單味及多味中藥灌洗對豚鼠鼻咽癌放療后鼻腔黏膜的影響*

鄧 鵬

廣西壯族自治區(qū)南溪山醫(yī)院耳鼻咽喉科(桂林 541000)

單味及多味中藥灌洗對豚鼠鼻咽癌放療后鼻腔黏膜的影響*

鄧 鵬

廣西壯族自治區(qū)南溪山醫(yī)院耳鼻咽喉科(桂林 541000)

目的: 探究單味及多味中藥灌洗對鼻咽癌放療后鼻腔、鼻咽組織的修復(fù)作用。方法：將80只豚鼠分為單純照射組、對照組、鼻腔單味中藥(鐵皮石斛)灌洗組、多味中藥中藥灌洗組，每組20只。每組豚鼠用Co-60治療機產(chǎn)生的射線作鼻部照射，照射開始當天即開始給藥，對照組用生理鹽水鼻腔；鼻腔單味中藥灌洗組用新鮮鐵皮石斛提取后的灌洗液灌洗；多味中藥灌洗組用中藥復(fù)方制劑吸入液對豚鼠鼻腔灌洗；對照組及單純照射組不用藥。采集總動脈處血液行肝腎功能檢測，取鼻咽部黏膜HE染色后行光學(xué)顯微鏡觀察細胞形態(tài)，原位免疫組織化學(xué)法(TUNEL法)檢測藥物對黏膜組織內(nèi)細胞凋亡的影響，透射電鏡及掃描電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果：肝腎功能檢測發(fā)現(xiàn)各組及多味中藥灌洗組ALT、AST、AST/ALT、BUN、Cr水平有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；HE染色發(fā)現(xiàn)除對照組外，其余三組均呈不同程度的炎癥狀態(tài)；各TUNEL法發(fā)現(xiàn)各組均出現(xiàn)TUNEL陽性細胞，其中多味中藥灌洗組TUNEL陽性細胞數(shù)最少，其次為單味中藥灌洗組，對照組最多。電鏡檢查發(fā)現(xiàn)單味及多味中藥灌洗組的纖毛倒伏、線粒體破壞等較對照組明顯減少。 結(jié)論：單味及多味中藥灌洗法對于鼻咽癌放療后損傷的鼻黏膜修復(fù)作用更加明顯，能夠促進炎癥的消退，抑制細菌的生長。

鼻咽癌放療常伴鼻咽部、鼻腔及鼻竇等正常組織的不同程度的損傷，導(dǎo)致放療后鼻竇炎、放射性咽炎的發(fā)生，常伴有鼻咽頂部黏膜缺損、痂皮堆積[1-2]。單純用生理鹽水沖洗沖洗不能達到很好的效果，用抗生素長期沖洗常導(dǎo)致耐藥而失效。用多味中藥灌洗治療放射性咽炎、用中藥行鼻腔灌洗等能有效促進正常組織的修復(fù)，促進炎癥的消退，抑制細菌的生長等[3]。因此本研究探究多味中藥灌洗及單味中藥灌洗法給藥對鼻咽癌放療后鼻腔、鼻咽組織的修復(fù)作用，為臨床醫(yī)生選擇給藥途徑提供理論依據(jù)。

材料與方法

1 實驗動物模型建立 選取80只豚鼠，使用二亞硝基哌嗪(DNP)皮下注射，誘導(dǎo)鼻咽部上皮癌變。劑量為40mg/kg，每周兩次皮下注射，共注射6周。

2 治療方法 將80只豚鼠分為對照組、單純照射組、單味中藥灌洗組、多味中藥灌洗組，每組20只。各組豚鼠無麻醉下固定器固定,用Co-60治療機產(chǎn)生的射線作鼻部照射，照射劑量30Gy，每次300cGy，每周5次，共照射10次(2周)。照射開始當天即開始給藥，單味中藥灌洗組用在桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院熬煎及分離提純的新鮮鐵皮石斛對豚鼠鼻腔每天灌洗1次，共灌洗4周；多味味中藥灌洗組用在桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院熬煎及分離提純的中藥灌洗液(蒼術(shù)、辛夷花、五味子、白芷、薄荷、黃岑、金銀花、連翹)對豚鼠鼻腔每天灌洗1次，共灌洗4周；多味中藥灌洗組用瑞康醫(yī)院藥廠配制的多味中藥灌洗液(生理鹽水、魚腥草注射液、地塞米松)對豚鼠霧化吸入，每天1次，共霧化吸入4周；對照組用生理鹽水灌洗。

