BMP-14誘導骨髓間充質干細胞向肌腱細胞分化的實驗研究

黃曉楠

BMP-14誘導骨髓間充質干細胞向肌腱細胞分化的實驗研究

黃曉楠

目的探討應用骨形態(tài)發(fā)生蛋白14（BMP-14）誘導骨髓間充質干細胞（BMSCs）向肌腱細胞分化條件，為獲取肌腱組織工程種子細胞提供方法。方法 以新西蘭大白兔為實驗對象，取BMSCs分離培養(yǎng)。建立2個培養(yǎng)組，分別為實驗組（BMP-14誘導培養(yǎng)組）和對照組（自然分化組）。I型膠原免疫組化、甲苯胺藍染色，分別使用RT-PCR法檢測在不同時間點培養(yǎng)BMSCs的I型膠原蛋白和蛋白聚糖mRNA的表達。結果實驗組BMSCs爬片免疫組化染色中可見蛋白聚糖及I型膠原蛋白染色陽性，對照組呈陰性。RT-PCR結果顯示經BMP-14誘導后BMSCs中蛋白聚糖I型膠原蛋白的表達明顯高于對照組。結論 BMP-14可誘導BMSCs向肌腱細胞分化。

骨髓間充質干細胞；肌腱細胞；BMP-14

骨髓間充質干細胞（BMSCs）是組織工程理想的種子細胞，具有自我更新能力和多向分化潛能，BMSCs用于成骨、成軟骨、成脂及成肌等研究較為成熟，但其向肌腱細胞分化方面的研究較少，有研究顯示，肌腱修復早期在肌腱局部注射BMSCs，可在組織學及生物力學方面促進肌腱的修復過程[1,2]。然而，也有學者研究認為BMSCs治療肌腱損傷中，部分患者出現移位鈣化，且與細胞濃度及治療時間不相關[3,4]，還有學者研究認為，未分化的BMSCs在特定的環(huán)境下有形成腫瘤的風險[5]。因此本實驗提出采用體外分離培養(yǎng)BMSCs，并在特定的轉化因子、轉化培養(yǎng)條件下使其向肌腱細胞分化[6]。由于肌腱細胞主要表達蛋白聚糖I型膠原蛋白，因此應用轉化類肌腱細胞及組織工程學原理方法可將再生肌腱細胞與生物支架結合來再生工程化類肌腱組織，從而為肌腱損傷的治療提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

2月齡新西蘭大白兔，雌雄不限，體重2.5～3.0kg，由山東省菏澤醫(yī)學高等?？茖W校動物實驗中心提供（合格證號:魯動字第P00102015）。

1.2 主要試劑

質粒pcDNA3.1-BMP-14（Invitrogen）、I型膠原酶、Hoechst33258及Calf Thymus DN（Gibco公司）、DMEM培養(yǎng)基、TrizolReagent（Invitrogen公司）、胎牛血清（Sigma公司）、Percoll分離液（Pharmacia公司）、Calf Thymus DNA （Gibco公司）和Hoechst33258等試劑、I型膠原酶、聚集蛋白聚糖多克隆抗體（Sigma公司）、兔抗兔隆抗體（Neomaker公司）、胰蛋白酶（Sigma公司）、LipofectamineTM2000（Invitrogen公司）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白14（BMP-14）、ELISA試劑盒（Sigma公司）、兔抗兔隆抗體（Neomaker公司）、胰蛋白酶（Sigma公司）、木瓜蛋白酶（E.Merck公司）、RF-5000熒光分光光度計（島津公司）及D-Hanks液（Gibco公司）。

1.3 儀器和設備

潔凈工作臺、低速離心機、DL-5、CO2培養(yǎng)箱、USA旋轉式細胞培養(yǎng)系統(tǒng)（RCCS,SyntheconInc，美國）、PTC-200 型PCR儀（MJ公司）、倒置熒光相差顯微鏡（德國Zeiss公司）。

