五加芪粉對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖功能和抗體形成細(xì)胞的影響

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(國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心/洛陽惠中獸藥有限公司，河南洛陽471003)

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五加芪粉對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖功能和抗體形成細(xì)胞的影響

?？?，高艷艷，周德剛

(國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心/洛陽惠中獸藥有限公司，河南洛陽471003)

為了考察五加芪粉對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖功能和抗體形成細(xì)胞的影響，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，設(shè)不同劑量的(60、120、240 mg·kg·d-1)五加芪粉組，同時(shí)設(shè)黃芪多糖粉對(duì)照組和空白對(duì)照組。連續(xù)灌胃7 d后，無菌取小鼠脾臟，制備脾淋巴細(xì)胞，采用MTT法檢測(cè)小鼠淋巴細(xì)胞增殖功能，定量溶血分光光度(QHS)法測(cè)定小鼠抗體形成細(xì)胞。結(jié)果顯示：五加芪粉中、高劑量組可顯著(0.01

五加芪粉；淋巴細(xì)胞增殖；抗體形成細(xì)胞；小鼠

五加芪粉主要成分為黃芪和刺五加，黃芪主要活性成分為黃酮、皂苷和黃芪多糖(APS)?？傸S酮對(duì)小鼠具有免疫增強(qiáng)和調(diào)節(jié)作用。黃芪皂苷可保護(hù)心肌、增強(qiáng)心肌收縮力，改善心功能。黃芪多糖具有多重功效，可以提升動(dòng)物機(jī)體的免疫力、抗病力、降低發(fā)病率[1]、有抗腫瘤、抗病毒[2]、抗氧化、抗衰老作用[3]、同時(shí)可以保肝護(hù)腎、調(diào)節(jié)血糖[4]、補(bǔ)氣固表、利尿托毒、排膿、斂瘡生肌[5]，其中以免疫調(diào)節(jié)功能最為突出，能增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫的免疫功能[6]。

刺五加主要活性成分為黃酮、苷類、多糖等，其多糖是干擾素促誘生劑，通過提高干擾素的水平，提高機(jī)體免疫力[7]。黃芪和刺五加有相互協(xié)同的藥理作用，都能增強(qiáng)機(jī)體免疫力，配合疫苗使用可提高疫苗的免疫效果。

脾臟作為重要的外周免疫器官，含有T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞，其中T淋巴細(xì)胞主要參與細(xì)胞免疫，B細(xì)胞主要參與體液免疫。本研究通過無菌制備脾臟淋巴細(xì)胞懸液，采用MTT法和定量溶血分光光度測(cè)定(QHS)法分別檢測(cè)小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞體外增殖功能和B淋巴細(xì)胞功能。通過體液免疫和細(xì)胞免疫兩方面探討五加芪粉對(duì)機(jī)體免疫功能的影響，為其基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 6周齡的BALB/C小鼠120只，SPF級(jí)，雌雄各半，體重18～22 g，8周齡豚鼠6只，SPF級(jí)，雄性，體重250～300 g；均購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001。

1.2 試驗(yàn)藥品 五加芪粉：規(guī)格50 g:165 g生藥，批號(hào)20120203，由洛陽惠中獸藥有限公司提供；黃芪多糖粉：每1 g含黃芪多糖≥450 mg，批號(hào)1107121，愛迪森(北京)生物科技有限公司。

1.3 主要試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基，批號(hào)：1042186，Invitrogen公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)，批號(hào)：MKBH7489V，Sigma公司；胎牛血清，批號(hào)：NSF0051，?？寺∩锘瘜W(xué)制品(北京)有限公司；脫纖維綿羊血，批號(hào)：20140310，鄭州益康生物工程有限公司。

1.4 主要儀器 8000WJ-3423 CO2培養(yǎng)箱：美國(guó)Thermo公司；37XB生物顯微鏡：上海光學(xué)儀器六廠；Sunrise酶標(biāo)儀：瑞士Teacan公司；Nu-425-400S生物安全柜：美國(guó)Nuaire公司；TGL-16G臺(tái)式高速離心機(jī)：江蘇金壇市科興儀器廠。

