國內(nèi)近10年青錢柳多糖研究進(jìn)展

汪榮斌，秦亞東，周娟娟

1.安徽中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，安徽 蕪湖 241002；2.蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院，安徽 蕪湖 241000

國內(nèi)近10年青錢柳多糖研究進(jìn)展

汪榮斌1，秦亞東1，周娟娟2

1.安徽中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，安徽 蕪湖 241002；2.蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院，安徽 蕪湖 241000

青錢柳多糖在降血脂、降血糖、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等方面表現(xiàn)出較強(qiáng)的生物學(xué)活性，其中降血脂和降血糖作用已成為近年來研究熱點(diǎn)。本文對(duì)國內(nèi)近10年報(bào)道的青錢柳多糖提取純化、含量測定及生物學(xué)活性研究進(jìn)行綜述，以期為青錢柳多糖深入研究及產(chǎn)業(yè)開發(fā)提供參考。

青錢柳；多糖；綜述

青錢柳Cyclocarya paliurus（Batal.）Iljinsk.為胡桃科Juglandaceae青錢柳屬落葉喬木，又名青錢李、搖錢樹、甜茶樹等，系雙子葉植物綱胡桃科植物。青錢柳葉有祛風(fēng)止癢、清熱消渴、解毒等功效。中醫(yī)臨床用于治療糖尿病，具有較好的降血糖、降尿糖、降血脂效果。目前已知青錢柳化學(xué)成分主要有黃酮、三萜、酚、多糖等[1-4]。

安全性較高是多糖成分的優(yōu)點(diǎn)，一些中藥多糖已在臨床上廣泛使用，如靈芝多糖、香菇多糖、黃芪多糖等。但由于多糖是生物大分子，其提取分離、純化工藝、結(jié)構(gòu)解析等比小分子有機(jī)化合物困難得多[5]，這給研究帶來阻礙，因此青錢柳多糖的相關(guān)報(bào)道較少。近年來，青錢柳多糖因其抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)，尤其是降血糖、降血脂方面的作用使其逐漸受到研究者重視，成為研究熱點(diǎn)[6]。因此，筆者就國內(nèi)近10年來青錢柳多糖的提取、純化、含量測定及生物學(xué)活性角度進(jìn)行綜述，以期為青錢柳多糖深入研究提供參考。

1 工藝研究

1.1 含量測定

利用顯色原理測定是目前多糖含量測定主要方法，如硫酸-苯酚法或蒽酮-硫酸法，利用強(qiáng)酸水解多糖成單糖，形成糠醛化合物后與苯酚或蒽酮形成有色物質(zhì)，然后利用其在可見光區(qū)的最大吸收波長作為檢測波長進(jìn)行含量測定。而苯酚或蒽酮可與糠醛化合物成色，為獲得更接近真實(shí)的多糖含量，須去除供試多糖樣品中單糖、寡糖，否則測定的含量就是供試品中單糖、寡糖及多糖的含量之和，將導(dǎo)致含量測定結(jié)果偏高[7]。目前，青錢柳多糖含量測定文獻(xiàn)報(bào)道多以葡萄糖為對(duì)照品，采用紫外-可見分光光度法進(jìn)行含量測定，檢測波長若用硫酸-苯酚法顯色是490 nm，硫酸-蒽酮法顯色是580 nm，結(jié)果較滿意。樣品的前處理多以石油醚、乙醇等有機(jī)溶劑進(jìn)行脫脂處理，然后利用多糖溶解于水而難溶解于有機(jī)溶劑的原理進(jìn)行水提純沉處理。文獻(xiàn)報(bào)道的青錢柳多糖的紫外-可見分光光度法含量測定條件見表1。

1.2 提取和純化

大多數(shù)植物多糖存在于細(xì)胞壁內(nèi)（又稱胞內(nèi)多糖），因此為了使多糖從細(xì)胞壁內(nèi)更好溶出，首先須將植物體粉碎處理，再用有機(jī)溶劑破壞包圍細(xì)胞壁的脂質(zhì)層。不同的提取方式，如微波提取、熱水提取、超聲提取的原理和特點(diǎn)各不相同，其提取效果亦存在差異。上官新晨等[12]使用微波提取法提取青錢柳多糖，并采用單因素及正交試驗(yàn)優(yōu)化了提取工藝，在最佳提取工藝條件下提取率為2.55%，其優(yōu)點(diǎn)是時(shí)間短、提取率高。謝建華等[13]采用傳統(tǒng)水提醇沉法，并通過單因素及正交試驗(yàn)確定了最佳提取工藝，獲得青錢柳多糖提取率為6.54%。超聲波法也被應(yīng)用于青錢柳多糖的提取，文獻(xiàn)報(bào)道超聲功率和超聲時(shí)間對(duì)多糖提取的影響較大，也有縮短提取時(shí)間、提高得率的優(yōu)點(diǎn)[14]。

