豨薟草醇提物對多柔比星致小鼠慢性心肌損傷的保護作用Δ

于 靜，蘇素文，楊繼章，何林峰，王可欣，張曉飛（1.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院臨床藥學(xué)部，石家莊050031；.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理教研室，石家莊 050017）

豨薟草醇提物對多柔比星致小鼠慢性心肌損傷的保護作用Δ

于 靜1＊，蘇素文2，楊繼章1#，何林峰2，王可欣2，張曉飛2（1.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院臨床藥學(xué)部，石家莊050031；2.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理教研室，石家莊 050017）

目的：探討豨薟草（HS）醇提物對多柔比星（DOX）致小鼠慢性心肌損傷的影響。方法：將48只小鼠隨機分為3組，即空白對照（Con）組小鼠每天ig 1次蒸餾水（2 mL/100 g），并每周ip 1次生理鹽水，持續(xù)8周；DOX組小鼠每天ig 1次蒸餾水（2 mL/100 g），并每周ip 1次DOX（3 mg/kg），持續(xù)8周；DOX+HS醇提物組小鼠每天ig 1次HS（340 mg/kg），并每周ip 1次DOX（3 mg/kg），持續(xù)8周。給藥結(jié)束后，測定小鼠體質(zhì)量、心臟系數(shù)、心功能變化以及血清生化指標[丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、肌酸磷酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脫氫酶（LDH）及總膽固醇（TC）]水平。結(jié)果：與Con組比較，DOX組小鼠體質(zhì)量減輕（P＜0.01）；心臟系數(shù)升高（P＜0.05）；心率減慢、R波增高（P＜0.05或P＜0.01）；血清中生化指標均有所升高，其中AST差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與DOX組比較，DOX+HS醇提物組小鼠心臟系數(shù)降低（P＜0.01）；心率增加（P＜0.01）；血清中生化指標均有所降低，其中CK、LDH、TC差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論：HS醇提物對DOX致小鼠慢性心肌損傷有一定的保護作用。

豨薟草醇提物；多柔比星；慢性心肌損傷；小鼠

多柔比星（DOX）是一種高效、廣譜的抗腫瘤藥，臨床上用于急性白血病、淋巴瘤、骨肉瘤、乳腺癌、肺癌等的治療。與大多數(shù)抗腫瘤藥一樣，DOX的不良反應(yīng)較多，最嚴重的不良反應(yīng)是劑量依賴性心臟毒性，根據(jù)發(fā)生時間長短分為急性和慢性心臟毒性。慢性心臟毒性反應(yīng)的發(fā)生與DOX的累積劑量密切相關(guān)。當DOX的總量超過400 mg/m2時，約有1%患者出現(xiàn)心肌病變，引起急性心力衰竭；當DOX的累積總量大于550 mg/m2時，心力衰竭的發(fā)生率超過4%，病死率可達20%，此為給藥上限劑量；當DOX的累積總量大于600 mg/m2時，心力衰竭的發(fā)生率達36%[1]。豨薟草（HS）醇提物對DOX所致急性心肌損傷和肝、腎損傷均有保護作用已得到證實[2-3]，但HS醇提物對DOX所致慢性心肌損傷的作用尚未見報道。故本研究擬以多次注射DOX致小鼠慢性心肌損傷來探討HS醇提物對DOX慢性心肌損傷小鼠的影響。

1 材料

1.1 儀器

CHEMIX-180全自動生化分析儀（日本Sysmes公司）；PICO 17小型臺式離心機（德國Thermo公司）；AL104電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；Allegra 64R高速離心機（美國Beckman Coulter公司）；RM-6240BD多通道信號采集處理系統(tǒng)（成都儀器廠）。

1.2 藥品、試劑與試劑盒

注射用鹽酸DOX（浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號：110703，規(guī)格：5 mL∶10 mg）；肌酸磷酸激酶（CK，批號：ZG3002）、肌酸激酶同工酶（CK-MB，批號：ZG1001）、乳酸脫氫酶（LDH，批號：120815）、總膽固醇（TC，批號：ZG3003）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST，批號：ZG3001、ZG3002）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT，批號：ZG3011、ZG3012）測定試劑盒均購自日本Sysmex公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 藥材