2 方法

2.1 試劑配制

2.1.1 綿羊紅細(xì)胞懸液的制備 取脫纖維綿羊血20 mL，2500轉(zhuǎn)/min離心10 min，棄上清。加PBS液10 mL，重懸，重復(fù)洗滌3次后加入PBS液，配制10%和0.2%的綿羊紅細(xì)胞懸液。

2.1.2 補(bǔ)體的制備 取8 mL豚鼠血清加入2 mL壓縮體積的綿羊紅細(xì)胞，混勻，4 ℃冰箱放置1 h，2500轉(zhuǎn)/min離心5 min，取上清，用PBS液進(jìn)行20倍稀釋，備用。

2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分組 挑選體重在18～22 g的小鼠100只，隨機(jī)分為5組，每組20只，雌雄各半，具體分組見表1。五加芪組小鼠每日灌服0.2 mL濃度為6、12、24 mg/mL五加芪溶液1次，黃芪多糖組每日灌服0.2 mL濃度為12 mg/mL黃芪多糖溶液1次，空白組灌服等量的純化水，連續(xù)7 d。

表1 試驗(yàn)分組和給藥劑量

2.3 MTT法測(cè)定淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)2.3.1 脾臟淋巴細(xì)胞懸液的制備 第7次給藥后24 h，頸椎骨脫位法處死小鼠，每組10只，雌雄各半。酒精浸泡消毒后無菌取脾臟，D-Hank’s液漂洗后置于200目的無菌尼龍網(wǎng)上，用無菌玻璃針芯研磨，加D-Hank’s液過濾，2000轉(zhuǎn)/min離心5 min，去上清。加入4 mL紅細(xì)胞裂解液重懸，置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育10 min，2000轉(zhuǎn)/min離心5 min，去上清。用D-Hank’s液和完全1640培養(yǎng)液重復(fù)離心洗滌1次。用0.5%臺(tái)盼藍(lán)染色，取10 μL加入細(xì)胞計(jì)數(shù)板內(nèi)于顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞存活率在90%以上，且計(jì)數(shù)區(qū)域內(nèi)細(xì)胞分布均勻，時(shí)，計(jì)數(shù)四個(gè)大方格內(nèi)的活細(xì)胞數(shù)，根據(jù)以下公式計(jì)算每毫升細(xì)胞懸液中的活細(xì)胞濃度。根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，用完全1640培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)至1.5×106/mL。

細(xì)胞濃度(個(gè)/mL)=4個(gè)大方格中的細(xì)胞數(shù)/4×稀釋倍數(shù)×104

2.3.2 淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn) 采用MTT法測(cè)定淋巴細(xì)胞增殖。取分離得到的淋巴細(xì)胞于96孔板中，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h。在培養(yǎng)44 h后，每孔各加入5 mg/mL 的MTT10 μL(初始濃度為)繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔吸取上清液150 μL棄去，然后加入150 μL的DMSO，置微量振蕩儀振蕩10 min，使紫色結(jié)晶完全溶解，用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm波長(zhǎng)下OD值，作為T淋巴細(xì)胞增殖的指標(biāo)。

2.4 小鼠的抗體形成細(xì)胞試驗(yàn)

2.4.1 動(dòng)物的免疫 第7日給藥后，每組取10只小鼠，雌雄各半，每只小鼠腹腔注射10%的綿羊紅細(xì)胞0.5 mL。

2.4.2 脾臟淋巴細(xì)胞懸液的制備 免疫后第6日，頸椎脫臼處死免疫后的各組小鼠，常規(guī)取脾臟，分離脾淋巴細(xì)胞，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至5.0×106/mL。

2.4.3 脾細(xì)胞介導(dǎo)綿羊紅細(xì)胞定量溶血分光光度試驗(yàn)(QHS) 取小鼠脾臟淋巴細(xì)胞懸液1 mL，補(bǔ)體1 mL，0.2%綿羊紅細(xì)胞(SRBC) 1 mL，混勻，37 ℃水浴1 h，1500轉(zhuǎn)/min離心10 min，取上清液200 μL加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，用酶標(biāo)儀測(cè)定其在413 nm波長(zhǎng)處吸光度值，作為QHS反應(yīng)值。

