鹽度對仿刺參蛋白攝入量及蛋白酶活性的影響

韓曉弟+于珊珊+劉瑩瑩+齊超波

摘要：為研究鹽度對仿刺參（Apostichopus japonicus）蛋白攝入量及蛋白酶活性的影響，通過考馬斯亮藍(lán)G250染色法間接測定仿刺參蛋白攝入量，福林-酚法測定仿刺參消化道蛋白酶活力。結(jié)果表明，在鹽度為3.1%時(shí)，仿刺參蛋白攝入量最多，消化道蛋白酶活力最強(qiáng)；在鹽度2.5%～3.1%范圍內(nèi)，隨著鹽度的升高，仿刺參蛋白攝入量和消化道蛋白酶活力逐漸升高；在3.1%～3.4%范圍內(nèi)，隨著鹽度升高，仿刺參蛋白攝入量和消化道酶活力均下降。鹽度對仿刺參蛋白攝入量及蛋白酶活性的影響明顯。

關(guān)鍵詞：仿刺參（Apostichopus japonicus）；鹽度；蛋白質(zhì)；蛋白酶

中圖分類號(hào)：S968.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）06-1096-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.06.026

Abstract：In order to study on effects of salinity on protein intake and protease activity of Apostichopus japonicus，the intake proteins and the activities of protease were determined by Xylene brilliant cyanin G250 method and Folin-phenol method. The results showed that salinity had significant effects on the intake proteins and the activities of protease. The optimum salinity of the protein and protease was 31. More or less 31 caused the decline of the intake proteins and the activities of protease.

Key words：Apostichopus japonicus； salinity； protein； protease

仿刺參（Apostichopus japonicus）隸屬于棘皮動(dòng)物門（Echinopermata）海參綱（Holothuriodea）楯手目（Aspidochirotida）仿刺參科（Stichopodidae）仿刺參屬（Apostichopus），是中國近年來大力發(fā)展的海珍品之一。仿刺參為溫帶種類，主要分布于西北太平洋沿岸，北起俄羅斯的海參崴，經(jīng)日本海、朝鮮半島南部到中國黃海、渤海沿岸[1]。仿刺參成分分析可知，每百克生鮮仿刺參含蛋白質(zhì)21.50 g、脂肪0.30 g、碳水化合物1.00 g、鈣118 mg、鐵1.40 mg，內(nèi)臟中含有豐富的粗蛋白、粗脂肪、酸性粘多糖，營養(yǎng)價(jià)值與藥用價(jià)值極高。

20世紀(jì)90年代初，疾病爆發(fā)使對蝦養(yǎng)殖業(yè)遭受重創(chuàng)，位于潮間帶的養(yǎng)蝦池塘被改造用于養(yǎng)殖刺參[2]，池塘養(yǎng)參具有較大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值與生態(tài)效益。養(yǎng)參池塘位于潮間帶，鹽度變化范圍較大，而鹽度變化必然會(huì)對刺參的生長發(fā)育帶來一系列的影響。鹽度對刺參生長方面的研究主要側(cè)重于對呼吸和排泄的影響[1]；鹽度因子對刺參生長及行為的影響[3]；鹽度對刺參特定生長率（SGR）的影響[4]；鹽度驟降對幼仿刺參生長、免疫指標(biāo)及呼吸樹組織結(jié)構(gòu)的影響[5]等方面。