1.4 BMSCs的分離和培養(yǎng)

取新西蘭大白兔，以濃度2%戊巴比妥鈉耳緣靜脈全身麻醉，剃毛、消毒鋪巾，骨穿針于兔髂前上棘抽取髂骨骨髓，將骨髓與Hanks液以1：1混合均勻，以1000r/min的速度離心7分鐘后去脂。采用LG2DMEM進行反復沖洗所得到的沖洗液，加入含有percoll（密度1.073）的10mL離心管中，使用3500r/min速度離心7分鐘，見離心管中細胞分層明顯，取中間棉絮樣分層細胞并以DMEM反復洗滌細胞，再以1500r/min離心20分鐘，以DMEM液反復洗滌細胞2次經離心后的收集細胞緩慢加入20%胎牛血清細胞培養(yǎng)液中，并吹打細胞至單個細胞形成后接種在50mL培養(yǎng)瓶里，并將培養(yǎng)瓶放置在5%CO2、37℃及飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱里進行細胞培養(yǎng)。每72小時更換培養(yǎng)液1次，未貼壁細胞即可經過這種反復換液、沖洗而去除，等細胞集落形成，并生長至85%融合后傳代。細胞傳代培養(yǎng)時加0.25%胰酶，并采用相差顯微鏡觀察，此時可見梭形BMSCs變成圓形，再吸棄胰酶消化液，將BMSCs加入培養(yǎng)基中，并吹打細胞使之分散。采用血細胞計數板計數細胞，并以5×107P/ mL的密度接種在50mL的培養(yǎng)瓶里。此時細胞記作P1，重復以上操作步驟獲得P1～P3，并將P3細胞作為肌腱組織種子細胞。建立2個培養(yǎng)組，分別為實驗組（BMP-14誘導培養(yǎng)組）和對照組（自然分化組）。

1.5 BMSCs轉染

取1 g質粒轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，經挑單克隆后再小提質粒行酶切鑒定測序。質粒DNA中量抽提試劑盒，提取質粒在-20℃中保存?zhèn)溆?。BMSCs傳代于37℃、5%CO2、飽和濕度（95%）的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合度到90%～95%時進行BMSCs轉染，按照LipofectamineTM2000轉染說明書進行操作，待24小時后，將轉染細胞置于倒置顯熒光微鏡下觀察細胞情況。

1.6 檢測指標

1.6.1 組織學檢測

甲苯胺藍染色：取各組3、7、14、21天培養(yǎng)細胞制作細胞爬片，玻片細胞按染色步驟依次采用10%中性甲醛固定、水洗、甲苯胺藍染色，染色35分鐘后以95%酒精清洗玻片中剩余的甲苯胺藍染液，染色后給與封片處理。按I型膠原免疫組化染色試劑盒操作說明進行組織學檢測。

1.6.2 Ⅰ型膠原蛋白及聚集蛋白聚糖mRNA檢測

兩組細胞均采用RT-PCR檢測法檢測I型膠原蛋白及聚集蛋白聚糖mRNA表達。分別采集兩組不同時間點的細胞，并采用TrizolTM試劑行細胞裂解。提取細胞總RNA，并測定RNA濃度，將RNA逆轉錄為cDNA，進行PCR擴增。由上海英駿生物技術有限公司合成所有引物，引物和擴增序列示于表1。

表1 引物序列與擴增長度

I型膠原RT-PCR反應條件：先在94℃預變性5min，然后在94℃變性30秒，再在60℃退火30秒，72℃延伸45秒，共32個循環(huán)，最后一個循環(huán)后再在72℃延伸10分鐘。

聚集蛋白聚糖AggrecanRT-PCR的反應條件：先在94℃預變性5分鐘，然后在94℃變性30秒，再在60℃退火45秒，72℃延伸40秒，共32個循環(huán)，最后一個循環(huán)后再在72℃延伸10分鐘。

-actin RT-PCR的反應條件：先在94℃預變性5分鐘，然后在94℃變性30秒，再在55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共28個循環(huán)，最后一個循環(huán)后再在72℃延伸10分鐘。

PCR產物經電泳、DNA吸光度掃描檢測，以及顯色條帶圖像分析系統(tǒng)（Launch sensiansys凝膠成像系統(tǒng)）檢測其積分吸光度值，與 -Actin(內參基因)條帶的光密度參數之比值作為mRNA表達水平的參數。

1.7 統(tǒng)計學分析

所有數據使用SPSS11.5（SPSSInc.,Chicago,IL,USA）醫(yī)學統(tǒng)計學軟件進行數據分析，計量資料采用（2±s）表示。采用兩獨立樣本t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 細胞形態(tài)觀察