HS由河北祁新中藥顆粒飲片有限公司提供（產(chǎn)地：湖北，批號：20120701-1），由河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院臨床藥學(xué)部楊繼章主任藥師鑒定其符合2010年版《中國藥典》（一部）標準。

1.4 動物

清潔級C57小鼠48只，♀♂各半，由河北省實驗動物中心提供，動物合格證號：1510484。

2 方法

2.1 HS醇提物的制備

將2 kg HS水煎2次后濃縮至4 L，加入95%乙醇，邊加邊劇烈攪拌至乙醇體積分數(shù)為70%。過濾后回收乙醇，烘干，收集粉碎并稱質(zhì)量，共得HS醇提物70 g，每1 g HS醇提物相當于28.57 g生藥。實驗前用蒸餾水溶解制備成所需質(zhì)量濃度樣品溶液。

2.2 分組、給藥與造模

實驗動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機分為3組，即空白對照（Con）組、DOX組和DOX+HS醇提物組，每組16只（♀♂各半）。ig給藥，給藥體積均為2 mL/100 g，Con組和DOX組小鼠ig等體積蒸餾水，DOX+HS醇提物組小鼠ig HS醇提物340 mg/kg[2-3]，每天1次，連續(xù)8周。在給藥同時，DOX組與DOX+HS醇提物組小鼠均ip DOX（3 mg/kg），每周1次，連續(xù)8周，以誘導(dǎo)慢性心肌損傷模型[4]；Con組小鼠則ip等體積生理鹽水。

2.3 癥狀和體征的觀察

觀察小鼠一般精神狀況、飲食、皮毛等情況，并于末次給予DOX 48 h后稱定小鼠體質(zhì)量。

2.4 心電圖的測定

各小鼠均ip 1%戊巴比妥鈉（5 mg/kg）麻醉，仰位固定，將刺激電極插入小鼠的肢體皮下，采用肢體Ⅱ?qū)?lián)，用RM6240 BD多道生理信號采集處理系統(tǒng)進行心電圖圖像采集，分析小鼠心率、R波、PR間期和QT間期的變化。

2.5 血清生化指標及心臟系數(shù)的測定

小鼠經(jīng)眼眶取血約5 mL，靜置約30 min后，以離心半徑為8 cm、3 000 r/min離心10 min，取上層血清。分別測定血清中ALT、AST、TC、CK、CK-MB和LDH水平，所有操作步驟均按測試盒的說明書進行。小鼠經(jīng)眼眶取血后剖開胸腔，取出心臟，稱定各組小鼠心臟質(zhì)量，計算心臟系數(shù)[心臟質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）]。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 HS醇提物對DOX致慢性心肌損傷小鼠一般狀況、體質(zhì)量的影響

Con組小鼠攝食及一般活動在給藥期間未見異常；DOX組給藥后小鼠攝食量減少，出現(xiàn)豎毛、肢冷、活動時平衡度差的癥狀，體質(zhì)量明顯減輕（P＜0.01）；而DOX+ HS醇提物組小鼠的一般狀況優(yōu)于DOX組，但體質(zhì)量變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。Con組、DOX組、DOX+HS醇提物組小鼠的體質(zhì)量變化分別為（2.90± 2.10）、（－2.59±1.99）、（－2.39±1.37）g。

3.2 HS醇提物對DOX致慢性心肌損傷小鼠心功能的影響

與Con組比較，DOX組小鼠ECG表現(xiàn)為心率減慢、R波增加、PR間期和QT間期延長，其中心率和R波變化差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；與DOX組比較，DOX+HS醇提物組小鼠心率增加、R波減少、PR間期和QT間期縮短，其中心率變化差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠心電圖的檢測結(jié)果（s，n＝16）Tab 1 Detection results of electrocardiogram of micein each group（s，n＝16）

表1 各組小鼠心電圖的檢測結(jié)果（s，n＝16）Tab 1 Detection results of electrocardiogram of micein each group（s，n＝16）

注：與Con組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與DOX組比較，##P＜0.01Note：vs.Con group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.DOX group，##P＜0.01

QT間期，ms 67.81±22.95 106.13±49.99 80.68±48.48組別Con組DOX組DOX+HS醇提物組心率，次/min 409.28±23.60 377.45±36.45＊464.89±66.52##R波，mV 0.34±0.07 0.47±0.08＊＊0.43±0.11 PR間期，ms 17.93±4.77 23.48±5.68 20.92±5.43

