HPLC 測定溫陽振衰顆粒中人參皂苷Rg₁、人參皂苷Re、人參皂苷Rb₁ 含量

楊磊，張曼華，蔡虎志，石繼連

1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學國家中醫(yī)藥管理局中藥炮制學重點學科，湖南 長沙 410208

HPLC 測定溫陽振衰顆粒中人參皂苷Rg、人參皂苷Re、人參皂苷Rb 含量

楊磊1，張曼華2，蔡虎志1，石繼連2

1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學國家中醫(yī)藥管理局中藥炮制學重點學科，湖南 長沙 410208

目的 采用反相高效液相色譜法同時測定溫陽振衰顆粒中人參皂Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的含量。方法采用Agilent TC-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈-0.05%磷酸水，梯度洗脫（0～35 min，19%乙腈；35～58 min，19%～29%乙腈；58～70 min，28%乙腈；70～100 min，29%～40%乙腈），流速1.0 mL/min，檢測波長203 nm，柱溫35 ℃。結果人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的進樣量分別在0.22～2.2 μg、0.22～2.2 μg、0.26～2.6 μg范圍內與峰面積呈良好的線性關系，相關系數(shù)分別為0.999 8、0.999 8、0.999 1；人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的平均回收率分別為98.04%、96.58%、96.75%。結論本方法準確、靈敏度高、重復性好，可作為溫陽振衰顆粒的質量控制方法。

溫陽振衰顆粒；人參皂苷Rg1；人參皂苷Re；人參皂苷Rb1；高效液相色譜法

溫陽振衰顆粒為湖南省名老中醫(yī)陳新宇教授臨床治療慢性心力衰竭的經驗方，基于現(xiàn)代中醫(yī)對慢性心力衰竭病機的認識，針對心陽虛衰、瘀血停滯、水飲內停及痰濁不化，組方由人參、茯苓、甘草等7味藥組成，具有溫陽益氣、育陰利尿功效，用于陽虛、水泛型慢性心力衰竭，臨床療效確切[1]。前期藥效學研究表明，該方降低基質金屬蛋白酶2和9及改善心功能的作用稍優(yōu)于卡托普利[2]；能上調信號調節(jié)激酶5（ERK5）蛋白磷酸化的水平，從而激活ERK5信號轉導通路[3]；可通過調節(jié)心力衰竭模型兔心臟功能及降低血漿中內皮素-1的含量，以防止和延緩心力衰竭的進一步惡化[4]。筆者采用HPLC對溫陽振衰顆粒中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1進行含量測定，為控制藥品質量和制定質量標準提供參考。

1 儀器與試藥

島津LC-20AT高效液相色譜儀，SPD-20A紫外可見檢測器，LabSolutions數(shù)據(jù)工作站，JH3120型超聲波清洗器（荊州市津?；た萍加邢薰荆?，HH恒溫水浴鍋（江蘇金達中大儀器廠），AE240電子分析天平（METTLER），TD2102型電子天平（余姚市金諾天平儀器有限公司）。

溫陽振衰顆粒樣品（8 g/袋，批號 20141215、20150109、20150122），湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院自制；人參皂苷Rg1對照品（供含量測定用，批號110703-200726）、人參皂苷 Re對照品（供含量測定用，批號754-9406）、人參皂苷Rb1對照品（供含量測定用，批號110704-200921），中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純；水為雙重蒸餾水；其他試劑均為分析純。

2 方法和結果

2.1 色譜條件

采用Agilent TC-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動相A為0.05%磷酸、B為乙腈，梯度洗脫程序見表1，檢測波長203 nm，柱溫35 ℃，流速1.0 mL/min。

