不同蛋白酶對小麥蛋白酶解物抗氧化活性的影響

鄭志強(qiáng)，李寶林，郝利民，郭順堂*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.中央軍委后勤保障部軍需裝備研究所，北京 100010；3.江蘇智薈生物科技有限公司，江蘇 徐州 221222）

不同蛋白酶對小麥蛋白酶解物抗氧化活性的影響

鄭志強(qiáng)1,2，李寶林3，郝利民2，郭順堂1,*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.中央軍委后勤保障部軍需裝備研究所，北京 100010；3.江蘇智薈生物科技有限公司，江蘇 徐州 221222）

小麥蛋白是小麥淀粉加工的副產(chǎn)物，酶解是提高小麥蛋白溶解性和功能性的有效方式，而酶解用酶種類可能對酶解產(chǎn)物的功能性如抗氧化活性有一定影響。采用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶6 種常用的蛋白酶分別對小麥蛋白進(jìn)行酶解，并對酶解4 h后酶解物的多肽得率、分子質(zhì)量分布、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率、超氧陰離子自由基（O2-·）清除率、羥自由基（·OH）清除率等反映水解程度和抗氧化能力的主要指標(biāo)進(jìn)行評價(jià)。結(jié)果表明，風(fēng)味蛋白酶酶解物中多肽得率最高，達(dá)91.44%，且分子質(zhì)量小于3 000 D的多肽含量達(dá)76.9%；酶解物質(zhì)量濃度為3 mg/mL時(shí)，木瓜蛋白酶酶解物對DPPH自由基清除作用最好，清除率為65.12%（P＜0.01），其次是風(fēng)味蛋白酶（58.43%）和堿性蛋白酶（55.29%）；堿性蛋白酶酶解物對O2-·清除率效果最好，清除率為58.68%（P＜0.01），其次是風(fēng)味蛋白酶（49.25%）；堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解物對·OH清除效果最佳，清除率分別為59.23%和58.16%。結(jié)果說明，蛋白酶種類對小麥蛋白酶解物抗氧化活性影響顯著，風(fēng)味蛋白酶對提高蛋白水解程度和生成小分子質(zhì)量多肽的作用明顯，而堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶對提高酶解產(chǎn)物抗氧化活性效果較好。

蛋白酶；小麥蛋白；抗氧化活性；自由基清除活性

我國是小麥生產(chǎn)大國，據(jù)國家統(tǒng)計(jì)局?jǐn)?shù)據(jù)顯示，2015年我國小麥產(chǎn)量達(dá)到1.3億噸。但是，我國對小麥的深加工研究及應(yīng)用較少，尤其是對小麥淀粉生產(chǎn)的副產(chǎn)物小麥蛋白的開發(fā)研究還處于起步階段。小麥蛋白，俗稱谷朊粉，其蛋白質(zhì)含量高達(dá)75%～85%，主要由麥醇溶蛋白和麥谷蛋白組成[1]。小麥蛋白中的氨基酸組成比較齊全，是營養(yǎng)豐富、物美價(jià)廉的植物性蛋白源。近年來，隨著對植源性蛋白質(zhì)研究的深入，越來越多的研究者將具有良好的生物活性功能的植源蛋白水解物作為研究的重點(diǎn)。小麥肽作為小麥蛋白水解的主要產(chǎn)物，其中分子質(zhì)量更小功能更強(qiáng)的小麥低聚肽成為了國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。2012年9月5日，衛(wèi)生部發(fā)布《關(guān)于批準(zhǔn)中長鏈脂肪酸食用油和小麥低聚肽作為新資源食品等的公告》（衛(wèi)生部公告2012年第16號(hào)）批準(zhǔn)小麥低聚肽作為新資源食品。因此，研究應(yīng)用小麥肽不僅可實(shí)現(xiàn)小麥的高附加值，而且也可為開發(fā)功能性產(chǎn)品提供可靠的食源性基料。