表1 青錢柳多糖的含量測定方法

目前關(guān)于青錢柳提取工藝的文獻(xiàn)報(bào)道較少，且因試驗(yàn)所用青錢柳樣品產(chǎn)地不同、前處理有差異，因此其結(jié)果直接比較可信度不高。另外，衡量提取效果的指標(biāo)較為單一，可從多糖得率、多糖純度等方面進(jìn)行更全面考察。

本文所述純化工藝是指從多糖樣品中除去雜質(zhì)的過程。這些雜質(zhì)包括單糖、寡糖、蛋白質(zhì)、色素、無機(jī)鹽等，而非為獲得均一多糖所采用的各種分離技術(shù)和手段。陳木森等[15]使用8種樹脂對(duì)青錢柳多糖的靜態(tài)吸附做了研究，發(fā)現(xiàn) D301R型樹脂對(duì)青錢柳多糖吸附量最大，在30 ℃、pH＝7、濃度為4 mg/mL、吸附流速為1.5 mL/min時(shí)吸附較強(qiáng)；0.4 mol/L氯化鈉洗脫效果較好，洗脫率可達(dá) 82.12%。謝建華等[16]報(bào)道了青錢柳多糖的活性炭脫色研究，以脫色率和保留率為指標(biāo)，采用單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化脫色工藝，在溫度40 ℃、時(shí)間40 min、活性炭用量1%、pH＝3.5時(shí)脫色率可達(dá)80.3%、保留率為55.6%。

目前，青錢柳去除雜質(zhì)的研究文獻(xiàn)較少，如脫蛋白質(zhì)的研究尚未見報(bào)道。純化工藝手段可以脫色率、脫蛋白率、多糖純度等為指標(biāo)，使用方法可對(duì)樹脂、化學(xué)試劑（過氧化氫、次氯酸鈉）、物理吸附（活性炭等）進(jìn)行考察，目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

2 生物學(xué)活性研究

2.1 免疫調(diào)節(jié)

T淋巴細(xì)胞在機(jī)體細(xì)胞免疫、體液免疫過程中起著重要作用，通過T免疫細(xì)胞的激活，可以增加機(jī)體免疫細(xì)胞的吞噬能力，從而增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。樹突狀細(xì)胞是功能最強(qiáng)的專職抗原提呈細(xì)胞，能有效刺激初始型 T細(xì)胞的增殖，提高機(jī)體免疫應(yīng)答。黃丹菲等[17]研究了青錢柳多糖對(duì)小鼠骨髓來源的樹突狀細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)及表面分子表達(dá)的影響，表明青錢柳多糖能顯著促進(jìn)樹突狀細(xì)胞表面 MHCⅡ表達(dá)，且在一定范圍呈現(xiàn)濃度依賴，說明青錢柳多糖可促進(jìn)樹突狀細(xì)胞的成熟。

2.2 抗腫瘤

多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用可以直接抑制腫瘤細(xì)胞的生長、提高機(jī)體免疫功能而發(fā)揮間接抗腫瘤作用（如激活吞噬細(xì)胞、促進(jìn)細(xì)胞因子分泌等）等途徑實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用。劉昕等[18]研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度、不同制備方法所得青錢柳多糖對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞生長有顯著抑制作用，而對(duì)人臍帶內(nèi)皮細(xì)胞的生長抑制率較低。韓澄等[19]報(bào)道了青錢柳多糖在一定濃度下對(duì)人胃癌MGC-803細(xì)胞生長抑制率可達(dá)65.07%，細(xì)胞凋亡率達(dá) 25.44%。推測其機(jī)制可能是使細(xì)胞在S期發(fā)生阻滯，同時(shí)引起細(xì)胞p21、bax的基因表達(dá)量增多，細(xì)胞bcl-2的基因表達(dá)量建設(shè)有關(guān)。

2.3 抗氧化

研究多糖抗氧化作用可分為體內(nèi)抗氧化和體外抗氧化2種模式。體外抗氧化多以模擬的化學(xué)自由基環(huán)境，如對(duì)二苯代苦味?；杂苫―PPH自由基）、過氧化氫與催化劑Fe2+構(gòu)成的氧化體系（Fenton體系）等對(duì)多糖抗氧化能力進(jìn)行評(píng)價(jià)；體內(nèi)抗氧化作用多在氧化模型小鼠或大鼠體內(nèi)進(jìn)行，并以氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）等或清除體內(nèi)自由基的各種酶如超氧歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的活性作為指標(biāo)[20-21]。青錢柳多糖濃度為 0.4 mg/mL時(shí)對(duì)DPPH自由基的清除率可達(dá)71.8%，濃度為1.2 mg/mL時(shí)對(duì)羥基自由基的清除率可達(dá)68.1%，表明青錢柳多糖對(duì)DPPH自由基的清除率較高[22]。葛霞等[22]以高脂小鼠為指標(biāo)，采用青錢柳多糖進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)能顯著降低肝臟MDA、游離脂肪酸的含量，提高肝臟SOD、GSH-Px的活性。段小群等[23]研究發(fā)現(xiàn)，青錢柳多糖可減輕小鼠肝組織自發(fā)性及四氯化碳、過氧化氫、亞鐵離子-維生素C所誘導(dǎo)小鼠肝臟脂質(zhì)過氧化的程度，且呈一定的濃度依賴。上述研究表明，青錢柳多糖對(duì)體外、體內(nèi)均體現(xiàn)出一定的抗氧化作用。