3.3 HS醇提物對DOX致慢性心肌損傷小鼠血清生化指標的影響

與Con組比較，DOX組小鼠血清中ALT、AST、CK、CK-MB、LDH、TC水平均升高，其中AST差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與DOX組比較，DOX+HS醇提物組小鼠血清中上述指標水平均降低，其中CK、LDH、TC差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），結(jié)果見表2。

表2 各組小鼠血清生化指標的測定結(jié)果（s，n＝16）Tab 2 Determination results of serum biochemical indexes of mice in each group（s，n＝16）

表2 各組小鼠血清生化指標的測定結(jié)果（s，n＝16）Tab 2 Determination results of serum biochemical indexes of mice in each group（s，n＝16）

注：與Con組比較，＊＊P＜0.01；與DOX組比較，##P＜0.01Note：vs.Con group，＊＊P＜0.01；vs.DOX group，##P＜0.01

組別Con組DOX組DOX+HS醇提物組ALT，U/L 52.74±11.07 59.74±14.91 55.89±13.79 AST，U/L 158.00±27.51 201.14±21.85＊＊199.16±49.57 CK，U/L 843.33±92.39 976.11±178.02 765.33±129.80##CK-MB，U/L 316.67±92.39 340.44±63.03 328.60±48.36 LDH，U/L 846.00±112.61 941.56±147.31 801.40±95.74##TC，mmol/L 1.73±0.46 2.10±0.34 1.71±0.17##

3.4 HS醇提物對DOX致慢性心肌損傷小鼠心臟系數(shù)的影響

與Con組[（0.004 40±0.000 99）g/g]比較，DOX組小鼠的心臟系數(shù)[（0.005 60±0.000 66）g/g]明顯升高（P＜0.05）；與DOX組比較，DOX+HS醇提物組小鼠的心臟系數(shù)[（0.004 80±0.000 47）g/g]明顯降低（P＜0.05）。

4 討論

由于DOX可引起劑量依賴性的心臟毒性，而限制了其臨床應(yīng)用[5]，其毒性主要表現(xiàn)為器質(zhì)性的病變[6]。目前，主要是應(yīng)用DOX控釋劑和聯(lián)合使用心臟保護劑（如右丙亞胺）來降低DOX的心臟毒性[7-8]。但化學(xué)藥品往往通過一種機制來降低DOX的心臟毒性，而中藥則可能通過多靶點進行拮抗[9]。HS所含化學(xué)成分較多，主要有萜類、苷類、生物堿等。研究證明，HS提取物具有舒張血管、降壓、抗癌、鎮(zhèn)痛、抗菌消炎、抗氧化、抑制免疫功能等活性。日本科學(xué)家證實，HS的甲醇提取物有較強的抗氧化性，其活性高于2，3-丁基-4-羥基茴香醚[10]。

本研究采用連續(xù)8周重復(fù)對小鼠注射DOX致累積中毒劑量的方法，觀察HS醇提物是否可拮抗其產(chǎn)生的慢性心肌損傷。筆者前期研究已證明，HS醇提物對DOX所致的急性心肌損傷和肝、腎損傷均有保護作用，以高劑量組作用最為明顯[2-3]，故在本研究設(shè)計時沒有設(shè)定不同給藥劑量組，只選定高劑量為本次實驗劑量。

在本研究中，從小鼠的一般狀況來看，與Con組比較，DOX組小鼠均出現(xiàn)豎毛、肢冷、活動力差等現(xiàn)象；與DOX組比較，DOX+HS組上述癥狀均有所改善。因DOX的半衰期為48～96 h，故本研究的各項指標在DOX注射48 h后進行檢測。從小鼠體質(zhì)量變化來看，Con組小鼠體質(zhì)量在8周后明顯增加，而DOX組小鼠體質(zhì)量卻明顯減少，DOX+HS醇提物組小鼠體質(zhì)量稍增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。而DOX組小鼠的心臟系數(shù)卻明顯高于Con組，這說明DOX對心臟的損傷可引起實驗小鼠的體質(zhì)量下降，但心臟質(zhì)量卻增加，而心臟質(zhì)量增加可能是心肌細胞的腫脹和間質(zhì)水腫所致。與DOX組比較，DOX+HS醇提物組小鼠的心臟系數(shù)卻降低，這提示HS醇提物對DOX所造成的心臟損傷有一定的對抗作用。DOX組小鼠心電圖的心率減慢、R波增高、PR間期和QT間期延長，提示DOX長期累積注射可造成小鼠慢性心肌損傷，而HS醇提物可緩解DOX所致的心電圖異常。