隨著海參養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，了解仿刺參的營養(yǎng)學(xué)和消化生理學(xué)等內(nèi)在因素成為健康養(yǎng)殖的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，本試驗(yàn)采用生物化學(xué)手段，分析了鹽度對仿刺參蛋白攝入量及蛋白酶活性的影響，以期為進(jìn)一步探究仿刺參內(nèi)在生理特性與環(huán)境因子的關(guān)系提供依據(jù)，為仿刺參的養(yǎng)殖、餌料配比提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用仿刺參購于威海經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)金鑫生物科技有限公司養(yǎng)殖場，選購長4 cm，體重5 g左右，伸展自如，疣刺堅(jiān)挺，體表無損傷，對外刺激反應(yīng)迅速的幼參作為試驗(yàn)材料。置于自動(dòng)水循環(huán)系統(tǒng)的培養(yǎng)缸中培養(yǎng)7 d，海水鹽度2.8%，pH為8.0，水溫20 ℃；提供少量餌料，攝食期間停止增氧機(jī)，保持良好水質(zhì)。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑 考馬斯亮藍(lán)G250，福林試劑，0.1 mg/mL牛血清蛋白BSA，0.5%的酪蛋白溶液，磷酸鹽緩沖液（pH 7.2），10%三氯醋酸，0.4 mol/mL的碳酸鈉溶液，酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液等。

1.2.2 儀器 紫外分光光度計(jì)、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、恒溫水浴鍋、烘箱、冷凍柜等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 梯度設(shè)置 分別設(shè)置2.2%、2.5%、2.8%、3.1%、3.4% 5個(gè)鹽度梯度，用海鹽和曝氣自來水進(jìn)行調(diào)節(jié)。海參樣品運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后，在鹽度為2.8%的海水中暫養(yǎng)；用進(jìn)行不同鹽度的馴化，定時(shí)巡池，觀看仿刺參的攝食及生活狀態(tài)。

1.3.2 樣品制備

1）殘餌收集。進(jìn)入試驗(yàn)階段后，每天16：30投喂海參重量2%的餌料（餌料∶干海泥=1∶5），并于第二天9：00用虹吸法清除池內(nèi)糞便和殘餌作為樣品，帶回實(shí)驗(yàn)室，用烘箱烘干，備用。

2）粗酶液制備。取新鮮的海參解剖取出消化道，用冷卻去離子水洗凈后，按1 g腸道加入1 mL的磷酸緩沖液（pH 7.5），將勻漿液在4 ℃下10 000 r/min離心30 min，取上清液，冷凍柜中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 測定方法

1）考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白攝入量。仿刺參蛋白攝入量=投喂蛋白量-殘餌及糞便蛋白量?？捡R斯亮藍(lán)法測定餌料和樣品（殘餌糞便）蛋白含量，用1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液給各試管分別加入0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mL，然后用去離子水補(bǔ)至0.1 mL，各試管中再分別加入5.0 mL考馬斯亮藍(lán)G250試劑。稍加搖動(dòng)，混合均勻2 min后，即可開始用比色皿，在分光光度計(jì)上測定各樣品在595 nm處的吸光度，空白對照試管，即0.1 mL H2O加5.0 mL G250試劑。餌料及收集樣品烘干后用磷酸緩沖液（pH 7.2）進(jìn)行溶解，離心后取1 mL上清液按上述方法并從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得蛋白含量。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，即得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)測出的未知樣品的吸光度，可查出未知樣品的蛋白質(zhì)含量[6]，并利用表觀消化率分析鹽度對仿刺參蛋白攝入量的影響，表觀消化率=（投喂總蛋白含量-殘餌和糞便蛋白量）/投喂蛋白總量×100%。

2）福林-酚試劑法測定仿刺參消化道蛋白酶活力。向試管中加入0.5%的酪蛋白溶液2.0 mL和磷酸鹽緩沖液（pH 7.2） 4.0 mL，在40 ℃下保溫5 min，然后加入粗酶提液1.0 mL，保溫20 min，立即加入10%三氯醋酸2.0 mL終止反應(yīng)。取出3 000 r/min心10 min后的上清濾液1 mL，加入0.4 mol/L的碳酸鈉溶液5.0 mL，再加入1.0 mol/L的福林試劑1.0 mL，于40 ℃恒溫水浴中顯色20 min，在分光光度計(jì)680 nm波長下比色測定，以蒸餾水校零作為參照，對照管在加入粗酶提液前先加入2.0 mL 10%的三氯醋酸使酶失活，其他同測定管[7]。

