溶劑類型對芍藥花多酚類物質(zhì)的提取及其抗氧化能力的影響

陳冠林+劉學文+謝迎慶+趙穎瑩+韓門娣+陳松根

摘要：利用不同溶劑提取芍藥花中多酚類化合物并測定總酚的含量及其抗氧化能力。結(jié)果表明，提取溶劑的差異對芍藥花提取物總酚和抗氧化活性影響顯著。總酚提取效率最好的是50%乙醇，鐵離子還原能力和總抗氧化能力最強的是50%乙醇的提取液，DPPH·自由基清除能力最好的是甲醇-丙酮-水提取液。結(jié)果顯示芍藥花可作為一種經(jīng)濟的抗氧化劑來源。

關(guān)鍵詞：芍藥花；多酚；抗氧化

中圖分類號：TS201.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）06-1118-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.06.032

Abstract：Solvents were used to extracted polyphenol from the flower of Paeonia lactiflora Pall.，total phenolic content and the antioxidant properties of polyphenol were also determined. The results showed that the extracting solvents significantly affected the contents of total polyphenol and antioxidant activities in the flower of Paeonia lactiflora Pall.. The highest total phenolic content was obtained with 50% ethanol. The highest antioxidant activities measured by reducing power and total antioxidant capacity by equivalent antioxidant capacity （TEAC） assays were obtained with 50% aqueous ethanol， while the highest scavenging DPPH· activity was obtained with methanol-acetone-water. The results obtained demonstrated the potential of the flower of Paeonia lactiflora Pall. can use as an economical source of antioxidant.

Key words： the flower of Paeonia lactiflora Pall.； total phenolic contents； antioxidant activity

芍藥（Paeonia lactiflora Pall.），為芍藥科（Paenoiaeeae）芍藥屬（Paeonia）的著名草本花卉，在中國的栽培歷史超過4 900年。芍藥產(chǎn)于浙江、安徽、河南、山東、貴州、四川等地，中國有野生芍藥品種約8個，栽培品種約800個。芍藥以根入藥，味苦、微寒、歸肝經(jīng)。芍藥作為一種傳統(tǒng)的中藥，在中國、韓國以及日本應用廣泛[1，2]，具有解痙、補虛、鎮(zhèn)痛的作用[3]。除此以外，芍藥還有抗氧化、抗炎、解熱、抗焦慮以及抑制脂質(zhì)過氧化等作用[4-10]。芍藥花是中國的六大名花之一，作為芍藥的附屬部分因沒有充分的開發(fā)和利用常常被廢棄，造成了極大的資源浪費。芍藥的花色有白、粉、黃、紅、藍、紫、黑等8色。芍藥花富含多種重要的高級脂肪酸，以棕櫚酸、亞油酸以及亞麻酸為主[11]。含苞待放的花蕾中多酚和Zn的含量最高，而初開的花中黃酮含量最高，F(xiàn)e元素則在凋謝的花瓣中最高，Cu元素含量在各個花期差不多[12]。芍藥花含有糖類、苷類、有機酸類、黃酮類、香豆素類、酚類、甾體類或三萜類和蒽醌類化合物[13]。芍藥色素在酸性條件下紅色穩(wěn)定，酸性越強，紅色越深，近中性至堿性時，色素極不穩(wěn)定。該色素有一定的耐熱性，不耐光，對氧化劑、還原劑均較敏感。Fe3+、Fe2+、Cu2+可引起色素顏色異常，與色素反應絡(luò)合生成其他物質(zhì)；Mn2+對色素有褪色作用；Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Pb2+對色素均有一定的增色作用，其中Pb2+增色效果顯著；碳水化合物、有機酸對芍藥色素具有顯著的增色效果；植酸對芍藥花色素增色效果最為顯著，酒石酸對色素的保色效果最顯著；紫外線照射對芍藥干燥花瓣的破壞大于自然光，覆膜處理對芍藥干燥花的保色效果不顯著[14]。從目前掌握的文獻看，大部分研究是關(guān)于芍藥的，而對芍藥花的研究較少。雖然有文獻對芍藥花的提取物進行了相關(guān)的研究[12，13，15，16]，但溶劑對芍藥花多酚的提取及其抗氧化研究以及提取物濃度與抗氧化性的關(guān)系沒有進行系統(tǒng)的研究。因此，本研究以芍藥花為原料，應用不同的溶劑從芍藥花中提取多酚，測定提取液中多酚的含量及其抗氧化性，同時對提取物濃度與抗氧化性的關(guān)系進行系統(tǒng)研究，為后續(xù)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1）材料。芍藥花購于廣東省佛山市某超市。