3 標本采集及處理

3.1 標本采集：按照射后第1天、2周、4周、8周、12周的時間順序每次每組隨機選擇4只豚鼠用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后采集頸總動脈處血液行肝腎功能檢測，隨即斷頭，分別取中鼻甲黏膜、下鼻甲黏膜、鼻咽部黏膜、口咽部黏膜HE染色后行光學(xué)顯微鏡觀察細胞形態(tài)，原位免疫組織化學(xué)法(TUNEL法)檢測藥物對黏膜組織內(nèi)細胞凋亡的影響。掃描機透射電鏡檢查超微結(jié)構(gòu)。

3.2 肝腎功能檢測：采集頸總動脈處血液行肝腎功能檢測，檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、血清肌酐(Cr)水平。

3.3 HE染色：取豚鼠鼻咽部黏膜用10%福爾馬林固定后，常規(guī)包埋、切片。①HE染色前將標本脫蠟入水，先浸入二甲苯20 min，然后浸入酒精從100%到70%梯度入水，每個梯度浸泡3 min。②蘇木素浸染5 min，沖水。③浸入分化液(1%鹽酸酒精)中，分化30s，使切片褪色至淡紅色，沖水5 min使之呈藍色。④伊紅浸染3 min，沖水。⑤酒精梯度脫水后，二甲苯透明，樹膠封片。

3.4 TUNEL染色：①TUNEL染色前將標本脫蠟入水，先浸入二甲苯20 min，然后浸入酒精從100%到70%梯度入水，每個梯度浸泡3 min。②使用20μg/ml蛋白酶K進行抗原修復(fù)，室溫15 min，PBS洗三次，每次5min。③使用3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶，37℃室溫10 min。④使用ApoTag試劑盒進行TUNEL染色：滴加30U/ml TdT進行DNA片段標記，37℃孵育60 min；滴加HRP連結(jié)的抗熒光素抗體，室溫孵育30min；DAB顯色，在細胞核呈現(xiàn)棕黃色時立即使用自來水終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染。⑤酒精梯度脫水后，二甲苯透明，樹膠封片。統(tǒng)計顯微鏡下每個視野中TUNEL陽性細胞數(shù)百分比。

3.5 電鏡檢查：掃描電鏡及透射電鏡標本制作及觀察：標本依次經(jīng)過2.5%戊二醛固定12 h以上，逐級漂洗、脫水、固定，掃描電鏡及透射電鏡觀察。

4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件，肝腎功能指標數(shù)值、TUNEL陽性細胞數(shù)百分比采用均數(shù)±標準差表示，使用t檢驗，以P<0.05為具有統(tǒng)計學(xué)差異。

結(jié) 果

1 各組肝腎功能指標比較 采集頸動脈血液進行肝腎功能檢測分析發(fā)現(xiàn)，對照組、單純照射組、單味中藥灌洗組及多味中藥灌洗組ALT、AST、AST/ALT、BUN、Cr水平無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，見表1。

表1 各組肝腎功能指標比較

2 HE染色 對照組、單純照射組、單味中藥灌洗組及多味中藥灌洗組進行HE染色后光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，單純照射組、單味中藥灌洗組及多味中藥灌洗組均呈不同程度的炎癥狀態(tài)，以單純照射組炎癥最為顯著，HE染色顯示炎癥細胞數(shù)目最多，而單味中藥灌洗組及多味中藥灌洗組炎癥狀態(tài)較單純照射組明顯減輕，多味中藥灌洗組減輕更為明顯。組織形態(tài)學(xué)染色說明中藥霧化治療能夠明顯減輕鼻黏膜炎癥狀態(tài)，見圖1。

3 TUNEL染色 通過收集第1天、2周、4周、8周、12周鼻咽部黏膜組織，采用TUNEL法檢測藥物對黏膜組織內(nèi)細胞凋亡的影響，除對照組不接受放療外，發(fā)現(xiàn)單純照射組、單味中藥灌洗組及多味中藥灌洗組均出現(xiàn)TUNEL陽性細胞，其中對照組TUNEL陽性細胞數(shù)最多，其次為單味中藥灌洗組，說明多味中藥灌洗或單味中藥灌洗對鼻咽癌放療后鼻黏膜損傷有修復(fù)作用，而多味中藥灌洗組修復(fù)療效最為顯著，見圖2。

