割手密醛脫氫酶ScALDH基因的克隆與表達(dá)分析

摘要： 該研究從甘蔗細(xì)莖野生種（割手密Saccharum spontaneum）中克隆抗旱相關(guān)的基因ScALDH，并分析其在干旱處理?xiàng)l件下的表達(dá)情況和序列特征。利用RTPCR 技術(shù)克隆甘蔗的ALDH基因片段， 并對(duì)其核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行分析。使用NCBI Blastx、ORF finder、Mega、NCBI Conserved Domain Search 等程序?qū)ζ浞謩e進(jìn)行不同物種氨基酸比較、開(kāi)放閱讀框（ORF）尋找、進(jìn)化樹(shù)及保守序列分析，并用 Real TimePCR分析所克隆基因在干旱脅迫前后的表達(dá)差異。結(jié)果表明：克隆出甘蔗的ALDH基因片段， 總長(zhǎng)度為 1 996 bp，其中蛋白質(zhì)編碼區(qū)（CDS）全長(zhǎng)1 524 bp，編碼508個(gè)氨基酸；與其它物種ALDH類(lèi)蛋白氨基酸序列有很高的同源性，有ALDH家族的保守序列，并含有完整的開(kāi)放閱讀框，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示與玉米的蛋白質(zhì)親緣關(guān)系最近；Real timePCR數(shù)據(jù)表明，在干旱脅迫下，隨著干旱時(shí)間的延長(zhǎng)，該基因的表達(dá)量呈持續(xù)積累的表達(dá)模式?？傮w上來(lái)說(shuō)，該基因?qū)Ω珊得{迫顯著表達(dá)。利用RTPCR 技術(shù)克隆的甘蔗ALDH基因，屬于ALDH蛋白家族的一員，具有其典型的功能域，該基因在干旱脅迫過(guò)程中參與抗旱作用。該研究結(jié)果為野生種資源開(kāi)發(fā)、優(yōu)良抗旱親本選擇和培育抗旱性強(qiáng)甘蔗品種提供了參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 割手密， 基因克隆， 序列分析， 干旱脅迫， real timePCR

中圖分類(lèi)號(hào)： Q943

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

文章編號(hào)： 10003142（2017）03038008

Abstract： We cloned a drought resistant ALDH gene with RTPCR gene from Saccharum spontaneum， detected the gene expression level under different drought conditions， and analyzed the nucleotide and amino acid sequences with Blastx， Conserved Domain Search， ORF finder and MEGA. We compared the amino acids among different species， and tried to find reading frames in the sequence， to search conserved Domain and to make evolutionary tree. We analyzed the gene expression level of the cloned gene in drought stress with real timePCR. The total length of the ALDH gene fragment cloned was 1 996 bp， including 1 524 bp coding sequence， which was encoded 508 amino acids. The cloned sequence had a very high homology with other species’ amino acid sequences and had the conserved sequences of ALDH family， a complete open reading frame as well. Phylogenetic tree analysis showed that protein had the closest relationship with corn. The real timePCR data showed that the expression of the gene was expressed in a continuous accumulation mode. On the whole， the gene responds to drought stress. The cloned gene belong to the ALDH protein family， which has its typical function domain. The expression pattern analysis showed that the gene was involved in the process of drought stress. The results of this study aimed at developing the excellent resources of wild species， as well as to explore the drought resistance of these resources. The study provides the basis for the selection of the parents of the fine and drought resistance in the future.

Key words： Saccharum spontaneum， gene cloning， sequence analysis， drought stress， real TimePCR

甘蔗 （Saccharum officinarum）是甘蔗屬、多年生高大實(shí)心草本植物，是熱帶和亞熱帶農(nóng)作物，是制造蔗糖的原料，也是國(guó)計(jì)民生必需品（張華和陳如凱，2003）。除制糖外，其副產(chǎn)品的利用范圍非常廣泛，如生產(chǎn)纖維板和飼料（黃東杰和孫繼華，2012）。此外，一些國(guó)家還把甘蔗作為一種高產(chǎn)的生物能源作物，用全莖制造酒精代替部分化石燃料（趙麗萍等，2010）。發(fā)展甘蔗生產(chǎn)，對(duì)提高人民生活、促進(jìn)農(nóng)業(yè)及相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展都具有重要作用。