2）試驗試劑。乙醇、Trolox（6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，水溶性維生素E）、TPTZ（2，4，6-tris-2，4，6-tripiridyl-2-triazine，三吡啶三吖嗪）、FeCl3、HCl溶液、乙酸鈉緩沖液、福林-酚試劑（Folin-Ciocalteu reagent）、乙醇溶液、DPPH·（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）、過硫酸鉀、沒食子酸、ABTS+·（2，2-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，2，2'-聯(lián)氨-雙-3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸）。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外/可見分光光度計（北京瑞利分析儀器有限公司，UV-9600），超聲清洗儀（LEO-150S）。

1.3 樣品的制備

芍藥花干燥后用粉碎機粉碎，過20目篩，備用。

1.4 芍藥花多酚的提取

準確稱取1.0 g芍藥花，分別加入甲醇，50%甲醇，乙醇，50%乙醇，甲醇-丙酮-水（7∶7∶6；V/V/V）50 mL，室溫下超聲10 min，抽濾，濾液備用；準確稱取1.0 g芍藥花加入50 mL開水，10 min后抽濾，濾液備用[17-23]。

1.5 總酚含量的測定

取0.10 mL待測樣品，加入2.50 mL 1∶10稀釋的Folin-Ciocalteu試劑中，反應4 min后，加入2.00 mL 75 g/L的Na2CO3溶液，置室溫下反應120 min，于760 nm下測定吸光度。結(jié)果以沒食子酸當量（Gallic acid equivalents， GAE）表示，單位為mg GAE/g[24，25]。

1.6 ABTS法測定抗氧化能力

將7 mmol/L的ABTS（用pH為4.5、20 mmol/L的乙酸鈉配制）和2.45 mmol/L的過硫酸鉀等體積混合，室溫下避光反應12～16 h，形成ABTS+·儲備液。使用前用20 mmol/L乙酸鈉（pH 4.5）將ABTS+·儲備液稀釋成為工作液，使其在734 nm處吸光度為0.700±0.002。取100 μL待測樣品，加入3 mL ABTS+·工作液，室溫下反應2 h后，在734 nm處測定吸光度。以20 mmol/L乙酸鈉（pH 4.5）為空白，ABTS+·為對照，以Trolox溶液為標樣作標準曲線，樣品的抗氧化活性用TEAC（Trolox equivalent antioxidant capacity）表示[26]，單位為μmol Trolox/g。

1.7 DPPH法測定抗氧化活性

取0.1 mL待測樣品，加入0.06 mmol/L DPPH· 80%乙醇溶液3.9 mL，振蕩15 s，放置暗處反應2 h后，于515 nm處測定吸光度，按以下公式計算清除率：清除率=（A對照-A樣品）/A對照×100%。以3.9 mL DPPH·+0.1 mL 80%乙醇作對照，空白為80%乙醇，以Trolox溶液為標樣作標準曲線，樣品的抗氧化活性用Trolox當量表示，單位為μmol Trolox/g[27]。

1.8 FRAP法測定抗氧化活性

FRAP試劑由10 mmol/L的TPTZ（溶于40 mmol/L鹽酸）、20 mmol/L的三氯化鐵、300 mmol/L的乙酸鈉緩沖液（pH 3.6）以1∶1∶10（V/V/V）的比例混合而成。取100 μL待測樣品，加入3 mL FRAP溶液中充分混合，反應120 min后于593 nm處測定吸光度。以Trolox溶液為標樣作標準曲線，樣品的抗氧化活性用μmol Trolox/g表示[26，28]。