國內(nèi)外眾多學(xué)者聚焦在小麥蛋白酶解物的抗氧化活性如清除機(jī)體自由基能力方面的研究。?ili?等[2]研究表明小麥蛋白酶解物的清除自由基能力強(qiáng)于豆類蛋白質(zhì)酶解物的清除能力。Zhu Kexue等[3]同樣研究表明小麥蛋白酶解物具有抗氧化性和游離自由基清除能力。曾瑜等[4]提出小麥肽在體內(nèi)和體外均有良好的抗氧化效果。Wang Jinshui等[5]利用木瓜蛋白酶水解小麥蛋白得到具有抗氧化特性的水解產(chǎn)物。酶解是獲得高抗氧化小麥肽的主要方式和關(guān)鍵環(huán)節(jié)，通過酶解改性，提高了小麥蛋白的溶解性，同時(shí)也提高了其抗氧化功能特性。因此，在酶解過程中，用酶的選擇對于小麥蛋白酶解物抗氧化活性的高低至關(guān)重要，但關(guān)于小麥蛋白酶解用酶的文獻(xiàn)報(bào)道多是采用指定的酶制劑進(jìn)行酶解實(shí)驗(yàn)，而針對不同酶制劑對抗氧化活性的影響差異研究較少，為此，本研究將采用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶6 種常用的蛋白酶對小麥蛋白進(jìn)行酶解，對酶解4 h后酶解物的多肽得率、分子質(zhì)量分布、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率、超氧陰離子自由基（O2-·）清除率、羥自由基（·OH）清除率等反映水解程度和抗氧化能力的主要指標(biāo)進(jìn)行評價(jià)，分析不同蛋白酶種類對小麥蛋白酶解物抗氧化活性的影響，確定產(chǎn)生高抗氧化活性的最佳用酶，進(jìn)而對功能性小麥肽的制備與產(chǎn)業(yè)開發(fā)提供可靠的理論依據(jù)和參考借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥蛋白（蛋白質(zhì)含量81.91%） 商丘華陽生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司。

堿性蛋白酶（217 434 U/mL）、中性蛋白酶（102 786 U/mL）、胃蛋白酶（67 800 U/g）、風(fēng)味蛋白酶（30 916 U/mL）、胰蛋白酶（361 335 U/g）、木瓜蛋白酶（71 461 U/g） 諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司；其他所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A高效液相色譜儀 日本島津公司；LGJ-10真空冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；CR22G高速冷凍離心機(jī) 日本日立公司；SHZ-B水浴恒溫振蕩器 上海五相儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶解工藝流程

小麥蛋白100 g→加900 mL去離子水混合→在設(shè)定溫度（酶對應(yīng)最適溫度）的水浴鍋中保溫→用1.0 mol/L NaOH或HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值于設(shè)定條件下（酶對應(yīng)最適pH值）→加入2 000 U/g酶開始酶解→酶解過程中每20 min用1.0 mol/L NaOH或HCl調(diào)節(jié)溶液pH值保持不變→攪拌酶解4 h→酶解結(jié)束后沸水滅酶10 min →冷卻后3 000 r/min離心20 min→取上清液冷凍干燥→-20 ℃保存待用。不同蛋白酶酶解最適溫度和最適pH值見表1。

表1 不同蛋白酶酶解最適溫度和最適pH值Table 1 Optimal reaction temperature and pH for different proteases

1.3.2 多肽得率的測定

三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）是一種蛋白質(zhì)沉淀劑，可以沉淀蛋白質(zhì)和較長的肽段。蛋白質(zhì)在酶解過程中肽鏈逐漸被切成長短不一的片段，由于TCA可沉淀肽段導(dǎo)致其氮溶指數(shù)（soluble nitrogen index，NSI）隨著酶解時(shí)間的延長逐步提高。因此，TCA-NSI可準(zhǔn)確反映蛋白質(zhì)的酶解情況，也是蛋白質(zhì)水解度的主要檢測指標(biāo)，TCA-NSI越高，表明多肽得率越高。對不同蛋白酶分別酶解1、2、3、4 h酶解物的TCA-NSI進(jìn)行測定，測定方法采用TCA-NSI法[6]。