目前，干旱對(duì)作物生產(chǎn)有普遍影響，其所造成的產(chǎn)量損失超過(guò)其它各種脅迫因素造成的總和（閆志利和?？×x，2009）。輕度水分脅迫時(shí)甘蔗葉片光合速率有所下降，到中度干旱、嚴(yán)重干旱時(shí)葉片光合速率呈顯著性下降，葉肉細(xì)胞光合能力降低，甘蔗的生理性狀受到較嚴(yán)重影響（羅明珠和梁計(jì)南，2005）。此外，甘蔗在伸長(zhǎng)期的中后期受到干旱脅迫時(shí)，蔗莖的生長(zhǎng)速度明顯降低，植株變矮，單莖重明顯降低（陸國(guó)盈和韓世健，2002）。我國(guó)蔗區(qū)85%以上分布在無(wú)灌溉條件的旱坡地，甘蔗品種的抗旱性很大程度上決定著甘蔗生產(chǎn)的效益（李奇?zhèn)ズ袜嚭ＨA，2011）。甘蔗傳統(tǒng)育種方法主要是利用栽培種/品種與野生種（如割手密）雜交，野生種的抗逆性（抗旱、耐寒）較強(qiáng)，是提高甘蔗品種抗逆性的重要基因源。

醛脫氫酶基因（Aldehyde dehydrogenase， ALDH）是一類(lèi)編碼將醛脫氫氧化為相應(yīng)羧酸的基因，可有效減少醛類(lèi)物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的積累，增加細(xì)胞的抗逆性，減少干旱脅迫對(duì)植物的產(chǎn)生的影響。目前在植物中發(fā)現(xiàn)的ALDH蛋白是一個(gè)大家族，包括14個(gè)家族：ALDH2、ALDH3、ALDH5、ALDH6、ALDH7、ALDH10、ALDH11、ALDH12、ALDH18、ALDH19、ALDH21、ALDH22、ALDH23、ALDH24，其中ALDH11、ALDH19、ALDH22、ALDH23和ALDH24為植物所特有（Zhang et al，2012； Wood Duff.， 2009）。相對(duì)于人類(lèi)、動(dòng)物，植物的乙醛脫氫酶研究來(lái)說(shuō)較少，從植物中克隆到的乙醛脫氫酶家族的基因不是很多。李新玲等（2007）從羊草中克隆出一個(gè)乙醛脫氫酶基因，與從水稻中克隆的ALDH1a家族基因的同源性最高，該基因?qū)}、冷凍、干旱均有響應(yīng)。 楊紅蘭等（2010）成功從齒肋赤蘚克隆了ALDH21家族的基因，其研究得出，該基因在干旱脅迫狀態(tài)時(shí)的表達(dá)量顯著高于水合狀態(tài)，可能參與干旱脅迫應(yīng)答。沈一等（2013）從花生中挖掘出一個(gè)ALDH7基因，發(fā)現(xiàn)該基因在鹽脅迫下，根、葉中的表達(dá)量明顯上升。到目前為止，尚未見(jiàn)在甘蔗野生種印度割手密中克隆出ALDH家族基因的報(bào)道。本研究以甘蔗野生種——印度割手密（2n=64）為材料，克隆到一個(gè)ALDH家族基因，通過(guò)生物信息學(xué)分析和定量 PCR技術(shù)檢測(cè)在干旱脅迫前后基因的誘導(dǎo)情況，旨在開(kāi)發(fā)野生種的優(yōu)良資源，以及探索這些資源的抗旱性，為今后利用優(yōu)良抗旱親本的選擇和培育抗旱性強(qiáng)的甘蔗品種提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1 植物材料及干旱處理

植物材料：印度割手密（2n=64），取材自云南省農(nóng)科院甘蔗所（開(kāi)遠(yuǎn)）的國(guó)家甘蔗資源圃。

干旱處理：供試植物材料種植于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室大棚中，花盆大小在直徑 50 cm，高 30 cm的花盆中，分為四組，對(duì)照組，正常澆水，保持濕潤(rùn)；實(shí)驗(yàn)組，待苗長(zhǎng)到15～20 cm高時(shí)，分別干旱處理2、4、6 d后取葉片提取總RNA。