CK廣泛存在于各種組織中，與三磷酸腺苷的再生有關(guān)，此酶的功能是在生理水平上維持細胞內(nèi)的三磷酸腺苷濃度。CK由M和B兩個亞單位組成，組合成CKBB、CK-MM、CK-MB 3種同工酶，其中CK-MB則主要存在于心肌，血清中CK和CK-MB是DOX誘發(fā)心肌損害致細胞完整性缺失的定量指示劑[11]。LDH是糖酵解過程中的重要酶，在心肌細胞中的含量遠高于其他組織，血清中LDH含量的高低與心肌損傷的程度呈正相關(guān)[12]。AST的分布以心肌最高，當心肌細胞受到損傷時，大量釋放入血，使其血清含量增加。本研究結(jié)果顯示，DOX組血清中CK、CK-MB、LDH、TC、ALT、AST水平均升高，而DOX+HS醇提物組小鼠血清中以上各種酶的水平均有所降低，這提示HS醇提物對DOX慢性中毒所致的心肌損傷有一定的保護作用。

綜上所述，HS醇提物可改善DOX致小鼠慢性心肌損傷，但究竟是何種成分在起作用還有待進一步研究。

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Protective Effects of Ethanol Extracts from Siegesbeckiae herba on Doxorubicin-induced Chronic Myocardial Injury in Mice

YU Jing1，SU Suwen2，YANG Jizhang1，HE Linfeng2，WANG Kexin2，ZHANG Xiaofei2（1.Dept.of Clinical Pharmacy，the First Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050031，China；2.Teaching and Research Section，Basic Medical College of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China）

OBJECTIVE：To explore the effects of extracts from Siegesbeckiae herba（HS）on doxorubicin（DOX）-induced chronic myocardial injury in mice.METHODS：48 mice were randomly divided into 3 groups.Mice in blank control（Con）group received distilled water once every day，ig，and normal saline（2 mL/100 g）once every day，ip，for 8 weeks；mice in DOX mice received distilled water（2 mL/100 g）once every day，ig，and DOX（3 mg/kg）once every week，ip，for 8 weeks；mice in DOX+ HS group received HS（340 mg/kg）once every day，ig，and DOX（3 mg/kg）once every week，ip，for 8 weeks.After administration，body mass，heart coefficient，cardiac function changes，serum biochemical index levels[alanine aminotransferase（ALT），aspartate aminotransferase（AST），creatine phosphokinase（CK），creatine kinase isoenzyme（CK-MB），lactate dehydrogenase（LDH）and total cholesterol（TC）]of mice were determined.RESULTS：Compared with Con group，body mass of mice in DOX group was decreased（P＜0.01）；heart coefficient was increased（P＜0.05）；heart rate slowed down，R-wave was increased（P＜0.05 or P＜0.01）；serum biochemical indexed were increased，there was significant difference in AST（P＜0.01）.Compared with DOX group，heart coefficient of mice in DOX+HS group was decreased（P＜0.01）；heart rate was increased（P＜0.01）；serum biochemical indexes were decreased，there was significant differences in CK，LDH，TC（P＜0.01）.CONCLUSIONS：HS has certain protective effects on DOX-induced chronic myocardial injury in mice.

Ethanol extracts from Siegesbeckiae herba；Doxorubicin；Chronic myocardial injury；Mice

R969.4

A

1001-0408（2017）10-1320-04

2016-09-21

2016-11-12）

（編輯：林 靜）

國家自然科學(xué)基金資助項目（No.81273600）；河北省自然科學(xué)基金資助項目（No.C2011206145）；河北省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥類科研計劃課題（No.2012008）

＊主管藥師，碩士。研究方向：臨床藥理學(xué)。電話：0311-85917354。E-mail：38565914@qq.com

#通信作者：主任藥師，碩士生導(dǎo)師，教授。研究方向：臨床藥學(xué)。電話：0311-85917352。E-mail：yjzh1957@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.10.06