蛋白酶活力單位定義：在pH 7.2和40 ℃下保溫20 min，1 g仿刺參消化道 1 min水解0.5%的酪蛋白產(chǎn)生1 g酪氨酸即為1個(gè)蛋白酶活力單位。

1.4 數(shù)據(jù)分析

樣品的數(shù)據(jù)均采用SPSS軟件進(jìn)行處理，進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽度對仿刺參蛋白攝入量的影響

利用表觀消化率進(jìn)行分析，更有效地表現(xiàn)鹽度對仿刺參蛋白攝入的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可以看出，養(yǎng)殖水體的鹽度對仿刺參蛋白攝入量有顯著的影響（P<0.05），在鹽度為2.2%～3.1%范圍內(nèi)，隨著鹽度的升高，仿刺參對蛋白的表觀消化率升高，對蛋白的攝入量增加；在鹽度為3.1%～3.4%范圍內(nèi)，隨鹽度的升高，仿刺參對蛋白的表觀消化率下降，即對蛋白的攝入量下降；鹽度過低、過高對于仿刺參消化吸收蛋白質(zhì)均有較大影響。

2.2 鹽度對蛋白酶活力的影響

由圖2可以看出，養(yǎng)殖水體鹽度對仿刺參腸道內(nèi)在的蛋白酶活力具有顯著影響（P<0.05），在鹽度為2.2%～3.1%范圍內(nèi)，隨著鹽度的升高，仿刺參消化道內(nèi)蛋白酶活力逐漸提高；當(dāng)鹽度大于3.1%后，隨著鹽度的升高，仿刺參消化道內(nèi)蛋白酶活力下降，鹽度過高或過低都會(huì)對酶的活力具有抑制作用。

3 小結(jié)與討論

本研究中仿刺參攝入蛋白利用率與其內(nèi)在蛋白酶的活性存在高度的相關(guān)性，鹽度通過影響其內(nèi)部消化道內(nèi)酶的活性，來調(diào)節(jié)仿刺參對蛋白質(zhì)的消化吸收。在鹽度3.1%時(shí)，仿刺參蛋白酶活力最高，對蛋白的消化吸收能力最強(qiáng)。鹽度是反映水中無機(jī)離子含量的指標(biāo)，水生動(dòng)物對環(huán)境的適應(yīng)一般圍繞其等滲點(diǎn)進(jìn)行滲透壓調(diào)節(jié)，而滲透壓調(diào)節(jié)是一需要耗費(fèi)能量的生理過程[3]，導(dǎo)致刺參生長發(fā)育受到影響[1]。鹽度在3.1%時(shí)，可能處在刺參等滲點(diǎn)的附近，刺參用于滲透壓調(diào)節(jié)的能量較少，故生長得快，吸收蛋白質(zhì)的能力及腸道內(nèi)蛋白酶活性最高。本研究中最適鹽度3.1%是刺參生長的最適鹽度，與王國利等[4]的研究結(jié)果一致。

蛋白質(zhì)是水產(chǎn)動(dòng)物發(fā)育過程重要的營養(yǎng)物質(zhì)，水產(chǎn)動(dòng)物的生長速度與其所攝食飼料的粗蛋白含量有密切關(guān)系，而消化酶活性的研究有助于更準(zhǔn)確地掌握水產(chǎn)動(dòng)物對飼料中蛋白質(zhì)的需求量[8]。仿刺參體內(nèi)存在多種蛋白酶，其活性不但隨著季節(jié)、水溫的變化而有顯著的變化[9，10]，而且受鹽度的影響也非常明顯，鹽度是反映水中無機(jī)離子含量的指標(biāo)，有研究報(bào)道，無機(jī)離子直接影響酶的產(chǎn)生可能是鹽度影響消化酶活性的主要原因之一[11]。本研究結(jié)果表明，鹽度對仿刺參消化道內(nèi)蛋白酶活力及蛋白質(zhì)的消化率具有顯著影響（P<0.05），其最適鹽度為3.1%。

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