016）關于海島棉遺傳規(guī)律的研究結果相符， 其原因可能與質量性狀遺傳變異的不連續(xù)性及數(shù)量性狀遺傳變異的連續(xù)性有關。

3.2 基于表型性狀的苦玄參栽培種質的親緣關系

種質資源親緣關系的分析是建立育種群體的基礎，一般來說，親緣關系越遠，遺傳距離越大，其性狀變異越大，育種資源越豐富（胡標林等，2012）。因此，分析苦玄參種質資源親緣關系，確定不同種質遺傳距離，對苦玄參育種群體的建立和育種親本的選擇具有重要意義。利用表型性狀進行聚類分析，是遺傳群體親緣關系分析的重要手段。本研究對苦玄參40個株系的聚類分析發(fā)現(xiàn)，苦玄參40個株系可分成4個大的類群，每一個類群之間其品質性狀存在較大差異，這對苦玄參品質育種群體的構建具有重要意義，可為高品質苦玄參種質的選育提供優(yōu)異的遺傳資源。

3.3 基于表型性狀分析遺傳多樣性的優(yōu)與劣

表型性狀可通過外部觀察直接獲取，因此，在植物遺傳育種（劉忠松，2014；耿慧等，2013）、植物群體分類（馬麒等，2016）、品種歸類（王瑾等，2015）、初級種質庫構建（鄭軼琦等，2014）中有大量的應用。同時，基于表型性狀的遺傳多樣性分析也仍是目前植物遺傳多樣性研究的主要方法（馬麒等，2016；胡標林等，2012）。但由于表型是基因型與環(huán)境互作的結果，不同的表型性狀受環(huán)境影響大，因此，通過表型性狀分析遺傳多樣性具有一定的局限性。相比來說，基于分子標記的遺傳多樣性分析更為準確，也將是未來遺傳多樣性分析將采取的主要手段（劉忠松，2014；李東霞等，2015）?？嘈⑦z傳分類仍未見公開報道過，在進行基因遺傳多樣性研究之前，先進行表型遺傳多樣性研究，可為基因遺傳多樣性提供參考。

此外，苦玄參分布于廣西、云南、廣東、貴州等熱帶亞熱帶地區(qū) （李玲和金李峰，2016），分布區(qū)氣候和土壤范圍具有一定的寬度，種質變異明顯，遺傳基礎豐富。本研究僅對目前栽培種質中的部分株系進行了遺傳多樣性分析，選材具有一定的局限性。為豐富苦玄參遺傳改良資源，在今后的研究中有必要對其分布區(qū)的野生資源進行遺傳多樣性分析及資源評價和鑒定研究。

4結論

40個株系苦玄參表型性狀的平均變異系數(shù)為46.32%，平均遺傳多樣性指數(shù)為1.26，說明主產區(qū)苦玄參的表型性狀變異度較高，遺傳多樣性豐富。與產量性狀相比，苦玄參苷含量的變異度較高，具有更高的遺傳改良潛力。三個品質性狀的遺傳多樣性水平均較高，表明苦玄參遺傳改良材料較豐富。由聚類分析結果可知，該主產區(qū)的苦玄參有明顯的類群關系，所試40個株系可被劃分為4個大的類群，并且聚類群之間表現(xiàn)出明顯的品質差異性。試驗通過對該40個株系基于主要表型性狀進行遺傳多樣性和聚類分析，明確了苦玄參種質資源類型及其表型多樣性，對苦玄參遺傳改良具有重要的指導意義。

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