基于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對急性血瘀證大鼠動物模型的代謝研究*

黃 爍，孫明謙，孫 蕾，劉建勛

(中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所， 北京市中藥藥理重點實驗室,北京 100091)

基于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對急性血瘀證大鼠動物模型的代謝研究*

黃 爍，孫明謙，孫 蕾，劉建勛△

(中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所， 北京市中藥藥理重點實驗室,北京 100091)

目的：通過基于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的代謝組學(xué)方法發(fā)掘急性血瘀證大鼠動物模型的潛在生物標(biāo)志物，探索該中醫(yī)證候模型的發(fā)病機(jī)制。方法：SD大鼠分為正常組和模型組，應(yīng)用液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用儀的代謝組學(xué)方法檢測急性血瘀證大鼠血清中代謝物的變化，通過PLS-DA等模式識別方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。結(jié)果：與正常組比較，模型組的脂肪酸代謝、磷脂酰膽堿代謝、神經(jīng)鞘磷脂代謝出現(xiàn)異常。結(jié)論：急性血瘀證模型中磷脂酰膽堿、脂肪酸、神經(jīng)鞘磷脂等成分的代謝都受到了干擾，這些代謝途徑的變化可能導(dǎo)致能量代謝的異常，影響血小板功能，進(jìn)而導(dǎo)致血瘀證的發(fā)生。

血瘀；代謝組學(xué)；生物標(biāo)記物； 液質(zhì)聯(lián)用

血瘀證是指人體內(nèi)血行不暢、壅阻血脈或血溢脈外、停積為瘀的證候。如何應(yīng)用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)手段對血瘀證的科學(xué)內(nèi)涵進(jìn)行闡釋，也是中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究的重要課題。代謝組學(xué)反映了多種因素作用下的終點效應(yīng),已經(jīng)在實驗動物模型評價中展現(xiàn)出其特色和優(yōu)勢[2-3]。其基于整體性研究和系統(tǒng)性的理念比較適合中醫(yī)藥作用的特點，將二者有機(jī)結(jié)合是非常有意義的工作[1]。本文擬采用高效液相串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜(LC-TOF-MS)結(jié)合多元統(tǒng)計分析方法，對急性血瘀證大鼠模型進(jìn)行代謝組學(xué)研究，發(fā)掘與血瘀證模型相關(guān)生物標(biāo)志物與相關(guān)代謝途徑，從而深入探索其發(fā)病機(jī)制。

1 材料

1.1 動物

SPF級健康雄性SD大鼠22只，體質(zhì)量(240±10)g，購于北京斯貝福實驗動物科技有限公司(許可證號SCXK(京)2011-0004)。

1.2 藥物及試劑

色譜純乙腈(美國Fisher 公司)、色譜純甲酸(美國J.T.BAKER公司)、純凈水(中國娃哈哈有限公司)、腎上腺素注射液(杭州和豐制藥有限公司)。

1.3 儀器

1200 HPLC 系統(tǒng)(美國Agilent公司)，LC-QTOF-MS 6520液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析儀(美國Agilent公司)，LBY-F/S5 體外血栓形成儀(北京普利生儀器有限公司)。

2 方法

2.1 分組方法

實驗大鼠飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院SPF級動物房，溫度(25±2)℃，濕度(40±5)%，大鼠隨意飲食飲水。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常對照組和急性血瘀證模型組，正常組10只，模型組12只。

2.2 急性血瘀證大鼠模型的建立

參照文獻(xiàn)方法[4-5]模型組按0.8 ml/kg體質(zhì)量皮下注射鹽酸異丙腎上腺素，對照組注射等容量的生理鹽水共2次，間隔4 h，于第1次注射后2 h，將大鼠放入0 ℃冰水中游泳5 min，然后取出擦干動物毛發(fā)水，禁食不禁水24 h。

2.3 大鼠體外血栓形成實驗方法

參照文獻(xiàn)[6-7]用硅化注射器穿刺腹主動脈取血2 ml，按照Chandler體外法立刻將血注入旋轉(zhuǎn)環(huán)內(nèi)，注入的血量充滿旋轉(zhuǎn)環(huán)1/2以下(1.8 ml)，迅速密封并置于血栓形成儀上， 旋轉(zhuǎn)10 min(37 ℃)傾出血栓，生理鹽水洗滌測量長度，再將血栓條置80 ℃烘箱恒溫烘烤3 h,恒重后稱其干重。