3 結(jié)果與分析

3.1 MTT法測(cè)定淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn) 五加芪粉對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)各組淋巴細(xì)胞增殖結(jié)果見表2。從表2可以看出，給藥各組與空白對(duì)照組相比，小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的吸光度值均有不同程度的增高。其中，五加芪粉中劑量組、黃芪多糖粉對(duì)照組與空白對(duì)照組比，差異顯著(0.01

組別組名570nm的吸光度值與黃芪多糖粉對(duì)照組相比P值與空白對(duì)照組相比P值1五加芪粉低劑量組0.277±0.0270.1010.4152五加芪粉中劑量組0.299±0.0370.9150.021*3五加芪粉高劑量組0.311±0.0260.4270.002**4黃芪多糖粉對(duì)照組0.300±0.035—0.016*5空白對(duì)照組0.265±0.0300.016*—

表中“*”表示與空白對(duì)照組相比差異顯著(0.01

3.2 小鼠抗體形成細(xì)胞的影響 五加芪粉對(duì)小鼠抗體形成細(xì)胞的影響試驗(yàn)采用定量溶血分光光度法(QHS)對(duì)小鼠的QHS的影響結(jié)果見下表3。從表3可以看出，與空白對(duì)照組相比，五加芪粉各劑量組與黃芪多糖粉對(duì)照組脾細(xì)胞介導(dǎo)綿羊紅細(xì)胞定量溶血分光光度值均有明顯的增高。其中，五加芪粉低劑量組、黃芪多糖粉對(duì)照組與空白對(duì)照組比，差異顯著(0.01

組別組名413nm吸光度值與黃芪多糖粉對(duì)照組相比P值與空白對(duì)照組相比P值1五加芪粉低劑量組0.522±0.0740.9510.036*2五加芪粉中劑量組0.549±0.1070.5420.007**3五加芪粉高劑量組0.562±0.0890.3380.003**4黃芪多糖粉對(duì)照組0.525±0.060—0.031*5空白對(duì)照組0.438±0.0960.031*—

4 討論與小結(jié)

中藥黃芪和刺五加都具有提高機(jī)體免疫力的功效，試驗(yàn)主要研究黃芪和刺五加提取的五加芪粉，通過采用MTT法測(cè)定淋巴細(xì)胞增殖功能，反應(yīng)細(xì)胞免疫功能，QHS法測(cè)定小鼠的抗體形成細(xì)胞，反應(yīng)體液免疫功能。

脾臟淋巴細(xì)胞增殖功能的高低反映了機(jī)體細(xì)胞免疫功能的狀態(tài)。ConA(刀豆蛋白A)可誘導(dǎo)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖，ConA促進(jìn)有絲分裂，能選擇性的作用于T細(xì)胞。參與細(xì)胞免疫，促進(jìn)其增殖轉(zhuǎn)化。五加芪粉灌胃后，小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖的吸光度值與增殖能力呈正比，吸光度值增高，對(duì)ConA的刺激反應(yīng)增強(qiáng)，表明五加芪粉具有促進(jìn)細(xì)胞免疫功能的作用。劉永杰等[7]研究發(fā)現(xiàn)雛雞注射黃芪多糖后，淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)均增加或顯著增加，說明黃芪多糖能明顯提高機(jī)體免疫功能。王遠(yuǎn)閣等[8]研究黃芪多糖(APS)、牛膝多糖(ABPS)、板藍(lán)根多糖(IRPS)、山藥多糖(DOPS)等4種中藥多糖用MTT法測(cè)定淋巴細(xì)胞增殖的變化。結(jié)果表明4種多糖在適宜的濃度下均能促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖作用。

以上文獻(xiàn)報(bào)道與本試驗(yàn)結(jié)果一致，均表明多糖類成分能明顯協(xié)同ConA刺激淋巴細(xì)胞增殖，促進(jìn)白細(xì)胞介素-2 (IL-2)產(chǎn)生及協(xié)同細(xì)菌脂多糖(LPS)的作用，同時(shí)能增強(qiáng)B淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的功能，增強(qiáng)正常小鼠外周血NK細(xì)胞的活性，刺激NK細(xì)胞增殖，對(duì)小鼠的免疫功能具有較好的促進(jìn)作用。