2 結(jié)果與分析

2.1 多酚含量

提取物的提取效率及其抗氧化性與提取溶劑相關(guān)，不同的溶劑提取所得的化合物極性不同[21]，有機溶劑經(jīng)常被用來提取多酚，選擇合適的溶劑進行提取，有利于提高多酚的提取效率[18]。因此，本研究應用不同的溶劑進行相關(guān)的研究，以獲得最佳的提取溶劑。不同溶劑提取液中的總酚含量為134.94～229.16 mg GAE/g，其中50%乙醇對多酚的提取效果最好（圖1）。提取液中多酚含量的順序為50%乙醇﹥甲醇-丙酮-水﹥50%甲醇﹥開水﹥甲醇﹥乙醇，混合溶劑比單溶劑的提取效率好，這與以往的研究結(jié)果是相同的[29]。

2.2 清除ABTS·+能力

ABTS經(jīng)過氧化后生成穩(wěn)定的藍綠色陽離子自由基ABTS+·，且能溶于水相或酸性乙醇介質(zhì)中。游離基捕獲劑加入到ABTS+·溶液后，可以與ABTS+·作用而使反應體系褪色，通過在最大吸收波長處檢測吸光度的變化來評價自由基被清除的情況，從而評價試驗樣品的抗氧化能力[30-32]。各提取液中清除ABTS+·能力為2 533.41～5 450.41 μmol Trolox/g，其中50%乙醇提取液清除ABTS+·能力最強。提取液清除ABTS+·能力的順序為50%乙醇﹥50%甲醇﹥甲醇﹥甲醇-丙酮-水﹥開水﹥乙醇（圖2）。

2.3 清除DPPH·能力

DPPH·是一種穩(wěn)定的自由基，其乙醇溶液呈紫色，其孤對電子在517 nm附近有強吸收。加入自由基清除劑時，吸收減弱或者消失，顏色由紫色向黃色變化，通過測定其吸收減弱的程度來評價自由基被清除的情況[33-35]。各提取液中清除DPPH·能力為 1 154.56～1 423.71 μmol Trolox/g，其中甲醇-丙酮-水提取液清除DPPH·能力最強。提取液清除DPPH·能力的強弱順序為甲醇-丙酮-水﹥50%甲醇﹥甲醇﹥50%乙醇﹥開水﹥乙醇（圖3）。

2.4 Fe3+還原能力

在酸性條件下，樣品中的抗氧化物質(zhì)可以將Fe3+-TPTZ還原為Fe2+-TPTZ而呈藍色，在593 nm處具有最大吸收光，根據(jù)吸光度的大小來計算樣品抗氧化能力的強弱[28，36，37]。提取液Fe3+的還原能力為915.11～1 899.11 μmol Trolox/g，其中50%乙醇提取液的Fe3+還原能力最強。提取液Fe3+的還原能力的順序為50%乙醇﹥50%甲醇﹥甲醇-丙酮-水﹥開水﹥甲醇﹥乙醇（圖4）。

2.5 多酚含量與抗氧化活性能力的相關(guān)性研究

由圖5可知，總酚含量與DPPH·清除能力（y=2.622 3x+842.05，R2=0.753 6）、Fe3+還原能力（y=9.129 7x-342.23，R2=0.833 4）存在著較強的線性相關(guān)關(guān)系，這與以往的研究結(jié)論是一致的[38，39]。結(jié)果表明，酚類在清除DPPH·以及還原Fe3+中起著重要的作用。然而在本研究中，總酚含量與ABTS+·清除能力的關(guān)系較弱，與以往的研究結(jié)論是有差別的[38，39]。隨著提取液中酚類含量濃度增高其抗氧化能力增強（圖6，表1），這與以往的研究是一致的[20，40]。

2.6 各方法測定抗氧化活性研究之間的相關(guān)性

由圖7可知，F(xiàn)RAP法與ABTS法之間存在著較強的線性相關(guān)關(guān)系，顯示酚類不但可以還原Fe3+還可以清除ABTS+·，這與以往的研究結(jié)論是一致的[16，38，39]。FRAP法與DPPH法之間也存在著較強的線性關(guān)系，但DPPH法與ABTS法之間不存在相關(guān)關(guān)系。

3 結(jié)論

結(jié)果表明，提取溶劑對酚類物質(zhì)含量及其抗氧化活性有顯著的影響，混合溶劑比單溶劑的提取效率好。提取液中總酚含量與DPPH·清除能力和Fe3+還原能力存在著較強的線性相關(guān)關(guān)系，隨著總酚含量增高其抗氧化能力增強。從本研究可看出芍藥花多酚具有較強的抗氧化活性，可作為一種天然的抗氧化劑應用于食品和醫(yī)藥行業(yè)中。在選擇的溶劑中，甲醇和丙酮是有毒的而乙醇是無毒的，乙醇被廣泛地應用于化合物的提取以及食品工業(yè)中，因此選擇乙醇作為后續(xù)試驗的溶劑。

參考文獻：

[1] LEE S J，LEE H K，JUNQ M K，et al.In vitro antiviral activity of 1，2，3，4，6-penta-O-galloyl-β-D-glucose against hepatitis B virus[J].Biol Pharm Bull，2006，29（10）：4.

