梔子苷與薯蕷皂苷對(duì)腦缺血再灌注大鼠急性期和恢復(fù)早期炎性損傷機(jī)制研究*

沈 甜,王 斌,李 敏,衛(wèi) 昊,嚴(yán)亞峰,呂 騰,侯建平

陜西中醫(yī)藥大學(xué)(咸陽(yáng)712046)

梔子苷與薯蕷皂苷對(duì)腦缺血再灌注大鼠急性期和恢復(fù)早期炎性損傷機(jī)制研究*

沈 甜,王 斌△,李 敏,衛(wèi) 昊,嚴(yán)亞峰,呂 騰,侯建平

陜西中醫(yī)藥大學(xué)(咸陽(yáng)712046)

目的：探索梔子苷與薯蕷皂苷對(duì)腦缺血大鼠再灌注損傷后的急性期和恢復(fù)早期炎性損傷的影響。方法：將大鼠分為假手術(shù)組、模型組(再灌注24 h和72 h)、給藥組(梔子苷和薯蕷皂苷分別設(shè)置30 mg/kg、60 mg/kg組)和陽(yáng)性藥組(醒腦靜10 ml/kg組 )并采用線栓法灌胃給藥后造模，對(duì)腦缺血再灌注后的急性期(24 h)和恢復(fù)早期(72 h)大鼠整體行為學(xué)評(píng)估、腦組織海馬區(qū)的形態(tài)學(xué)觀察以及腦組織勻漿中炎癥介質(zhì)COX-2和5-LOX蛋白活力檢測(cè)等指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)觀察。結(jié)果：梔子苷與薯蕷皂苷能顯著提高神經(jīng)損傷評(píng)分，降低腦內(nèi)COX-2和5-LOX的活力。結(jié)論：梔子苷與薯蕷皂苷通過對(duì)花生四烯酸通路中COX-2和5-LOX蛋白活力的調(diào)節(jié)對(duì)大鼠腦缺血再灌注后急性期(24 h)和恢復(fù)早期(72h)的炎性損傷具有一定的治療作用。

缺血性腦卒中已成為人類健康的頭號(hào)殺手, 探索早期疾病發(fā)生發(fā)展的過程是疾病治療和預(yù)后的關(guān)鍵。梔子苷是中藥梔子的主要有效成分，對(duì)腦缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，與黃芩苷配伍可減少炎性因子釋放，抑制半胱氨酸白三烯受體表達(dá)，從而抗腦缺血炎性損傷[1]。薯蕷皂苷在穿龍薯蕷、黃山藥薯蕷、盾葉薯蕷中含量豐富，具有抗血小板聚集和血栓形成作用，提示其具有腦保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)研究表明，梔子素和薯蕷皂苷配伍對(duì)腦缺血有保護(hù)作用[2]。本試驗(yàn)擬研究梔子苷與薯蕷皂苷對(duì)腦缺血再灌注大鼠急性期和恢復(fù)早期炎性損傷抑制機(jī)制，以期為腦缺血疾病的治療提供參考價(jià)值。

材料與方法

1 試驗(yàn)藥物 薯蕷皂苷批號(hào)110212(HPLC檢測(cè)含量98%)；梔子苷，批號(hào)110831(HPLC 檢測(cè)含量80%)，購(gòu)于陜西中鑫生物技術(shù)有限公司。

2 試驗(yàn)動(dòng)物 SD雄性大鼠 180 只，體質(zhì)量 250～280 g，購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)SCXK(陜)2012-001。

3 試劑 COX-2試劑盒，批號(hào)：20130101A，5-LOX試劑盒，批號(hào)：20130101A，購(gòu)自美國(guó)R&D公司；醒腦靜注射液購(gòu)自濟(jì)民可信山禾有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：Z32020863。

4 儀器 美國(guó)賽默飛Multiskan FC全自動(dòng)酶標(biāo)儀；北京科偉電熱恒溫水箱，HH.W21.420；直徑為0.25 mm優(yōu)質(zhì)尼龍魚線，產(chǎn)地為日本。

5 分組給藥及造模 將雄性SD大鼠180只隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組(腦缺血24 h再灌注24 h和72 h)，梔子苷60 mg/kg、30 mg/kg組，薯蕷皂苷60 mg/kg、30 mg/kg組，醒腦靜10 ml/kg 組(24 h和72 h)，將藥物用1%吐溫溶液溶解，各組均按照0.50 ml/100g，1 次/d 的劑量連續(xù)灌胃給藥4 d，假手術(shù)組和模型組給予等體積的1%吐溫溶液作為陰性對(duì)照，末次給藥30 min后，采用線栓法制備大腦中動(dòng)脈局灶性腦缺血模型[4]。

6 指標(biāo)檢測(cè)及方法

6.1 行為學(xué)評(píng)分:該實(shí)驗(yàn)參照 Zea-Longa 五級(jí)評(píng)分法分別對(duì)大鼠腦缺血損傷后行為障礙程度進(jìn)行評(píng)估建立MCAO腦缺血模型。