式中：TCA-NSI得率為TCA可溶性氮得率/%；m0為原料中總氮質(zhì)量/mg；m1為在10% TCA中可溶性氮質(zhì)量/mg。

1.3.3 酶解物分子質(zhì)量分布測定

小麥蛋白經(jīng)蛋白酶酶解后可產(chǎn)生分子質(zhì)量大小不同的多肽和氨基酸，酶解物分子質(zhì)量大小是反映蛋白酶解程度的重要指標(biāo)，不同蛋白酶作用于同一底物，由于各蛋白酶酶解特性的差異可導(dǎo)致酶解物分子質(zhì)量分布的不同。本實(shí)驗(yàn)將對不同蛋白酶酶解小麥蛋白4 h后的酶解物進(jìn)行分子質(zhì)量分布測定，測定方法參照GB/T 22729—2008《海洋魚低聚肽粉》中的附錄A[7]，采用高效凝膠過濾色譜法測定。

色譜條件如下：色譜柱：TSKgel G2000 SWXL（300 mm×7.8 mm）；流動(dòng)相：乙腈-水-三氟乙酸體積比為45∶55∶0.1；檢測波長：220 nm；流速：0.5 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL。

以桿菌肽（Mw＝1 450 D）、細(xì)胞色素C（Mw＝12 500 D）、抑肽酶（Mw＝6 500 D）、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（Mw＝451 D）和乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（Mw＝189 D）為標(biāo)準(zhǔn)品作分子質(zhì)量校正曲線，得到分子質(zhì)量的對數(shù)與保留時(shí)間之間的回歸方程y＝-0.209 5 x+ 6.608 1（R2=0.997 5）。將樣品的色譜數(shù)據(jù)代入校正曲線方程計(jì)算，即可得出樣品的分子質(zhì)量以及分布范圍。

1.3.4 DPPH自由基清除率的測定

DPPH自由基是一種在醇溶液中穩(wěn)定的自由基，在517 nm波長處有最大吸光度，當(dāng)遇到氫供體如抗氧化劑時(shí)，自由基單電子與氫結(jié)合，在517 nm波長處吸光度變小，而吸光度變小的程度與自由基被清除的程度呈定量關(guān)系，從而反映抗氧化活性的強(qiáng)弱[8]。

對不同蛋白酶酶解小麥蛋白4 h后酶解物的DPPH自由基清除率進(jìn)行測定[9]。取DPPH溶液2 mL，加95%乙醇（或無水乙醇）1 mL，充分混合，測517 nm波長處吸光度（A0）；取DPPH溶液2 mL，加樣品液，再加95%乙醇（或無水乙醇），混合，靜置30 min后，測517 nm波長處吸光度（A）。DPPH自由基清除率的計(jì)算見公式（2）。

1.3.5 O2-·清除率的測定

O2-·通過歧化作用可產(chǎn)生過氧化氫和·OH，這些自由基及產(chǎn)物可抑制生物體中各類酶的活性，殺死正常細(xì)胞，破壞細(xì)胞膜和DNA的結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致機(jī)體正常細(xì)胞的功能受到損傷[10]。因此，O2-·對人體健康有很大影響，對該自由基的清除活性可作為評價(jià)小麥蛋白酶解物抗氧化能力大小的重要指標(biāo)。

對不同蛋白酶酶解小麥蛋白4 h后酶解物的O2-·清除率進(jìn)行測定[11]。取2 950 μL Tris-HCl緩沖液，再加50 μL聯(lián)苯三酚溶液，迅速混合，開始計(jì)時(shí)，每隔30 s讀數(shù)325 nm波長處吸光度（A1），至300 s時(shí)為止（A2），計(jì)算ΔA0=A1-A2；取樣品溶液，加Tris-HCl緩沖液，再加聯(lián)苯三酚溶液，迅速混合，開始計(jì)時(shí)，每隔30 s讀數(shù)325 nm波長處吸光度（A樣1），至300 s時(shí)為止（A樣2），計(jì)算ΔA樣=A樣1-A樣2。O2-·清除率的計(jì)算見公式（3）。

1.3.6 ·OH清除率的測定

·OH是非常活躍并易發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的自由基，在銅或鐵離子的存在下可由O2-·和過氧化氫反應(yīng)形成。·OH非常容易與氨基酸、蛋白質(zhì)、DNA等生物分子發(fā)生反應(yīng)，也可引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[12-13]。因此，清除·OH可能是機(jī)體抗氧化或抗某些疾病的最有效方式之一，·OH清除率大小可作為評價(jià)抗氧化活性的重要指標(biāo)。