表1 流動相梯度洗脫程序（%）

2.2 混合對照品溶液的制備

分別取對照品人參皂苷Rg113.75 mg、人參皂苷Re 13.75 mg、人參皂苷Rb116.25 mg置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解，定容，即得人參皂苷Rg11.375 mg/mL、人參皂苷Re 1.375 mg/mL、人參皂苷Rb11.625 mg/mL的混合對照品貯備液。再精密吸取混合對照品貯備液2 mL，置于25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得每1 mL含人參皂苷Rg10.11 mg、人參皂苷Re 0.11 mg、人參皂苷Rb10.13 mg的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取本品，研細，取約2 g，精密稱定，置索氏提取器中，加三氯甲烷適量，加熱回流3 h，棄去三氯甲烷液，藥渣揮干溶劑，連同濾紙筒移入具塞錐形瓶中，精密加入水飽和正丁醇50 mL，密塞，放置過夜，超聲處理（功率250 W，頻率50 kHz）30 min，過濾，精密量取續(xù)濾液25 mL，置蒸發(fā)皿中蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.4 陰性對照溶液的制備

取缺人參的陰性樣品適量，研細，取約2 g，精密稱定，按“2.3”項下供試品溶液的制備方法制備，即得。

2.5 專屬性試驗

精密吸取對照品溶液、陰性對照溶液及供試品溶液各10 μL，分別注入高效液相色譜儀中，測定。結果表明，陰性對照溶液在與對照品溶液色譜峰相應位置無相應的色譜峰，說明陰性無干擾。色譜圖見圖1。

圖1 溫陽振衰顆粒中3種人參皂苷HPLC圖

2.6 線性關系考察

取“2.2”項下混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別進樣2、5、10、15、20 μL，測定峰面積，以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程。人參皂苷Rg1Y＝7.7×105X－19 957，r2＝0.999 8；人參皂苷Re Y＝7.7×105X－17 605，r2＝0.999 8；人參皂苷Rb1Y＝4.6×105X＋24 235，r2＝0.999 1。結果表明，人參皂苷Rg1在0.22～2.2 μg、人參皂苷Re在0.22～2.2 μg、人參皂苷Rb1在0.26～2.6 μg范圍內具有良好的線性關系。

2.7 精密度試驗

取“2.2”項下混合對照品溶液，精密吸取10 μL，按“2.1”項下色譜條件重復進樣6次，測定峰面積，結果人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的峰面積RSD分別為0.61%、1.00%、1.12%，表明該方法精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取本品內容物，研細，取約2 g，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別于0、3、6、9、12、24 h按“2.1”項下色譜條件進樣10 μL，測定峰面積，結果人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的峰面積RSD分別為0.69%、0.58%、1.34%，表明供試品溶液在24 h內基本穩(wěn)定。

2.9 重復性試驗

取同一批號樣品（批號20141215）的內容物，研細，取6份，每份約2 g，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定樣品含量，結果人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的含量分別為0.723、0.801、0.570 mg/g，RSD分別為1.02%、1.33%、1.09%，表明本方法重復性好。

2.10 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的溫陽振衰顆粒（人參皂苷Rg10.703 mg/g、人參皂苷Re 0.818 mg/g、人參皂苷Rb10.576 mg/g）共6份，每份2 g，分別準確加入1.375 mg/mL人參皂苷Rg1對照品溶液1 mL、1.375 mg/mL人參皂苷Re對照品溶液1.2 mL、1.625 mg/mL人參皂苷Rb1對照品溶液0.7 mL，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，精密吸取各供試品溶液10 μL注入高效液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件測定，計算回收率，結果見表2～表4。

2.11 樣品測定

取3批溫陽振衰顆粒，每批平行做2份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算溫陽振衰顆粒樣品中3種人參皂苷的含量，結果見表5。

表2 人參皂苷Rg1加樣回收率試驗

表3 人參皂苷Re加樣回收率試驗

表4 人參皂苷Rb1加樣回收率試驗

表5 樣品中人參皂苷Rg1＋Re、人參皂苷Rb1含量測定結果（n＝3）

3 討論

人參為溫陽振衰顆粒中的君藥，有大補元氣、復脈固脫、補脾益肺、安神益智的功效，用于體虛欲脫、肢冷脈微、脾虛食少、肺虛咳喘等。現(xiàn)代研究表明，人參有較強的抗心律失常[5]、抗休克[6]和心肌細胞保護作用[7-8]。因此，本研究采用 HPLC對溫陽振衰顆粒中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1進行測定，以3種皂苷含量為指標，建立簡便、準確、專屬性強的質量控制方法。