半數(shù)清除率（IC50）是衡量物質(zhì)對(duì)某一抗氧化體系能力評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)，關(guān)于青錢柳多糖IC50的研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。多糖屬于大分子物質(zhì)，進(jìn)入體內(nèi)后機(jī)體對(duì)大分子物質(zhì)的吸收情況迄今罕見報(bào)道；另外，關(guān)于體內(nèi)、體外抗氧化作用也應(yīng)屬于相關(guān)研究重點(diǎn)。

2.4 降血糖

中藥降血糖機(jī)制主要從提高胰島素含量、增加胰島素敏感性、抑制葡萄糖的吸收、對(duì)受體后糖代謝的影響及提高機(jī)體自由基清除能力和抗脂質(zhì)過氧化等方面實(shí)現(xiàn)。目前有關(guān)青錢柳多糖降血糖作用研究均采用尾靜脈或腹腔注射四氧嘧啶建立糖尿病模型小鼠，以格列本脲或二甲雙胍為陽性對(duì)照組，灌胃給藥一段時(shí)間后測定血清中血糖（Glu）、胰島素（Ins）、C肽、血漿胰高血糖素（Gln）及胰島組織形態(tài)為考察指標(biāo)評(píng)價(jià)青錢柳多糖的降血糖效果。青錢柳多糖不同劑量組均可顯著降低模型組小鼠的Glu[24-26]、Ins、C肽、Gln，且高劑量組效果更優(yōu)[24]；青錢柳多糖可顯著提高小鼠對(duì)葡萄糖、淀粉的糖耐量，對(duì)蔗糖影響不顯著[25]；有文獻(xiàn)報(bào)道HE染色顯示，青錢柳多糖對(duì)四氧嘧啶引發(fā)的胰島組織損傷有一定的保護(hù)作用[26]。

從上述文獻(xiàn)可以發(fā)現(xiàn)，青錢柳多糖降血糖作用顯著，但其降糖作用機(jī)制研究未見文獻(xiàn)報(bào)道。上官新晨等[25]通過預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，青錢柳多糖對(duì)α-D-葡糖糖苷酶活性具有顯著的抑制作用，進(jìn)而抑制機(jī)體對(duì)葡糖糖的吸收，這極有可能是青錢柳多糖降糖作用實(shí)現(xiàn)的途徑。需要進(jìn)一步說明的是，通過多糖預(yù)先給藥模型，有學(xué)者提出多糖給藥時(shí)間至少需要20 d以上，否則多糖在動(dòng)物體內(nèi)的效果可能尚未體現(xiàn)出來[5]，應(yīng)引起足夠重視。

2.5 降血脂

高血脂癥及其所發(fā)生的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)與與心腦血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生有密切關(guān)系。血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、中密度脂蛋白（MDL）、低密度脂蛋白（LDL）常作為高脂血癥判斷的重要指標(biāo)；SOD、過氧化氫酶（CAT）、GSH-Px及MDA水平常作為判斷體內(nèi)發(fā)生脂質(zhì)過氧化及抗氧化能力的重要指標(biāo)。研究表明，青錢柳多糖可顯著降低高脂血癥大鼠血清TC、TG、LDL、MDA含量，提高血清HDL、SOD、GSH-Px、總抗氧化能力[27-28]，提示青錢柳多糖具有降脂和抗脂質(zhì)氧化作用，但不同文獻(xiàn)報(bào)道最佳給藥劑量不同。也有報(bào)道青錢柳多糖對(duì)脂肪酶的活性體現(xiàn)出抑制作用[28]。