對不同蛋白酶酶解小麥蛋白4 h后酶解物的·OH清除率進(jìn)行測定[14]。取1.0 mL濃度為1.865 mmol/L鄰二氮菲的無水乙醇溶液，分別加入濃度為0.2 mol/L的pH 7.4磷酸鹽緩沖液2 mL和1 mL不同質(zhì)量濃度的樣品，充分混勻后加入1.0 mL濃度為1.865 mmol/L的FeSO4·7H2O溶液，再次混勻后加入1.0 mL體積分?jǐn)?shù)0.03%的H2O2，于37 ℃恒溫水浴，60 min后，在532 nm波長處分別測量各組混合溶液的吸光度得AS，以蒸餾水代替樣品作為空白組測吸光度得Ab，以蒸餾水替代H2O2作為損傷組，測其吸光度An?！H清除率的計(jì)算見公式（4）。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥蛋白酶解物多肽得率的變化

圖1 不同蛋白酶酶解小麥蛋白多肽得率變化Fig. 1 Polypeptide yields from wheat gluten hydrolysis by different proteases

由圖1可知，不同蛋白酶酶解小麥蛋白過程中TCANSI得率隨著酶解時(shí)間的延長均呈增長趨勢，其中酶解1 h時(shí)的多肽含量均已達(dá)到酶解4 h時(shí)的一半以上，表明各蛋白酶酶解初期的酶解速度均較快。酶解4 h后，風(fēng)味蛋白酶酶解所得酶解物中多肽得率最高，達(dá)91.44%，與其余各組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），其次是堿性蛋白酶，多肽得率為76.89%，胰蛋白酶最低。多肽得率高意味著蛋白的水解程度高，這對賦予酶解物抗氧化活性具有重要作用。風(fēng)味蛋白酶是一種微生物來源的內(nèi)切酶和外切酶的復(fù)合物，可從肽鏈的任意一端切下一個(gè)單位氨基酸殘基，也可在多肽鏈的內(nèi)部破壞肽鍵，進(jìn)而提高蛋白水解度，并產(chǎn)生一系列分子質(zhì)量不同的多肽，同時(shí)由于外切酶的作用可產(chǎn)生大量的氨基酸態(tài)氮，從而抑制酶解物苦味，賦予良好風(fēng)味[15]。堿性蛋白酶是一種非特異性內(nèi)切蛋白酶，主要裂解疏水性氨基酸如纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸等，這導(dǎo)致酶解物中含有大量的疏水性氨基酸和終端為疏水性氨基酸的多肽，而疏水性氨基酸在終端比在肽鏈間呈苦味小，有利于消除蛋白酶解液的苦味[16]。因此，從提高小麥蛋白水解程度以及抑制或消除苦味的角度分析，風(fēng)味蛋白酶和堿性蛋白酶是制備高抗氧化活性小麥肽的最佳用酶。

2.2 小麥蛋白酶解物分子質(zhì)量分布

表2 不同蛋白酶酶解小麥蛋白酶解物的分子質(zhì)量分布Table 2 Molecular weight distribution of wheat gluten hydrolysates produced by different proteases

由表2可知，不同蛋白酶酶解小麥蛋白后酶解物中含有大量的小分子質(zhì)量多肽(180～3 000 D)、部分氨基酸（小于180 D），其中風(fēng)味蛋白酶酶解物中小分子質(zhì)量的多肽含量最高，其次是堿性蛋白酶，胰蛋白酶最少。風(fēng)味蛋白酶酶解物中分子質(zhì)量小于3 000 D的多肽含量達(dá)76.9%，分子質(zhì)量小于1 000 D的低聚肽含量達(dá)70.91%；而胰蛋白酶酶解物中分子質(zhì)量小于3 000 D的多肽含量為43.17%，分子質(zhì)量小于1 000 D的低聚肽含量只有22.26%。酶解物中小分子質(zhì)量肽所占比例越大，代表其水解程度越高，此外，大量研究表明低分子質(zhì)量的小麥肽尤其是低聚肽具有良好的抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、降血壓等生物活性功能。Mendis等[17]研究發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量小于3 000 D的多肽具有良好的抗氧化功能。Gauthier等[18]從小麥蛋白中經(jīng)過酶解獲得了具有免疫調(diào)節(jié)功能的肽。Thewissen等[19]研究表明小麥肽可明顯抑制ACE活性，具有良好的降血壓效果。因此，從提高小麥蛋白酶解物抗氧化等生物活性功能角度出發(fā)，風(fēng)味蛋白酶是小麥蛋白酶解的最佳用酶，堿性蛋白酶其次，胰蛋白酶的作用效果最差。