[2] SHU X，DUAN W，LIU F，et al.Preparative separation of polyphenols from the flowers of Paeonia lactiflora Pall.by high-speed counter-current chromatography[J].Journal of Chromatography B，2014（948）：62-67.

[3] XU S，YANG L，LIN Q，et al. Simultaneous determination of paeoniflorin， albiflorin and benzoylpaeoniflorin in radix Paeoniae Alba by TLC[J].Chromatographia，2008，68（5-6）：459-462.

[4] YANG H O，KO W K，KIM J Y，et al. Paeoniflorin：An antihyperlipidemic agent from Paeonia lactiflora[J].Fitoterapia，2004， 75（1）：45-49.

[5] CHOU T. Anti-inflammatory and analgesic effects of paeonol in carrageenan-evoked thermal hyperalgesia[J].British Journal of Pharmacology，2003，139（6）：1146-1152.

[6] KHAN T，AHMAD M，NISAR M，et al. Enzyme inhibition and radical scavenging activities of aerial parts of Paeonia emodi Wall.（Paeoniaceae）[J].Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry，2005，20（3）：245-249.

[7] LIANG X，WANG Y，JING L，et al. Effects of paeoniflorin on the cerebral infarction， behavioral and cognitive impairments at the chronic stage of transient middle cerebral artery occlusion in rats[J].Life Sciences，2005，78（4）：413-420.

[8] MI X J，CHEN S W，WANG W J，et al. Anxiolytic-like effect of paeonol in mice[J].Pharmacology Biochemistry and Behavior，2005，81（3）：683-687.

[9] KIM S H，KIM S，PARK M，et al. Paeonol inhibits anaphylactic reaction by regulating histamine and TNF-α[J].International Immunopharmacology，2004，4（2）：279-287.

[10] HSIEH C，CHENG C，TSAI T，et al. Paeonol reduced cerebral infarction involving the superoxide anion and microglia activation in ischemia-reperfusion injured rats[J].Journal of Ethnopharmacology，2006，106（2）：208-215.

[11] 王榮花，劉雅麗.牡丹和芍藥花瓣中高級脂肪酸組分及含量的測定[J].中國農(nóng)學通報，2004（6）：212-214.

[12] 胡喜蘭，尹福軍，程青芳，等.不同花期芍藥花中活性成分的研究[J].食品科學，2008（9）：511-514.

[13] 金英善，陳曼麗，金銀哲，等.芍藥花活性成分分析及體外清除自由基活性研究[J].揚州大學學報（農(nóng)業(yè)與生命科學版），2012（3）：86-90.

[14] 王愛晶.芍藥花紅色素穩(wěn)定性研究及應用[D].哈爾濱：東北林業(yè)大學，2010.

[15] 舒希凱.芍藥花抗氧化活性成分的分離和鑒定[D].濟南：山東師范大學，2013.

[16] CHEN G，CHEN S，XIE Y，et al. Total phenolic，flavonoid and antioxidant activity of 23 edible flowers subjected to in vitro digestion[J].Journal of Functional Foods，2015，17：243-259.

[17] LIYANAPATHIRANA C，SHAHIDI F. Antioxidant activity of wheat extracts as affected by in vitro digestion[J].Biofactors， 2004，21（1-4）：325-328.

[18] ALFARSI M A，LEE C Y. Optimization of phenolics and dietary fibre extraction from date seeds[J].Food Chemistry，2008，108（3）：977-985.

[19] CONTINI M， BACCELLONIS， MASSANTINI R，et al. Extraction of natural antioxidants from hazelnut（Corylus avellana L.） shell and skin wastes by long maceration at room temperature[J].Food Chemistry，2008，110（3）：659-669.