本試驗考察了Agilent TC-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）和YWG-C18（250 mm×4.6 mm，10 μm）2個品牌 2種長度色譜柱的分離效果，結果表明Agilent TC-C18色譜柱在分離效果和柱壓方面都優(yōu)于YWG-C18柱，故選用Agilent TC-C18色譜柱進行分析。在樣品處理方面，分別考察了萃取法、中性氧化鋁柱層析法及D101大孔吸附樹脂法，結果表明，萃取法對人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的選擇性高、專屬性好，注入高效液相色譜儀后分離效果好，適合用于含量測定，故選用萃取法進行供試品溶液的制備。在色譜條件方面，分別考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.05%磷酸、甲醇-水等不同的梯度洗脫流動相，最終選用乙腈-0.05%磷酸進行分離，各被測成分分離良好且峰形較佳。流動相為28%乙腈（35～58 min）時，人參皂苷Rg1、人參皂苷Re分離度不好，經過對大量條件進行摸索，發(fā)現(xiàn)將乙腈19%～28%（35～58 min）梯度調整為乙腈19%～29%（35～58 min），可使部分干擾峰提前出峰，達到含量測定要求。柱溫 35 ℃時色譜峰的分離度優(yōu)于 30 ℃和25 ℃。

本研究建立的HPLC方法能簡便高效地同時對溫陽振衰顆粒中人參皂苷 Rg1、人參皂苷 Re和人參皂苷Rb1進行檢測，經多批供試品驗證，重復性好，結果表明該方法可用于溫陽振衰顆粒的質量控制。

[1] 尹玲瓏,陳新宇,蔡虎志,等.溫陽振衰顆粒對慢性心力衰竭陽虛水泛證患者臨床療效及血管內皮功能的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學學報,2014, 34(4)：20-23.

[2] 閆紅,陳新宇,盧青,等.溫陽振衰方對慢性心衰模型大鼠心肌基質金屬蛋白酶2,9的影響[J].光明中醫(yī),2013,28(7)：1336-1339.

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[7] 吳紅金,劉宇娜.人參皂甙Rg1抑制60Co照射誘導心肌細胞凋亡[J]．醫(yī)學綜述,2008,14(21)：3332-3334．

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Content Determination of Ginsenoside Rg1, Ginsenoside Re and Ginsenoside Rb1 in Wenyang Zhenshuai Granules by HPLC

YANG Lei1, ZHANG Man-hua2, CAI Hu-zhi1, SHI Ji-lian2(1. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410007, China; 2. Key Discipline of Processing Chinese Materia Medica of SATCM, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China)

s: ObjectiveTo establish an HPLC method to determine the contents of ginsenoside Rg1, ginsenoside Re and ginsenoside Rb1in Wenyang Zhenshuai Granules.MethodsThe separation was preformed on Agilent TC-C18 column (4.6 mm×250 mm, 5 μm). The mobile phase consisted of acetonitril-0.05% aqueous solution of phosphoric acid with gradient elution (0–35 min, 19% acetonitrile; 35–58 min, 19%–29% acetonitrile; 58–70 min, 28% acetonitrile; 70–100 min, 29%–40% acetonitrile). The flow rate was 1.0 mL/min; the wavelength of detector was 203 nm; the temperature of column was 35 ℃.ResultsThe calibration curves showed good linearity in the range of 0.22–2.2 μg (ginsenoside Rg1, r=0.999 8), 0.22–2.2 μg (ginsenoside Re, r=0.999 8) and 0.26–2.6 μg (ginsenoside Rb1, r=0.999 1), respectively. The average recoveries of ginsenoside Rg1, ginsenoside Re and ginsenoside Rb1were 98.04%, 96.58% and 96.75%, respectively.ConclutionThe method is accurate, hypersensitized and reproducible, which can be applied to the quality control of Wenyang Zhenshuai Granules.

Wenyang Zhenshuai Granules; ginsenoside Rg1; ginsenoside Re; ginsenoside Rb1; HPLC

R284.1

A

1005-5304(2017)04-0075-04

2016-06-02）

（

2016-06-30；編輯：陳靜）

國家自然科學基金（81173213/H2708）；湖南省科技計劃項目（2010TT2018）；湖南省中醫(yī)藥管理局資助項目（201106）

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.04.019