2.3 小麥蛋白酶解物DPPH自由基清除活性

圖2 不同蛋白酶酶解小麥蛋白酶解物在不同質(zhì)量濃度條件下對DPPH自由基清除率的影響Fig. 2 DPPH radical scavenging activity of different concentrations of wheat gluten hydrolysates produced by different proteases

由圖2可知，不同蛋白酶酶解小麥蛋白酶解物清除DPPH自由基能力與酶解物質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，當(dāng)質(zhì)量濃度值小于1 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率增長較緩，所有蛋白酶酶解物肽質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)對應(yīng)的清除率均不到30%；當(dāng)質(zhì)量濃度值大于1 mg/mL時(shí)，各蛋白酶酶解物的DPPH自由基清除率均呈明顯的增加趨勢，因此，1 mg/mL可在一定程度上被視為清除DPPH自由基最低的有效肽質(zhì)量濃度。針對不同蛋白酶的作用效果可以看出，3 mg/mL質(zhì)量濃度條件下，木瓜蛋白酶對DPPH自由基清除作用最好，清除率達(dá)65.12%，與其余各組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）；其次是風(fēng)味蛋白酶和堿性蛋白酶，清除率分別為58.43%和55.29%，二者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但與其余各組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）；而兩種動(dòng)物蛋白酶胃蛋白酶和胰蛋白酶作用效果較差。木瓜蛋白酶是一種底物特異性內(nèi)切酶，屬巰基蛋白酶，作用位點(diǎn)廣泛，可從蛋白質(zhì)分子內(nèi)部切開肽鏈而生成小分子質(zhì)量的具有生物活性功能的多肽。木瓜蛋白酶是酶解小麥蛋白并產(chǎn)生高抗氧化活性組分的優(yōu)質(zhì)酶制劑，Wang Jinshui等[5]采用木瓜蛋白酶對小麥蛋白進(jìn)行酶解，酶解物以及對酶解物進(jìn)行進(jìn)一步超濾分離所得的分子質(zhì)量更小的組分均展示了很強(qiáng)的DPPH自由基清除能力。堿性蛋白酶主要裂解疏水性氨基酸，而風(fēng)味蛋白酶的外切酶特性可將含有疏水性氨基酸的短肽鏈末端切斷釋放氨基酸并進(jìn)一步徹底降解為氨基酸，這可增加酶解物中疏水性氨基酸含量。DPPH自由基清除能力可能與疏水性氨基酸含量有關(guān)，據(jù)報(bào)道，蛋白酶解物含有較高DPPH自由基清除活性與高含量的疏水性氨基酸或肽有關(guān)聯(lián)[20]。因此，本實(shí)驗(yàn)利用6 種蛋白酶分別酶解小麥蛋白的酶解物均呈現(xiàn)良好的DPPH自由基清除活性，其中木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和堿性蛋白酶的清除作用最好，從清除DPPH自由基角度出發(fā)，以上3 種蛋白酶是酶解小麥蛋白產(chǎn)生高抗氧化活性物質(zhì)的最佳用酶。

2.4 小麥蛋白酶解物O2-·清除活性

圖3 不同蛋白酶酶解小麥蛋白酶解物在不同質(zhì)量濃度條件下對清除率的影響Fig. 3 Superoxide anion radical activity of different concentrations of wheat gluten hydrolysates produced by different proteases