1.2 試劑

TRNzol A+總RNA提取試劑、FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒、DNA純化回收試劑盒、pLB Vector、T4 DNA Ligase、DNA高保真酶、dNTP、TOP10感受態(tài)細(xì)胞、熒光定量試劑盒SuperReal PreMix Pius ，均購(gòu)自天根生化試劑有限公司。引物合成由Introvigen 公司合成，測(cè)序由擎科生物公司完成。

1.3 總 RNA 提取 與cDNA合成

等到甘蔗在溫室生長(zhǎng)至15～20 cm，剪取葉片，迅速放在液氮中，備用。利用Tigen Trizol試劑盒，提取葉片總RNA（-80 ℃保存）。 用紫外分光光度計(jì)檢測(cè) RNA 濃度，用瓊脂糖電泳檢測(cè) RNA 完整性。后采用Fast Quant RT Super Mix （Tiangen，KR108）試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA 第一鏈。

1.4 ScALDH全長(zhǎng)的克隆

使用天根公司FastQuant RT Super Mix （Tiangen， KR108）快速反轉(zhuǎn)錄形成cDNA ，放入-80 ℃超低溫冰箱備用。利用高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以甘蔗割手密材料cDNA 產(chǎn)物為模板，克隆ScALDH基因。參考本實(shí)驗(yàn)室的轉(zhuǎn)錄組信息，設(shè)計(jì)基因特異引物引物序列（表1）。

使用Tigen公司的高保真pfu酶進(jìn)行擴(kuò)增ScALDH目的基因。 PCR 儀使用 ABI 公司 Veriti 96 孔梯度。PCR反應(yīng)體系：Template 1 μL；Primer F 1 μL；Primer R 1 μL；Buffer 2 μL；dNTP 2 μL；Pfu酶 0.5 μL；ddH2O 13.5 μL，補(bǔ)足到20 μL；總體積為20 μL。PCR 儀反應(yīng)程序：96 ℃預(yù)變性2 min；96 ℃變性 30 s；55 ℃退火 30 s；72 ℃延伸 4 min；72 ℃， 10 min，后4 ℃保存。

1.5 PCR產(chǎn)物的克隆純化與篩選

對(duì)PCR 產(chǎn)物的目的大小片段使用Tigen的回收試劑盒，切膠、回收、純化。采用平末端連接方法，配制反應(yīng)體系。連接到pLB vector克隆載體上，后導(dǎo)入大腸桿菌 DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行 Amp抗性篩選，培養(yǎng)16 h后，對(duì)菌落進(jìn)行檢測(cè)，采用快速檢測(cè)方法，做菌落 PCR，擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性 2 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72℃ 4 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。測(cè)序服務(wù)有北京擎科生物公司提供，2次重復(fù)。

1.6 ScALDH基因的 Real timePCR 分析

根據(jù)ALDH基因序列，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR軟件Beacon Designer 7.0，設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量引物QF、QR，內(nèi)參基因選擇βactin（肌動(dòng)蛋白），引物為ACTINF、ACTINR；特異性引物序列見(jiàn)表2。

使用儀器 ABI 公司 7500 熒光量 PCR 儀，對(duì)干旱處理前后的基因表達(dá)情況進(jìn)行分析。采用SYBR Green I 嵌合熒光法進(jìn)行、Real Time PCR 的專(zhuān)用試劑。反應(yīng)體系（20 μL體系）：2×SuperReal PreMix Pius 10 μL；正向引物（10 μmol·L1） 0.6 μL；反向引物（10 μmol·L1） 0.6 μL；cDNA模板1 μL；50×ROX Reference Dye 0.4 μL；加RNasefree ddH2O 7.4 μL，補(bǔ)足到20 μL。采用三步法PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)程序如下。預(yù)變性：95 ℃，15 min。PCR反應(yīng)：95 ℃變性 ，10 sec；50 ℃退火，20 sec；72 ℃延伸，32 sec；40個(gè)循環(huán)。同時(shí)在 60～95 ℃進(jìn)行融解曲線(xiàn)分析。利用2ΔΔCT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣品進(jìn)行4次重復(fù)，取其平均值。