6.2 腦組織海馬部位病理形態(tài)觀察: 術(shù)后24 h，每組隨機(jī)取3只大鼠，多聚甲醛灌注固定、取材、組織處理，進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色，在光鏡下觀察，拍照并進(jìn)行評(píng)價(jià)。

6.3 腦組織 COX-2 和 5-LOX 酶活性檢測(cè): 造模后24h和72h，斷頭取手術(shù)側(cè)大腦，用生理鹽水制備10% 腦勻漿，置于-20℃ 冰箱凍存?zhèn)溆?，Elisa試劑盒檢測(cè)COX-2和5-LOX蛋白活力并進(jìn)行BCA蛋白定量。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有結(jié)果以均值 標(biāo)準(zhǔn)差表示，SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05 表示具有顯著性差異。

結(jié) 果

1 對(duì)神經(jīng)功能缺損評(píng)分的影響 結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較模型組(24 h和72 h)神經(jīng)功能評(píng)分明顯偏低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)。與模型組相比腦缺血再灌24 h，梔子苷60 mg/kg組、薯蕷皂苷60 mg/kg組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)。與模型組相比腦缺血再灌72 h，薯蕷皂苷及梔子苷30 mg/kg組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，結(jié)果見表1。

2 腦組織海馬部位病理形態(tài)觀察 假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)腦組織結(jié)構(gòu)完整排列有序，胞漿豐富染色清晰。與假手術(shù)組相比模型組大鼠腦部海馬區(qū)呈現(xiàn)明顯的水腫情況，組織出現(xiàn)空洞神經(jīng)元稀疏排列散亂，進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)模型組海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞大量壞死、變性，胞核固縮深染、胞體皺縮，細(xì)胞間質(zhì)疏松呈現(xiàn)篩狀，神經(jīng)元脫失、膠質(zhì)細(xì)胞增生明顯。給藥組與模型組相比，正常神經(jīng)元數(shù)量增多且排列規(guī)則，腦組織變性、壞死的范圍也顯著下降，結(jié)果見圖1。

表1 治療后大鼠急性期和恢復(fù)早期神經(jīng)功能缺損評(píng)分的影響±s)

注：與模型組比*P<0.05，△P<0.01,▲P<0.001

假手術(shù)組 模型組 梔子苷60mg/kg組 薯蕷皂苷60mg/kg組 醒腦靜10 ml/kg組

圖1 MCAO大鼠腦組織海馬區(qū)神經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察(HE，400×)

3 腦組織COX-2活性 結(jié)果顯示，模型組大鼠腦缺血再灌注24 h和72 h與假手術(shù)組比較，腦組織COX-2活性明顯增強(qiáng)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比，缺血再灌注24 h薯蕷皂苷60 mg/kg組和梔子苷60 mg/kg組腦組織中COX-2蛋白活性明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。腦缺血再灌72 h與模型組相比，梔子苷30 mg/kg組COX-2活性降低并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果見表2。

4 腦組織5-LOX活性 結(jié)果顯示，與假手術(shù)組，大鼠腦缺血再灌注24 h和72 h模型組腦組織5-LOX活性明顯增強(qiáng)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。再灌注24 h時(shí)與模型組相比，薯蕷皂苷和梔子苷60mg/kg組5-LOX活性明顯降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。腦缺血再灌注72h與模型組比較，梔子苷30mg/kg組5-LOX活性降低并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),結(jié)果見表 3。

表 2 治療后腦缺血大鼠急性期和恢復(fù)早期腦組織COX-2活性的影響±s)

注：與模型組比*P<0.05，?P<0.01

表3 治療后腦缺血大鼠急性期和恢復(fù)早期腦組織5-LOX活性的影響±s)

注：與模型組比*P<0.05,?P<0.01

討 論

缺血性腦卒中病機(jī)十分復(fù)雜，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)缺血性腦損傷與能量代謝衰竭、炎癥損傷及鈣超載等因素相關(guān)，而缺血/再灌注后誘發(fā)的炎癥瀑布式級(jí)聯(lián)反應(yīng)對(duì)腦組織造成嚴(yán)重的二次損傷[3]。多種促炎因子、炎癥介質(zhì)共同參與調(diào)控體內(nèi)復(fù)雜炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)，花生四烯酸代謝中COX-2和5-LOX兩條通路參與該網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控[4]，生成的前列腺素類和白三烯類炎癥介質(zhì)可造成神經(jīng)元損傷、凋亡，促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞(microglia)遷移和活化，隨著5-LOX通路的激活其下游蛋白LTB4、CysLTs表達(dá)增加并與腦內(nèi)半胱氨酰白三烯受體(CysLTR)結(jié)合誘導(dǎo)多種炎癥病理過程的發(fā)生與發(fā)展從而加重腦部損傷[5]。