BMSCs離心提取培養(yǎng)1天后，大部分BMSCs貼附于培養(yǎng)瓶表面，少數為長梭形，隨著時間的推移，培養(yǎng)瓶表面上的細胞數量逐漸增加，形態(tài)也變得更加趨向于長梭形，離心培養(yǎng)液中可見少量分散分布的類球形、折光性弱的細胞；實驗組細胞離心培養(yǎng)第21天收獲的細胞，在倒置相差顯微鏡下觀察到BMSCs增殖活躍，細胞數量較多，呈梭形、多邊形及不規(guī)則形（圖1A），對照組第21天數量較少，呈不規(guī)則形貼滿瓶壁（圖1B）。

2.2 免疫組化檢測

甲苯胺藍染色：實驗組BMSCs在誘導21天后呈多邊形或圓形，并且BMSCs的細胞漿呈異染性及紫藍色，可見清晰胞核及核仁（圖1C）。對照組BMSCs為長梭形，BMSCs的細胞漿沒有觀察到明顯的異染性。。

I型膠原免疫組化染色：實驗組BMSCs在誘導21天，后呈多邊形，并且BMSCs的細胞漿呈棕褐色顆粒，胞核清晰（圖1D）。對照組BMSCs絕大多數呈長梭形，胞核清晰藍染，胞漿未見棕褐色顆粒。

圖1 A實驗組細胞離心培養(yǎng)第21天收獲細胞，BMSCs增殖活躍，細胞數量較多，呈梭形、多邊形及不規(guī)則形（×400）；B對照組第21天呈不規(guī)則形，數量較少（×400）；C實驗組BMSCs誘導21天BMSCs呈多邊形或圓形，胞漿呈明顯的紫藍色及異染性，胞核清晰，可見核仁（×1600）；D實驗組BMSCs誘導21天，BMSCs為多邊形，胞漿見呈棕褐色顆粒，胞核清晰（×1600）

2.3 RT-PCR檢測

兩組細胞I型膠原蛋白及聚集蛋白聚糖mRNA的表達、RT-PCR檢測結果見表2。從第14天開始，實驗組BMSCsI型膠原蛋白及聚集蛋白聚糖條帶與對照組比較有明顯差別，且隨培養(yǎng)時間延長而逐漸增加；兩組在吸光度值上也存在顯著性差異（P＜0.05）。而對照組沒有顯著變化，各時間點I型膠原蛋白及聚集蛋白聚糖mRNA幾乎無表達。

表2 不同時間點兩組組細胞聚集蛋白聚糖及I型膠原蛋白mRNA的表達量（±s）

表2 不同時間點兩組組細胞聚集蛋白聚糖及I型膠原蛋白mRNA的表達量（±s）

注：①聚集蛋白聚糖與I型膠原蛋白含量同對照組比較，P＜0.05。

對照組 實驗組聚集蛋白聚糖 I型膠原蛋白 聚集蛋白聚糖 I型膠原蛋白3天0 0 0 0 7天 0 0 0.907±0.013①0.706±0.026①14天 0.016±0.011 0 0.990±0.011①0.800±0.039①21天 0.134±0.017 1.113±0.024①0.883±0.037①0

3 討論

肌腱損傷在臨床上很常見，目前常見的治療方法是自體肌腱的移植，但是這種方法取材有限，并且極有可能會對供區(qū)產生不良的影響[7]。盡管現在有同種異體肌腱及人工肌腱等替代材料可選擇，但前者材料的排斥不可避免，后者也無法提供充足的力學穩(wěn)定[8]。近年隨著組織工程學的興起，為肌腱損傷的治療提供了一個新途徑。種子細胞的來源是肌腱組織工程研究的重點之一，在目前階段，可以作為種子細胞的有成纖維細胞、肌腱細胞及間充質干細胞[9-11]。過去研究中多應用肌腱細胞作為種子細胞，但若從自身取材創(chuàng)傷不可避免，從其他異體取材又極可能會引起排斥反應。此外，腱細胞在體外培養(yǎng)時增殖速度慢，多次傳代耗時長，嚴重影響細胞分泌基質的能力。若以成纖維細胞作為種子細胞，其貼壁時間、排列方式及細胞生物學特性等方面，均與肌腱細胞存在著差異，這種差異是否會導致失敗還有待研究。