由圖3可知，不同蛋白酶酶解小麥蛋白酶解物清除O2-·能力均隨酶解物質(zhì)量濃度的增加而呈逐漸增強(qiáng)的趨勢，其中堿性蛋白酶清除效果最好，其次是風(fēng)味蛋白酶，胰蛋白酶最差。當(dāng)酶解物質(zhì)量濃度為3 mg/mL時(shí)，堿性蛋白酶酶解物的O2-·清除率為58.68%，與其余各組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）；風(fēng)味蛋白酶O2-·清除率為49.25%，與其余各組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01，P＜0.05）。程云輝等[21]采用堿性蛋白酶制備麥胚抗氧化肽的O2-·清除率可達(dá)56.38%。堿性蛋白酶酶解物清除O2-·效果好和堿性蛋白酶酶解蛋白可產(chǎn)生大量的疏水性氨基酸有關(guān)，Suetsuna等[22]對小麥蛋白中的抗氧化肽進(jìn)行提取和結(jié)構(gòu)鑒定，結(jié)果鑒定出兩條具有抗氧化活性的肽鏈，兩條肽鏈的終端均含有疏水性氨基酸丙氨酸或亮氨酸，這說明了疏水性氨基酸易于與自由基結(jié)合從而產(chǎn)生良好的抗氧化效果。此外，Saito等[23]研究表明His、Pro和Tyr殘基在抗氧化肽清除自由基能力方面起著非常重要的作用，而小麥蛋白酶解物中總氨基酸含量為939 mg/g，Pro含量達(dá)100 mg/g，His含量為75 mg/g，Tyr含量為48 mg/g，上述3 種氨基酸含量占比為23.7%[5]，這也解釋了小麥蛋白酶解物具有清除O2-·能力的原因。因此，本實(shí)驗(yàn)利用6 種蛋白酶分別酶解小麥蛋白的酶解物對O2-·均有一定的清除效果，其中堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的清除作用最好，從清除O2-·角度出發(fā)，以上兩種蛋白酶是酶解小麥蛋白產(chǎn)生高抗氧化活性物質(zhì)的最佳用酶。

2.5 小麥蛋白酶解物·OH清除活性

圖4 不同蛋白酶酶解小麥蛋白酶解物在不同質(zhì)量濃度條件下對·OH清除率的影響Fig. 4 Hydroxyl radical scavenging activity of different concentrations of wheat gluten hydrolysates produced by different proteases

由圖4可知，不同蛋白酶酶解小麥蛋白酶解物清除·OH能力均隨酶解物質(zhì)量濃度的增加而呈逐漸增強(qiáng)的趨勢，質(zhì)量濃度與清除效果存在明顯的量效關(guān)系，清除效果最好的是堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶，在酶解物質(zhì)量濃度為3 mg/mL時(shí)二者清除率分別為59.23%和58.16%，二者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但與其余各組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。堿性蛋白酶酶解物良好的·OH清除效果和清除DPPH自由基和O2-·類似，主要原因均是由于堿性蛋白酶切割位點(diǎn)為疏水性氨基酸而導(dǎo)致產(chǎn)生良好的自由基清除能力。Zhu Kexue等[3]利用堿性蛋白酶對麥芽蛋白進(jìn)行酶解，經(jīng)測定，酶解物具有顯著的DPPH自由基、O2-·和·OH清除能力。陳美珍等[24]研究證實(shí)木瓜蛋白酶酶解大豆分離蛋白所得酶解物具有良好的清除·OH作用。邱春江等[25]對采用木瓜蛋白酶酶解文蛤蛋白制備的酶解物進(jìn)行了抗氧化活性測定，研究結(jié)果表明木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物對·OH的清除率可達(dá)到95.8%。因此，本實(shí)驗(yàn)采用的6 種蛋白酶分別酶解小麥蛋白所得酶解物均有清除·OH的效果，其中堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶作用效果最好，從清除·OH角度出發(fā)，以上兩種蛋白酶是酶解小麥蛋白產(chǎn)生高抗氧化活性物質(zhì)的最佳用酶。