青錢柳多糖可降低四環(huán)素建立的人肝 L-02細(xì)胞變性模型細(xì)胞內(nèi)TG含量，且呈現(xiàn)濃度依賴[29]。脂肪細(xì)胞的增殖分化失?？芍轮窘M織堆積、細(xì)胞內(nèi)分泌紊亂等，3T3-L1前脂肪細(xì)胞在脂肪細(xì)胞功能性評(píng)價(jià)中占有重要作用。研究表明，青錢柳多糖經(jīng) D301-R、DEAE樹脂純化后能夠降低3T3-L1脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗，降低 3T3-L1脂肪細(xì)胞細(xì)胞外甘油的含量[30]，提示青錢柳多糖能夠促進(jìn)脂肪細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞分化的作用。研究表明，促進(jìn)過氧化物酶體增殖劑激活受體（PPAR）γ和C/EBPα mRNA與蛋白質(zhì)表達(dá)是多糖或蒲黃總黃酮促進(jìn)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖和分化的機(jī)制[31]。但青錢柳多糖是否也通過該途徑實(shí)現(xiàn)促進(jìn)脂肪細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞分化尚待深入研究。

脂肪酶合成酶（FAS）、激素敏感脂肪酶（HSL）是細(xì)胞脂肪代謝過程中重要的調(diào)控酶。HSL是脂肪組織分解代謝的重要限速酶，其活性與 FAS、HLS mRNA表達(dá)密切相關(guān)；PPARα是脂質(zhì)代謝過程中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，對(duì)肝臟線粒體、過氧化物酶及微粒體的脂肪酸β氧化中關(guān)鍵酶起到關(guān)鍵的基因調(diào)控作用，其活性大小受PPARα mRNA表達(dá)影響；葡萄糖作為體內(nèi)重要的能量來源，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 4（GLUT4）是最主要的葡萄糖轉(zhuǎn)載體，其轉(zhuǎn)運(yùn)是由葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（GLUTs）介導(dǎo)完成，GLUT4 mRNA的表達(dá)將嚴(yán)重影響脂肪組織對(duì)葡萄糖的攝取。研究顯示，青錢柳多糖能抑制小鼠肝臟組織FAS mRNA和FAS蛋白表達(dá)，而對(duì)脂肪FAS mRNA表達(dá)的影響不明顯，青錢柳多糖不同劑量組均可提高 PPARα、GLUT4、HSL mRNA的表達(dá)[32-33]。提示青錢柳多糖能抑制肝臟脂質(zhì)氧化。通過對(duì)高脂血癥小鼠肝臟 HE染色不同組間的對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)青錢柳多糖可改善高脂血癥小鼠肝組織受損。研究結(jié)果表明，在脂肪代謝過程中一些重要調(diào)控酶FAS、HSL、PPARα、GLUT4等基因表達(dá)可能是青錢柳多糖作用的主要途徑[34]。

3 展望

綜上所述，青錢柳作是我國特有的瀕臨滅絕的珍稀樹種，其多方面的顯著功效，尤其降血糖、降血脂引起了廣泛關(guān)注。但也存在一些問題，如迄今有關(guān)青錢柳多糖的單糖組成方面報(bào)道僅有1篇[35]，而關(guān)于青錢柳多糖的空間結(jié)構(gòu)方面研究鮮有報(bào)道；另外，青錢柳多糖的有效部位仍未確定。有效部位的確認(rèn)是進(jìn)行生物活性研究的首要條件。多糖的純度也要確認(rèn)，若多糖純度不夠，起效成分可能是非糖成分[7]。在活性研究方面，涉及分子水平的機(jī)制研究較少。因此，今后應(yīng)深入研究青錢柳多糖結(jié)構(gòu)、闡明構(gòu)效關(guān)系、明確作用機(jī)制，為開發(fā)療效明確的青錢柳多糖產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。

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Research Progress in Cyclocarya paliurus (Batal.) Iljinsk. Polysaccharide in China in the Latest Dacade

WANG Rong-bin1, QIN Ya-dong1, ZHOU Juan-juan2
(1. Anhui College of Traditional Chinese Medicine, Wuhu 241002, China; 2. Wuhu Hospital of Traditional Chinese Medicine, Wuhu 241000, China)

s: Cyclocarya paliurus (Batal.) Iljinsk. polysaccharide (CPPC) has various biological activities including hypolipemic effect, hypoglycemic effect, anti-oxidant effect, anti-tumor effect and immunomodulatiry; especially that hypolipemic effect and hypoglycemic effect have become the research hotspots in recent years. This article reviewed extraction, purification, content determination and biological activity of CPPC in the latest decade, with a purpose to provide references for the deep research and industrial development CPPC.

Cyclocarya paliurus (Batal.) Iljinsk.; polysaccharide; review

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.05.033

R284.2；R285.5

：A

：1005-5304(2017)05-0133-04

2015-12-26）

（

2016-03-24；編輯：向宇雁）

安徽省衛(wèi)生計(jì)生委中醫(yī)藥科研課題（2014zy45）；安徽高校自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（KJ2015A343）；安徽省高校學(xué)科（專業(yè)）拔尖人才學(xué)術(shù)資助重點(diǎn)項(xiàng)目（gxbjZD2016106）