梔子苷是從茜草科植物梔子的主要活性成分，為環(huán)烯醚萜苷類化合物，異名京尼平苷，具有保護(hù)腦缺血損傷的作用。我們前期基于清熱解毒治則，采用基線等比設(shè)計(jì)梔子黃芩不同配比，篩選出梔子黃芩配伍抗腦缺血炎性損傷的最佳配比(7∶3)，并且明顯減少腦梗死面積和體積，改善腦缺血損傷。李等通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，梔子苷和黃芩苷按照一定比例組分配伍能夠降低腦組織5-Lox的含量和表達(dá)，抑制5-Lox下游的半胱氨酸白三烯受體(CysLTR)和基因CysLTRmRNA在海馬部位的表達(dá)；另有研究表明，黃芩素和薯蕷皂苷(1∶1)可減輕腦缺血小鼠神經(jīng)損傷，減低腦梗死體積，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、信號(hào)傳導(dǎo)、神經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子和蛋白結(jié)合等，因此我們推測(cè)梔子苷與薯蕷皂苷對(duì)腦缺血再灌注大鼠急性期和恢復(fù)早期炎性損傷有保護(hù)作用[6]。

本試驗(yàn)通過線栓法復(fù)制大鼠腦缺血再灌注模型[7]，研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腦缺血再灌注24h和72h均發(fā)生明顯的神經(jīng)行為學(xué)損傷，同時(shí)腦組織炎癥介質(zhì)COX-2、5-LOX高表達(dá)[8]；而薯蕷皂苷及梔子苷通過下調(diào)患鼠腦中蛋白的表達(dá)有效的改善了腦缺血/再灌注大鼠神經(jīng)損傷和腦組織海馬區(qū)神經(jīng)病理形態(tài)學(xué)對(duì)腦缺血損傷具有一定的保護(hù)作用。

[1] 高龍?zhí)? 王智勇, 吳俊霞, 等. 梔子苷對(duì)慢性腦缺血大鼠神經(jīng)元凋亡及Bcl-2和Bax表達(dá)的影響[J].江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)2013,25(4):73-76.

[2] 王 斌,曹 慧,沈 甜,等.麝香、冰片對(duì)大鼠腦缺血-再灌注急性期和恢復(fù)早期炎性損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究[J].中藥材,2015,38(10):2139-2143.

[3] 王 寧,李曉歐,巴曉紅,等.遠(yuǎn)隔缺血后處理對(duì)腦缺血模型大鼠再灌注損傷炎性反應(yīng)相關(guān)信號(hào)的影響[J].中國(guó)組織工程研究,2015,49(19):7902-7907.

[4] 陳義明, 余澤珍, 周 強(qiáng), 等. 花生四烯酸細(xì)胞色素 P450 酶代謝通路基因多態(tài)性與腦梗死發(fā)病的相關(guān)性研究[J].浙江醫(yī)學(xué),2016,38(19):1553-1574.

[5] 李 敏,武 璞,呂 騰,等.醒腦靜提取物對(duì)腦缺血再灌注炎性損傷5-LOX-CysLTs-CysLT 通路的影響[J].中藥藥理與臨床,2015,31(6):131-134.

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[7] 劉 波,李 菲,王 麗,等.改良線栓法制備SD大鼠局灶性腦缺血再灌注模型研究[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生,2016,32(2):161-166.

[8] 甄毅嵐,王亞男,李晟,等.線栓法制備不同體重 KM 小鼠局灶性腦缺血/再灌注模型的建立及評(píng)價(jià)[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào),2013,21(2):39-44.

(收稿：2016-10-15)

Investigate mechanism of Dioscin and Geniposide on inflammatory of cerebral ischemia and reperfusion injury at different time points of acute phase in rats

Shen Tian，Wang Bin，Li min，et al.

Shaanxi University of Traditional Chinese Medicine(Xi’an 712046)

Objective：Exploration of Geniposide and Dioscin on cerebral ischemia reperfusion injury in rats after acute stage and recovery effect of early inflammatory injury. Methods：The rats were divided into 4 groups such as: sham group, model group , drug group and Xingnaojing 10ml/kg group. Copy ischemia-reperfusion model after administration of each drug, evaluate the score of nerve injury, determine COX-2 and 5-LOX activity in brain tissue. Results：Dioscin and Geniposide can improve the scores of nerve damage, reduce activity of COX-2 and 5-LOX in brain homogenates. Conclusion：Dioscin and Geniposide have protective effect on cerebral ischemia-reperfusion injury in the acute phase through regulating the activity of COX-2 and 5-LOX protein in the four arachidonic acid pathway.

Dioscin Geniposide Inflammatory injury Animal，experiment Rats

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81473385)

陜西省科技廳資助項(xiàng)目(2010K01-150)

陜西省教育廳資助項(xiàng)目(13JS029)

梔子苷 薯蕷皂苷 炎性損傷 動(dòng)物，實(shí)驗(yàn) 大鼠

R743

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2017.04.059

△通訊作者