間充質干細胞存在于成熟的骨髓基質中，它在一定條件下可向諸如脂肪、骨、軟骨、肌腱、肌肉及骨髓基質等特定細胞分化的潛能[12]，在組織工程中具有取材方便、體外培養(yǎng)時具有高效率增殖特點、可避免排斥反應等問題，以及間充質干細胞作為種子細胞，它的來源不受供體年齡限制[13,14]。

在肌腱的再生修復中，多種因子如類胰島素生長因子（IGFs）、轉化生長因子（TGF-）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPs）等均在肌腱愈合中發(fā)揮作用。近年來，骨形態(tài)發(fā)生蛋白在肌腱發(fā)生和肌腱損傷修復中的作用逐漸被認識。骨形態(tài)發(fā)生蛋白[15]在體內能夠誘導骨和腱樣組織形成。動物實驗證實BMP-14有誘導間充質干細胞成腱作用，并且能大大提高肌腱強度。很多體外研究已顯示出BMP-12、13、14在肌腱修復中的潛在作用[16-18]。

本實驗在體外環(huán)境下，利用BMP-14誘導BMSCs向肌腱細胞轉化。實驗組在BMSCs的細胞爬片免疫組化染色中I型膠原染色陽性，甲苯胺藍染色陽性，而對照組呈陰性。第7～21天，實驗組可檢測到BMSCs的蛋白聚糖I型膠原mRNA的表達，對照組無明顯表達（P＜0.05）。實驗組培養(yǎng)21天后，BMSCs的形態(tài)發(fā)從培養(yǎng)初期的長梭形變?yōu)樨S富的多邊形，且BMSC形狀已與腱細胞的形狀相似。蛋白聚糖I型膠原蛋白的免疫染色中，實驗組BMSCs胞體著色明顯，著色顯示證明BMSCs胞體中已有蛋白聚糖I型膠原蛋白的表達合成，隨后的RT-PCR檢測進一步證實了來自基因水平的聚集蛋白聚糖及I型膠原蛋白存在于BMSCs胞體中。蛋白聚糖和I型膠原蛋白主要存在肌腱細胞中，且在BMSCs中表達明顯，本組實驗結果也證實通過 BMP-14轉染的BMSCs已具有向肌腱細胞轉化的能力，并且隨著轉染時間的延長這種轉化趨勢越明顯。

組織工程肌腱與傳統(tǒng)肌腱修復法比較，其優(yōu)勢明顯。本實驗以BMP-14作為誘導因子，成功誘導BMSCs向肌腱細胞轉化，可解決肌腱組織工程的種子細胞來源不足的困境。然而這一技術要真正應用于臨床治療中，還有很長的路要走。未來的研究方向可著眼于如何在體外模擬機體內環(huán)境而進行組織工程的構建。

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Experimental study on bone marrow mesenchymal stem cells induced to tendon cells by BMP-14

Huang Xiaonan.Orthopedics Surgery,Heze Municiple Hospital of Shandong,Heze Shandong,274031,China

Objective To explore bone marrow mesenchymal stem cells（BMSCs）induced to tendon cells by BMP-14, provided methods of obtaining tendon tissue engineering seed cells.Methods The BMSCs obtained from adult rabbit was culturedintheestablishment of twogroup-experimentalgroup（using BMP-14inducedculture）andcontrolgroup（using natural differentiation）.Use collagen type I immunohistochemical and toluidine blue staining.Detect the expression of mRNA of proteoglycan and collagen type I protein by RT-PCR at different time during culture.Results Immunohistochemistry stainingofproteoglycanandcollagen typeI protein in BMSCs climbingfilmshowed positive,while the control groupshowednegative.RT-PCR results suggest that the inducedBMSCsexpressproteoglycanand collagen typeI protein higher than the control group.Conclusion BMP-14 can induce the BMSCs differentiating into the tendon cells in vitro.

BMSCs;Tendon cells;BMP-14

R318

A

10.3969/j.issn.1672-5972.2017.02.001

swgk2016-07-00170

黃曉楠（1976-）男，碩士，主治醫(yī)師。研究方向：骨外科。

2016-07-22）

山東菏澤市立醫(yī)院手足顯微外科，山東菏澤274031