2.4 血液標(biāo)本的收集

于造模次日腹主動脈取血5 ml, 樣品經(jīng)3000 rpm， 室溫離心 10 min，取上清于-80 ℃冰箱保存。

2.5 液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用分析

2.5.1 代謝物萃取 血漿樣品在室溫下溶化后，取50 μl加入200 μl乙腈溶劑中振蕩混合均勻，室溫下靜止10 min，經(jīng)12000 rpm、 4 ℃離心 10 min，取上清液進(jìn)入LC-MS 分析，進(jìn)樣5 μl。

2.5.2 液相色譜條件 液相色譜為美國Agilent 1200 HPLC 系統(tǒng)，包括恒壓二元泵、脫氣機(jī)、自動進(jìn)樣器和柱溫箱。RPLC色譜柱 (X-bridge, C18, 3 μm, 2.1×100 mm, Waters, Ireland) 用于常規(guī)分離。流動相：A相：0.1% 甲酸溶液；B相：0.1% 甲酸乙腈，梯度為 35% B; 3 min, 60% B; 15 min, 75% B;20 min, 95% B; 22 min, 35% B; 25 min stop,平衡時間3 min。 流速為0.25 ml/min，柱溫為35 ℃。

2.5.3 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜分析采用美國Agilent 6520 series Time of Flight mass spectrometer equipped with an electro-spray ionization (ESI) Interface(LC-QTOF-MS)。采集模式為正離子，掃描范圍從80 到1000 m/z，質(zhì)譜數(shù)據(jù)儲存模式為centroid。霧化氣和干燥氣均為氮?dú)猓鲎矚鉃楹?。霧化溫度350℃，干燥氣10.0 L/min，霧化氣30 psi，毛細(xì)管電壓3500 eV。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

通過Mass Hunter 軟件產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，進(jìn)一步輸入到Mass profiler professor(MPP)軟件中進(jìn)行分析。MPP分別采用排列、歸一化、修正80%規(guī)則、數(shù)據(jù)集分割和數(shù)據(jù)縮放等方法對數(shù)據(jù)集進(jìn)行預(yù)處理，所得數(shù)據(jù)最后應(yīng)用SIMICAP+統(tǒng)計軟件作進(jìn)一步的 PLS-DA分析。

3 結(jié)果

3.1 大鼠體外血栓形成實驗結(jié)果

表1顯示，血瘀模型組與空白組比較，血栓的長度、干重都出現(xiàn)明顯的差異(P<0.05,P<0.05)，說明造模成功。

表1 大鼠體外血栓形成實驗結(jié)果

注： 與正常組比較：*P<0.05，**P<0.01

3.2 LC-MS的代謝輪廓圖

圖1顯示，本實驗采用HPLC-TOF-MS 對急性血瘀證大鼠模型血清中的成分進(jìn)行代謝組學(xué)分析。

圖1 LC-MS檢測樣品的總離子流圖 圖2 血清樣本PLS-DAscoreplots平面圖

3.3 多元數(shù)據(jù)分析

本實驗利用PLS-DA對急性血瘀證模型與正常組血清樣本進(jìn)行模式識別與區(qū)分。圖2為2組血清樣本的PLS-DA score plots 平面圖，結(jié)果顯示正常組和模型組呈現(xiàn)出明顯的區(qū)別，說明急性血瘀證大鼠動物模型的體內(nèi)代謝成分已經(jīng)受到干擾。PLS-DA數(shù)據(jù)模型參數(shù): R2=0.994，Q2=0.87。

3.4 潛在生物標(biāo)志物的篩選

表2顯示，在 PLS-DA 分析中以 VIP>1作為標(biāo)準(zhǔn)篩選模型上2組間分離有貢獻(xiàn)的變量，它們在模式識別中發(fā)揮重要作用，配合以 student’s t test (P<0.05) 作進(jìn)一步的篩選以獲得潛在的生物標(biāo)志物。通過METLIN、HMDB等數(shù)據(jù)庫對精確分子量、同位素比等數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，共篩選出13個生物標(biāo)志成分、大鼠急性血瘀證模型的潛在生物標(biāo)志成分及相關(guān)代謝途徑。