3 結(jié) 論

本研究采用6 種不同蛋白酶分別對小麥蛋白進(jìn)行酶解，分析了不同蛋白酶對蛋白水解程度和酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響，結(jié)果顯示風(fēng)味蛋白酶對提高蛋白水解程度和生成小分子質(zhì)量多肽的作用明顯，而堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶對提高酶解產(chǎn)物抗氧化活性效果較好。隨著小麥肽抗氧化活性功能研究的深入，下一步應(yīng)重點(diǎn)對高抗氧化小麥肽段的分離鑒定，動(dòng)物體內(nèi)抗氧化效果評價(jià)以及人體臨床評價(jià)等方面開展研究。小麥肽不僅具有良好的抗氧化活性，而且還具有抗疲勞[26]、增強(qiáng)免疫力[18]、阿片活性[27-28]、抑制血壓升高[19,29-30]等多種生理活性，這些多樣化活性也將是小麥肽研究的重點(diǎn)方向。

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Effects of Different Proteases on Antioxidant Activities of Wheat Gluten Hydrolysates

ZHENG Zhiqiang1,2, LI Baolin3, HAO Limin2, GUO Shuntang1,*
(1. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China; 2. The Quartermaster Equipment Institute of Logistic Support Department, Central Military Commission, Beijing 100010, China; 3. Jiangsu Zhihui Biotechnology Co. Ltd., Xuzhou 221222, China)

Wheat gluten is a main by-product of wheat starch processing. Enzymatic hydrolysis is an effective way of improving the solubility and functionality of wheat gluten; however, protease type may influence the functionalities of wheat gluten hydrolysates such as antioxidant activities. Six frequently used proteases including Alcalase, Neutrase, Pepsin, Flavourzyme, Pancreatin and Papain were used for the hydrolysis of wheat gluten, and the degree of hydrolysis and antioxidant capacity of four-hour hydrolysates were evaluated in terms of polypeptide yield, molecular weight distribution, 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity, superoxide radical anion (O2-·) scavenging activity,and hydroxyl radical (·OH) scavenging activity. The results showed that Flavourzyme hydrolysate exhibited the highest polypeptide yield (91.44%), containing up to 76.9% polypeptide with a molecular weight of less than 3 000 D. Papain hydrolysate at a concentration of 3 mg/mL exhibited the best DPPH radical scavenging activity (65.12% scavenging percentage, P ＜ 0.01), followed by Flavourzyme hydrolysate (58.43%) and Alcalase hydrolysate (55.29%). Alcalase hydrolysate exhibited the best superoxide anion radical scavenging activity (58.68% scavenging percentage, P ＜ 0.01), followed by Flavourzyme hydrolysis (49.25%). Alcalase and Papain hydrolysates exhibited the best hydroxyl radical scavenging activity (scavenging percentages of 59.23% and 58.16%, respectively). Therefore, protease type had a notable effect on antioxidant activities of wheat gluten hydrolysates. In addition, Flavourzyme hydrolysis gave a significant improvement in the degree of hydrolysis and the formation of small polypeptides; moreover, Alcalase, Papain and Flavourzyme resulted in improved antioxidant activities of hydrolysates.

protease; wheat gluten; antioxidant activity; free radical scavenging activity

=162,ebook=168

10.7506/spkx1002-6630-201707026

TS210.9

A

1002-6630（2017）07-0161-06

2016-06-16

全軍后勤科研重點(diǎn)項(xiàng)目（AX110C002）

鄭志強(qiáng)（1984—），男，工程師，博士研究生，研究方向?yàn)榈鞍踪|(zhì)加工與利用。E-mail：zzq198408@126.com

*通信作者：郭順堂（1962—），男，教授，博士，研究方向?yàn)榈鞍踪|(zhì)加工與利用。E-mail：shuntang@cau.edu.cn

鄭志強(qiáng), 李寶林, 郝利民, 等. 不同蛋白酶對小麥蛋白酶解物抗氧化活性的影響[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(7): 161-166. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201707026. http://www.spkx.net.cn

ZHENG Zhiqiang, LI Baolin, HAO Limin, et al. Effects of different proteases on antioxidant activities of wheat gluten hydrolysates[J]. Food Science, 2017, 38(7): 161-166. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201707026. http://www.spkx.net.cn