1.7 ALDH序列分析

對(duì)ALDH核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行分析，使用NCBI Blastx、ORF finder、Mega、NCBI Conserved Dom ain Search 等程序?qū)ζ溥M(jìn)行氨基酸序列相似性分析、開(kāi)放閱讀框（ORF）、進(jìn)化樹(shù)、及結(jié)構(gòu)域分析與功能結(jié)構(gòu)域查找。采用ProtParam計(jì)算蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量和理論等電點(diǎn)。用Clustal X進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)與相似序列分析。

2結(jié)果與分析

2.1 RNA的檢測(cè)結(jié)果

利用trizol 抽提試劑盒提取的甘蔗總RNA如圖1。并利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，RNA 樣品的OD260/280均在1.9～2.1之間，純度較高可以用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

2.3 ALDH的序列分析

將獲得的測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行ORF的尋找和Blastx分析。尋找結(jié)果共獲得14個(gè)大小不一的ORF，其中最長(zhǎng)的一個(gè)ORF和其他物種的ALDH基因核苷酸序列長(zhǎng)度相似，可判斷該位點(diǎn)就是ALDH基因的ORF。該ORF有一個(gè)起始密碼子ATG，終止密碼子TAA，編碼508個(gè)氨基酸，5′端非編碼區(qū)長(zhǎng)171 bp，3′端非編碼區(qū)長(zhǎng)298 bp，CDS全長(zhǎng)1 524 bp（圖3）。

利用ProtParam 軟件分析表明，該基因編碼蛋白質(zhì)的分子式為（Formula）C2414H3847N657O710S25 ，分子量為54 235.5 kD，理論等電點(diǎn) pI為6.22。負(fù)電荷的氨基酸殘基總數(shù)（Asp+Glu）為 45，帶正電荷的氨基酸殘基總數(shù)（Arg+Lys）為42，親水性平均系數(shù)（instability index II）為 34.22，是一類(lèi)穩(wěn)定的蛋白。 通過(guò)Blastx分析，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)與其它物種的ALDH基因所編碼的氨基酸序列，具有較高的同源性。推導(dǎo)該基因編碼的氨基酸序列（g：甘蔗），與玉米（y：玉米，gi|226531366|）、小麥（x：小麥，gi|814937256|）、擬山羊草（n：擬山羊草，gi|814937260|）、多年生黑麥草（h：黑麥草，gi|769748345|）、可可（k：可可，gi|769748345|）、野生大豆（d：野生大豆，gi|226531366|）、蘋(píng)果（p：蘋(píng)果，gi|658309736|）ALDH一致性分別為98%、92%、91%、91%、82%、82%、80%。序列對(duì)比如圖4。用MEGA5.0做系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖5）結(jié)果顯示，8個(gè)物種的ALDH基因被聚為兩大類(lèi)群：I類(lèi)有小麥、擬山羊草、黑麥草。II類(lèi)有可可、野生大豆、蘋(píng)果。從圖中發(fā)現(xiàn)ScALDH與玉米的ALDH7A1編碼的蛋白質(zhì)親緣關(guān)系最近，而且9個(gè)物種的蛋白氨基酸同源性均很高，因此該蛋白應(yīng)屬于醛脫氫酶ALDH家族蛋白，而且ALDH是一類(lèi)非常保守的基因家族。使用NCBI在線(xiàn)軟件對(duì)ScALDH蛋白的保守區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)結(jié)果表明，在保守結(jié)構(gòu)域上，目標(biāo)序列和其他物種都存在 NAD+結(jié)合位點(diǎn)，TAFN、KGAP、FTGSTRAGLM和LEL。以及特有的4個(gè)特有的催化殘基N、E、G、C分別位于165、266 、297、299位點(diǎn)上。將暫該序列命名為ScALDH，提交 GenBank，GeneBank登錄號(hào)ku517650。