表2 大鼠急性血瘀證模型的潛在生物標(biāo)志成分及相關(guān)代謝途徑

4 討論

實驗結(jié)果顯示，模型組中 Arachidonyl lysolecithin，Linolenoyl lysolecithin 等磷脂酰膽堿類成分的含量大幅下降，提示在血瘀證大鼠動物模型中磷脂酰膽堿的代謝出現(xiàn)異常。在模型組中，磷脂酰膽堿的代謝速度加快，提示磷脂酶A2的活性可能上調(diào)，導(dǎo)致花生四烯酸、前列腺素、血小板活化因子等成分上調(diào)，進(jìn)而造成心血管疾病和血瘀的發(fā)生[8-9]。本實驗結(jié)果顯示，模型組中 7-palmitoleic acid、Linolenic acid 等脂肪酸含量明顯下降，而脂肪酸和磷脂的代謝與能量的代謝密切相關(guān)，這兩類成分在模型組大鼠體內(nèi)都出現(xiàn)明顯下降，提示其能量代謝出現(xiàn)變化。造模過程中，腎上腺素會加強(qiáng)能量的利用和產(chǎn)熱作用，冰水刺激也會使產(chǎn)能增加，造成脂肪酸等代謝加強(qiáng)及大量消耗。最終導(dǎo)致大鼠能量物質(zhì)減少，出現(xiàn)代謝障礙，能量代謝的異常也能導(dǎo)致該模型氣血運(yùn)行不暢，出現(xiàn)精神不振、活動減少等血瘀癥狀。脂質(zhì)代謝的紊亂可能是導(dǎo)致血瘀證侯的重要因素[2]。

本實驗結(jié)果顯示，在模型組中3-Dehydrosphinganine和 Dihydrosphingosine 2個神經(jīng)鞘磷脂類成分出現(xiàn)上調(diào)。神經(jīng)鞘磷脂是形成生物膜的重要脂類成分，也是細(xì)胞增殖、分化和凋亡的重要調(diào)節(jié)因子。最近研究表明，神經(jīng)鞘脂類成分可以調(diào)節(jié)脂質(zhì)的合成，脂蛋白的代謝與心血管疾病密切相關(guān)[10]。神經(jīng)鞘磷脂參與動脈粥樣硬化的病理發(fā)展，在人類和動物模型中鞘磷脂積聚并形成斑塊。神經(jīng)鞘磷脂的代謝產(chǎn)物促進(jìn)血管內(nèi)皮損傷，在維持動脈粥樣硬化斑塊中炎癥細(xì)胞的浸潤等促進(jìn)粥樣硬化斑塊進(jìn)展方面起作用[11-12]。鞘磷脂成分可以影響血小板的功能，可能改變血小板的能量代謝和信號傳導(dǎo)，激活血小板，這也可能是導(dǎo)致大鼠血瘀證的一個重要原因?？傊窠?jīng)鞘磷脂含量的增高可能導(dǎo)致罹患動脈粥樣硬化的風(fēng)險增大，這類成分可能是急性血瘀動物模型的重要生物標(biāo)志物。

本文采用代謝組學(xué)技術(shù)對急性血瘀證大鼠模型的血清樣本進(jìn)行分析，結(jié)果顯示該模型中磷脂酰膽堿、脂肪酸、神經(jīng)鞘磷脂等成分的代謝都受到干擾，這些代謝途徑的變化可能導(dǎo)致能量代謝的異常，影響血小板功能進(jìn)而導(dǎo)致血瘀證發(fā)生。

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Study on Metabolism of Acute Blood Stasis Rat Model Based on the Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

HUANG Shuo, SUN Ming-qian, SUN Lei, LIU Jian-xun△

(InstituteofBasicMedicalSciencesofXiyuanHospital,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,BeijingKeyLaboratoryofPharmacologyofChineseMateriaMedica,Beijing100091，China) Abstract: Objective:A metabonomics approach based on liquid chromatography coupled time-of-flight mass spectrometry (LC-TOF-MS) was utilized to obtain potential biomarkers of acute blood stasis rat and investigate metabolic mechanism of this TCM syndrome animal model.Method: SD rats were divided into normal group, blood stasis model group.Reversed-phase chromatography was used to separate the endogenous metabolites in serum. Partial least-squares to latent structure-discriminat analysis (PLS-DA) were used for data analysis.Result: Good separations were observed between the normal and model group. The major disturbed metabolic pathways were fatty acids, phosphatidylcholines and sphingolipids metabolism. Conclusion:The study provided further understanding of pathologic mechanism of the TCM syndrome animal model.

Blood stasis; Metabonomics; Biomarkers; LC-MS

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)(2015CB554405)-基于病證結(jié)合的氣血理論研究；國家自然科學(xué)基金資助項目(81202950)-基于代謝組學(xué)技術(shù)研究中藥復(fù)方雙參通冠方的配伍與作用機(jī)制

黃 爍，醫(yī)學(xué)碩士，從事心血管藥理學(xué)的研究。

△通訊作者：劉建勛，研究員，醫(yī)學(xué)博士，從事心腦血管藥理學(xué)與新藥發(fā)現(xiàn)研究，Tel:010-62835601,E-mail:liujx0324@sina.com。

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1006-3250(2017)03-0332-03

2016-08-13