通過分析第1天、2周、4周、8周、12周TUNEL陽性細胞數(shù)百分比發(fā)現(xiàn)，第一天時，因未接受長時間放射治療，對照組、單純照射組、單味中藥灌洗組、多味中藥灌洗組TUNEL陽性細胞百分比無明顯差異(P>0.05)，而2周、4周、8周、12周單味中藥灌洗組及多味中藥灌洗組均較單純對照組TUNEL陽性細胞數(shù)百分比低，且多味中藥灌洗組更為顯著(P<0.05)，在第2周時，各組TUNEL陽性細胞數(shù)百分比較高，說明放射治療結(jié)束后，由于鼻黏膜損傷，TUNEL陽性細胞數(shù)百分比增加，但隨著中藥灌洗及多味中藥灌洗治療，TUNEL陽性細胞數(shù)百分比有所降低，見表2。通過TUNEL細胞凋亡檢測發(fā)現(xiàn)多味中藥灌洗法給藥途徑較鼻腔灌洗法對鼻咽癌后鼻黏膜損傷修復(fù)作用更好[3]。

圖1 HE染色顯示鼻黏膜炎癥狀態(tài)(2周) 圖2 TUNEL染色顯示鼻咽部凋亡細胞數(shù)目(2周)

組 別1d2周4周8周12周對照組4.21±0.334.43±0.833.77±0.644.18±0.734.01±0.38單純照射組4.57±0.6683.88±5.6188.22±3.9382.24±6.7783.37±8.43單味中藥灌洗組4.77±0.6577.24±3.66*△48.33±5.61*△40.69±7.33*△33.83±2.55*△多味中藥灌洗組4.50±0.5769.27±4.86*△▲45.55±4.31*△▲39.43±3.76*△▲29.56±4.38*△▲

注：與對照組比較，*P<0.05；與單純照射組比較，△P<0.05；與單味中藥灌洗組比較，▲P<0.05

討 論

鼻咽癌是廣西高發(fā)的惡性腫瘤，放療是治療鼻咽癌的有效方法之一，但是鼻咽癌放療后放射線對口、咽黏膜唾液腺損傷，使唾液分泌受阻，黏膜自潔能力下降，常易發(fā)生感染，同時放射線還能夠損傷黏膜組織，損傷血管內(nèi)皮細胞，造成血管痙攣、堵塞等，最終黏膜因血液供應(yīng)不足出現(xiàn)黏膜潰瘍、糜爛等。單純用生理鹽水沖洗沖洗不能達到很好的效果，用抗生素長期沖洗常導(dǎo)致耐藥而失效[4]。而研究發(fā)現(xiàn)，利用中藥抗菌消炎、消腫止痛、活血生肌等功效，能夠促進鼻咽癌放療后黏膜損傷的修復(fù)，恢復(fù)鼻腔生理功能[4]。同時隨著中醫(yī)中藥的發(fā)展，中藥劑型的種類也越來越多。

本研究通過用多味中藥灌洗及單味中藥灌洗法給藥對鼻咽癌放療后鼻腔、鼻咽組織的修復(fù)作用。采集頸動脈血液進行肝腎功能檢測分析發(fā)現(xiàn)，對照組、單純照射組、單味中藥灌洗組及多味中藥灌洗組ALT、AST、AST/ALT、BUN、Cr水平無統(tǒng)計學(xué)差異，說明無論何種治療方式對于豚鼠肝腎功能無影響。

鼻咽癌放療后鼻黏膜出現(xiàn)炎癥細胞浸潤，HE染色發(fā)現(xiàn)，除對照組外，其余三組均呈不同程度的炎癥狀態(tài)，以單純照射組炎癥最為顯著，HE染色顯示炎癥細胞數(shù)目最多，而單味中藥灌洗組及多味中藥灌洗組炎癥狀態(tài)較單純照射組明顯減輕，多味中藥灌洗組減輕更為明顯，說明中藥給藥能夠有效抑制鼻黏膜炎癥狀態(tài)[5]。

由于放療后鼻黏膜出現(xiàn)潰瘍、糜爛等，通過TUNEL細胞凋亡染色對受損鼻黏膜分析發(fā)現(xiàn)，除對照組不接受放療外，單純照射組、單味中藥灌洗組及多味中藥灌洗組均出現(xiàn)TUNEL陽性細胞，說明放療能夠造成鼻黏膜損傷等并發(fā)癥，其中對照組TUNEL陽性細胞數(shù)最多，而多味中藥灌洗組最少，說明多味中藥灌洗或單味中藥灌洗對鼻咽癌放療后鼻黏膜損傷有修復(fù)作用，而多味中藥灌洗組修復(fù)療效最為顯著[6]。通過定量分析發(fā)現(xiàn)，在第2周時，由于2周的放射治療結(jié)束，鼻黏膜呈不同程度損傷，各組TUNEL陽性細胞數(shù)百分比較高，但隨著中藥灌洗及多味中藥灌洗治療，TUNEL陽性細胞數(shù)百分比有所降低。通過TUNEL染色對鼻黏膜組織觀察發(fā)現(xiàn)，多味中藥灌洗法給藥途徑較鼻腔灌洗法對鼻咽癌后鼻黏膜損傷修復(fù)作用更好[7]。