體液免疫是機(jī)體特異性免疫的重要組成部分，負(fù)責(zé)體液免疫的細(xì)胞是B細(xì)胞。脾細(xì)胞介導(dǎo)綿羊紅細(xì)胞定量溶血分光光度值的高低反映了脾臟中B細(xì)胞分泌抗體的能力，是評(píng)價(jià)動(dòng)物機(jī)體體液免疫功能的重要指標(biāo)。五加芪粉各劑量組可提高脾細(xì)胞介導(dǎo)綿羊紅細(xì)胞定量溶血分光光度值，表明五加芪粉具有提升動(dòng)物體液免疫能力的作用。王志強(qiáng)[9]等采用定量溶血分光光度測(cè)定法(QHS)體外測(cè)定B細(xì)胞產(chǎn)生分泌抗體水平，結(jié)果表明黃芪能增強(qiáng)小鼠抗體形成細(xì)胞活性，促進(jìn)B細(xì)增殖。高春艷[10]等研究結(jié)果表明復(fù)方黃芪煎劑可以明顯提高小鼠脾臟抗體形成細(xì)胞(PFC)的數(shù)量，具有改善體液免疫功能的作用。以上文獻(xiàn)資料報(bào)道與本試驗(yàn)結(jié)果一致，均表明多糖類中藥能增強(qiáng)小鼠抗體形成細(xì)胞(B細(xì)胞)活性，促進(jìn)B細(xì)胞分化、增殖為漿細(xì)胞，同時(shí)可增加脾臟重量，促進(jìn)免疫細(xì)胞的分裂繁殖，明顯增強(qiáng)小鼠抗體形成，對(duì)體液免疫和細(xì)胞免疫功能有促進(jìn)作用。

隨著畜牧養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展和集約化養(yǎng)殖的增加，畜禽的疾病也越來越復(fù)雜，由于頻繁和不正當(dāng)?shù)氖褂每股剡M(jìn)行病菌感染的治療和預(yù)防，導(dǎo)致耐藥性和藥物殘留問題，嚴(yán)重危害環(huán)境和人類健康。我國(guó)中藥資源豐富，研究歷史深遠(yuǎn)，由于中藥具有毒性小、無耐藥性等優(yōu)勢(shì)，采用中藥制劑對(duì)畜禽疾病進(jìn)行預(yù)防治療，意義深遠(yuǎn)。本試驗(yàn)通過研究中藥五加芪粉對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖和抗體形成細(xì)胞水平的影響，表明五加芪粉可提高機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫功能，具有提升機(jī)體免疫力的作用。

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(編輯：陳希)

Influence of Wujiaqi Powder on Lymphocyte Proliferation and Antibody-Forming Cells of Mice

SANG Ka-na，GAO Yan-Yan，ZHOU De-gang

(LuoyangHuizhongAnimalMedicineCo.，Ltd，NationalResearchCenterforVeterinaryMedicine，Luoyang，Henan471003，China)

Explored the effect of Wujiaqi powder on lymphocyte proliferation and antibody-forming cells of mice, and to provide theoretical basis for clinical application．Three groups of Wujiaqi powder with different doses(60, 120, 240 mg·kg·d-1) were explored and with the astragalin polysaccharides group and blank group as control group. After 7 d of continuous intragastrical administration and spleen lymphocytes cells were prepared by aseptic separation.Using MTT to measure the proliferations of T lymphocytes,and (QHS)to analyze antibody-forming cells. The results show that: themiddle and high dose groups of Wujiaqi powder can significantly(0.01

Wujiaqi powder; lymphocyte proliferation; antibody -forming cells; mice

桑卡娜，碩士，從事新獸藥藥效評(píng)價(jià)工作。E-mail：kanasanglp@163.com

2016-12-05

A

1002-1280 (2017) 03-0044-04

S853.74