[20] FEMANDEZ？魷A，PEREIRA E，F(xiàn)REIRE M S，et al. Influence of solvent on the antioxidant and antimicrobial properties of walnut（Juglans regia L.） green husk extracts[J].Industrial Crops and Products，2013，42：126-132.

[21] MOURE A，CRUZ J M，F(xiàn)RANCO D，et al. Natural antioxidants from residual sources[J].Food Chemistry，2001，72（2）：145-171.

[22] VZQUEZ G，F(xiàn)ONTENLA E，SANTOS J，et al. Antioxidant activity and phenolic content of chestnut （Castanea sativa） shell and eucalyptus（Eucalyptus globulus） bark extracts[J].Industrial Crops and Products，2008，28（3）：279-285.

[23] LIYANA C M，SHAHIDI F.Importance of insoluble-bound phenolics to antioxidant properties of wheat[J].J Agric Food Chem，2006，54（4）：1256-1264.

[24] SINGLETON V L，ROSSI J A.Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents[J].American Journal of Enology and Viticulture，1965，16（3）：144-158.

[25] SONG F L，GAN R Y，ZHANG Y，et al. Total phenolic contents and antioxidant capacities of selected chinese medicinal plants[J].Int J Mol Sci，2010，11（6）：2362-2372.

[26] OZGEN M，REESE R N，TULIO A Z， et al. Modified 2，2-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid（ABTS） method to measure antioxidant capacity of selected small fruits and comparison to ferric reducing antioxidant power （FRAP） and 2，2‘-Diphenyl-1-picrylhydrazyl（DPPH） methods[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2006，54（4）：1151-1157.

[27] CAI Y，SUN M，CORKE H. Antioxidant activity of betalains from plants of the amaranthaceae[J].J Agric Food Chem，2003， 51（8）：2288-2294.

[28] BENZIE I F F，STRAIN J J. The ferric reducing ability of plasma（FRAP） as a measure of “Antioxidant Power”： The FRAP assay[J].Analytical Biochemistry，1996，239（1）：70-76.

[29] SPIGNO G，TRAMELLI L，DE F D M.Effects of extraction time，temperature and solvent on concentration and antioxidant activity of grape marc phenolics[J].Journal of Food Engineering，2007，81（1）：200-208.

[30] MILLER N J，RICE E C，DAVIES M J，et al. A novel method for measuring antioxidant capacity and its application to monitoring the antioxidant status in premature neonates[J].Clin Sci （Lond），1993，84（4）：407-412.

[31] RE R，PELLEGRINI N，PROTEGGENTE A，et al. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay[J].Free Radical Biology and Medicine，1999，26（9-10）：1231-1237.

[32] RICE E C，MILLER N J. Total antioxidant status in plasma and body fluids[J].Methods Enzymol，1994，234：279-293.

[33] 方 敏，王耀峰，宮智勇.15種水果和33種蔬菜的抗氧化活性研究[J].食品科學，2008（10）：97-100.

[34] 胡喜蘭，韓照祥，陶 瑩，等.DPPH·法測定17種植物的抗氧化活性[J].食品科技，2006（10）：264-268.

[35] BRAND W W，CUVELIER M E，BERSET C. Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity[J].LWT-Food Science and Technology，1995，28（1）：25-30.

[36] HALVORSEN B L，HOLTE K，MYHRSTAD M C，et al. A systematic screening of total antioxidants in dietary plants[J].J Nutr，2002，132（3）：461-471.

[37] PULIDO R，BRAVO L，SAURA C F. Antioxidant activity of dietary polyphenols as determined by a modified ferric reducing/antioxidant power assay[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2000，48（8）：3396-3402.

[38] CHEN G，CHEN S，ZHAO Y，et al. Total phenolic contents of 33 fruits and their antioxidant capacities before and after in vitro digestion[J].Industrial Crops and Products，2014，57（3）：150-157.

[39] CHEN G，CHEN S，CHEN F，et al. Nutraceutical potential and antioxidant benefits of selected fruit seeds subjected to an in vitro digestion[J]. Journal of Functional Foods，2016，20：317-331.

[40] BAE H，JAYAPRAKASHA G K，CROSBY K，et al. Influence of extraction solvents on antioxidant activity and the content of bioactive compounds in non-pungent peppers[J]. Plant Foods for Human Nutrition，2012，67（2）：120-128.