綜上所述，多味中藥灌洗法給藥途徑較鼻明顯腔灌洗法治療對于鼻咽癌放療后損傷的鼻黏膜修復(fù)作用更加明顯，能夠促進炎癥的消退，抑制細菌的生長。

[1] 景 艷,康 敏,劉 津,等. 白花蛇舌草多糖誘導(dǎo)鼻咽癌細胞凋亡及其機制研究[J]. 臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2015,29(7):641-643.

[2] 李 藝，張 勉，葉輝信. 鼻竇炎合劑行鼻腔沖洗治療鼻咽癌放療后鼻竇炎的臨床療效[J]. 臨床合理用藥，2016，9(6)：109-110.

[3] 王鋒鋼,王永昶. 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移對鼻咽癌預(yù)后的研究[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志，2016,45(4)：474-477.

[4] 王鵬飛，趙文飛，張春玲. 復(fù)方苦參注射液聯(lián)合放化療治療局部晚期鼻咽癌療效[J]. 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2015，36 (9)：1277-1279.

[5] 林 毅，姚 俊. 黃酮類化合物抗鼻咽癌作用的研究進展[J]. 海南醫(yī)學(xué)，2016，27(13)：2176-2178.

[6] 魏少賢. 中藥復(fù)方苦參注射液聯(lián)合放化療治療局部晚期鼻咽癌 的療效觀察[J]. 中西醫(yī)結(jié)合心血管病雜志，2016，3(18)：87-88.

[7] 黃金圣,黃學(xué)武. 養(yǎng)陰清熱法對鼻咽癌放療后患者敏感性的影響[J].陜西中醫(yī)，2015,36(9)：1195-1197.

(收稿：2016-10-23)

The effect of single or complex Chinese medical herbs’ lavage to nasal cavity and nasopharyngeal tissues after radio therapy to nasopharynx cancers

Deng Peng.

Department of Otolaryngology,Nanxishan Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region(Guilin 541002)

Objective: To explore the refin-effect of single or complex Chinese medical herbs’ lavage to nasal cavity and nasopharyngeal tissues after radio therapy to nasopharynx cancers.Methods: Eighty guinea pigs were divided into 4 groups including irradiated group, control group, treatment group with single Chinese medical herb and treatment group with complex Chinese medical herbs. The guinea pigs in each group irradiated with radiation therapy machine. Drugs were given the day when the irradiation was started. For the control group, irrigated the nasal cavity of guinea pigs with. For the treatment group with single Chinese medical herb, irrigate the nasal cavity of guinea pigs with extracting solution of dendrobium candidum. For the treatment group with complex Chinese medical herbs, irrigate the nasal cavity of guinea pigs with inhalation solution of complex Chinese patent medicine once a day for 4weeks.Collect the blood in common carotid artery irradiation, and tested the liver and kidney function. The nasopharyngeal mucosa was taken at the same time and was observed with HE staining and electron microscope, and detect the influence of drugs on cell apoptosis of mucosa tissue with TUNEL, and observed the change of ultrastructure by transmission electron microscopy or scanning electron microscope.Results: ALT、AST、AST/ALT、BUN and Cr were significantly different (P<0.05) in this four groups through the test of liver. Through the test of TUNEL, we found that all the groups had TUNEL-positive cells, and the treatment group with complex Chinese medical herbs got the least number of it, then the treatment group with single Chinese medical herb, and the control group got the largest number of it. The phenomena of cilia lodging and mitochondrial damage were significantly reduce compared with the control group by electron microscopy.Conclusion: The lavage method of single or complex Chinese medical herbs to nasal cavity and nasopharyngeal tissues after radio therapy to nasopharynx cancers was significantly effective. And it can promote the resolution of inflammation, and inhibit the growth of bacteria.

Nasopharyngeal neoplasms Animal experimentation Guinea pigs

*廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃項目(桂林攻13349008)

鼻咽腫瘤 動物實驗 豚鼠

R739.6

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2017.04.060