2.4 干旱脅迫下ALDH基因的表達(dá)分析

為揭示ALDH基因在干旱脅迫過(guò)程中其表達(dá)量的變化，以不同時(shí)間處理的cDNA材料為模板，進(jìn)行分析，用甘蔗的看家基因ACTIN為內(nèi)參。取如下處理材料：WET組正常澆水、DRY2組干旱處理2 d、DRY4組干旱處理4 d、DRY6組干旱處理6 d，反轉(zhuǎn)錄成cDNA用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖6，從圖中可以看出，ALDH在葉片中的表達(dá)量存在明顯差異。干旱處理兩天的材料（DRY2），其ALDH基因的相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組（WET），是對(duì)照組的17.67倍。干旱處理4 d的材料（DRY4），又高于DRY2處理的， 是DRY2的2.08倍。而DRY6的表達(dá)量又是DRY4的1.4倍。由此可見(jiàn)，隨著干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，ALDH基因的表達(dá)量在逐漸升高，處理6 d后的材料的表達(dá)量，竟然是對(duì)照組的51.79倍。該基因在干旱脅迫下，呈明顯上調(diào)趨勢(shì)。

3討論與結(jié)論

隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，RNASeq高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用在了轉(zhuǎn)錄組領(lǐng)域中，高通量測(cè)序技術(shù)能夠全面快速地獲取某一物種特定器官或組織在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本，反映出它們的表達(dá)水平。特別是用于挖掘和篩選抗病、抗逆、農(nóng)藝性狀、代謝途徑相關(guān)的基因研究，它可以初步識(shí)別未知基因。但是該方法的不足之處就是，挖掘和篩選的相關(guān)基因仍需要在實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，所獲得的甘蔗野生種割手密ALDH基因片段，屬于醛脫氫酶基因家族，具有乙醛脫氫酶特異的保守序列。經(jīng)NCBI Blastx比對(duì)和做進(jìn)化樹(shù)分析之后，其與玉米的ALDH7A1編碼的蛋白質(zhì)親緣關(guān)系最近，相似度達(dá)到了98%，與小麥、擬山羊草、多年生黑麥草、可可、木本棉、野生大豆、蘋(píng)果ALDH一致性分別為92%、91%、91%、82%、82%、82%、80%。ScALDH其與已知的ALDH家族有極高的同源性，含有NAD+的結(jié)合位點(diǎn)，又有ALDH家族保守序列，可確認(rèn)為其ALDH家族，暫命名為ScALDH。ALDH是一類(lèi)非常保守的基因家族。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因在割手密中表現(xiàn)出持續(xù)積累的表達(dá)模式，即隨著干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)量增加。表明ScALDH基因的表達(dá)在割手密抗逆境過(guò)程中可能起著重要的作用。擬南芥、煙草、中過(guò)量表達(dá)的大豆ALDH7能提高轉(zhuǎn)基因植株的抗氧化脅迫能力（Rodrigues et al ，2006）。ALDH基因?qū)氩⒄系椒训幕蚪M中，在干旱、高鹽和低溫脅迫條件下，轉(zhuǎn)ALDH基因番茄對(duì)環(huán)境脅迫造成的傷害表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗性，即ALDH基因具有提高植物抗氧化脅迫的功能（張海玲等，2010）。An et al（2014）發(fā)現(xiàn)玉米的根部的ALDH7在多重環(huán)境脅迫下，起著排除醛類(lèi)物質(zhì)的作用。另外，ALDH7的主要功能可能是參與調(diào)控脅迫反應(yīng)和組織膨脹壓力，或參與清除引起脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的醛類(lèi)物質(zhì)（Kirch et al ，2004）。植物ALDH7 家族基因的表達(dá)受到干旱和高鹽等非生物逆境脅迫誘導(dǎo)（Kotchoni et al ，2006）。ALDH7a1還可通過(guò)產(chǎn)生滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)如甜菜堿和氧化脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物保護(hù)細(xì)胞免于損傷（Brocker et al，2011）。但可以確認(rèn)的是ALDH家族與抗性有非常密切的關(guān)系。

從本研究結(jié)果可以得出，割手密ScALDH蛋白基因其表達(dá)量與干旱脅迫的時(shí)間呈正相關(guān)。這與陳加敏和朱承慧（2013）、Kirch et al（2001）、Sunkar et al（2003）得出了相似的結(jié)論。植物在受到干旱等逆境脅迫時(shí)，體內(nèi)的ALDH7基因持續(xù)積累地表達(dá)，表明ALDH7蛋白家族基因參與干旱脅迫應(yīng)答，在抗逆中擔(dān)任著重要角色。ALDH蛋白家族基因能夠提高植物的抗逆性，是較理想的抗逆基因工程候選基因。

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