組蛋白乙?；揎棇κ菟卣T導(dǎo)的乳腺癌MDA-MB-231細胞生長的影響

周偉強

（沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧省環(huán)境污染與微生態(tài)重點實驗室，遼寧 沈陽 110034）

組蛋白乙?；揎棇κ菟卣T導(dǎo)的乳腺癌MDA-MB-231細胞生長的影響

周偉強

（沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧省環(huán)境污染與微生態(tài)重點實驗室，遼寧 沈陽 110034）

目的：研究組蛋白乙?；揎棇κ菟卣T導(dǎo)的乳腺癌MDA-MB-231細胞生長的影響。方法：采用實時定量PCR、Western blot法測定瘦素和組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）抑制劑SAHA對乳腺癌MDA-MB-231細胞生長的影響。應(yīng)用染色質(zhì)免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP）技術(shù)了解瘦素和SAHA影響組蛋白乙?；降某潭?。結(jié)果：瘦素與乳腺癌MDA-MB-231細胞作用后HDAC1的mRNA和蛋白表達明顯增強，并伴有組蛋白H3、H4乙?；浇档停≒＜0.05）。ChIP結(jié)果顯示瘦素處理的乳腺癌細胞p21WAF/CIP1啟動子區(qū)域與乙?；M蛋白H3、H4結(jié)合的染色質(zhì)物質(zhì)明顯少于未處理細胞組的相同區(qū)域（P＜0.05）。結(jié)論：瘦素誘導(dǎo)乳腺癌細胞增殖過程中伴隨組蛋白乙?；降淖兓?，通過激活HDAC的活性使核心組蛋白去乙酰化，從而抑制p21WAF/CIP1的表達，最終促進細胞周期從G1→S期的進程。

乳腺癌；MDA-MB-231；SAHA；去乙酰化

在臨床上，雌激素受體（estrogen receptor，ER）作為用于評估激素依賴性、預(yù)測內(nèi)分泌治療效果的分子標志物，是乳腺癌一個重要的預(yù)前和預(yù)后因子［1］。然而大約10%～20%乳腺癌患者呈ER陰性，以惡性程度高、侵襲性強、化療敏感及預(yù)后差為主要特征，是目前乳腺癌治療的難點之一［2-3］。研究顯示，在乳腺細胞功能異常時，組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）的活性明顯增強，因此抑制HDAC活性可能逆轉(zhuǎn)乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展［4］。組蛋白去乙酰化酶抑制劑SAHA（suberoylanilide hydroxamic acid）屬于羥肟酸類廣譜的HDAC抑制劑，通過抑制HDAC活性，誘導(dǎo)靶細胞中組蛋白高度乙?；瑔幽承┨禺愋曰虻谋磉_而達到阻斷腫瘤生長的目的。研究表明，SAHA可誘導(dǎo)MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435、SKBr-3等乳腺癌細胞凋亡的產(chǎn)生［5-6］。同時前期研究采用細胞劃痕、Transwell細胞侵襲力測定等方法研究瘦素（Leptin）對乳腺癌MDA-MB-231細胞侵襲力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Leptin可顯著增強乳腺癌MDA-MB-231細胞的遷移力及侵襲力［7］。因此，本研究選取ER陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞，研究HDAC抑制劑SAHA和Leptin聯(lián)合使用后對MDA-MB-231細胞產(chǎn)生的影響，同時闡明Leptin誘導(dǎo)乳腺癌細胞生長與SAHA抗腫瘤效應(yīng)之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺癌細胞株MDA-MB-231由本實驗室凍存；Leibovitz's L-15培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素及鏈霉素購自美國Thermo公司；人重組Leptin蛋白購自美國Sigma-Aldrich公司；EZ染色質(zhì)免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP）試劑盒購自美國Millipore公司；HRP標記的兔抗羊多克隆抗體和羊抗β-actin抗體購自美國Abcam公司；羊抗HDAC1單克隆抗體、羊抗乙?；M蛋白H4多克隆抗體、羊抗組蛋白H4多克隆抗體、羊抗乙?；M蛋白H3多克隆抗體、羊抗組蛋白H3多克隆抗體、羊抗p21WAF1/CIP1多克隆抗體等購自美國Millipore公司；SAHA及其它化學(xué)試劑購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人乳腺癌MDA-MB-231細胞培養(yǎng)于含15%胎牛血清、100 U/ml的青霉素、100 μg/ml的鏈霉素的Leibovitz's L-15培養(yǎng)基中。

1.2.2 全細胞RNA提取和實時定量PCR 將5× 105/ml乳腺癌MDA-MB-231細胞接種于6板各孔中，細胞進行無血清同步化處理后加入0.625 nmol/L Leptin和5 μmol/L SAHA與MDA-MB-231細胞孵育32 h。將與Leptin、SAHA處理過的乳腺癌細胞洗脫、離心，使用Rneasy mini kit提取全細胞RNA，SuperScript?Ⅲ Reverse Transcriptase合成cDNA，Power SYBR?Green PCR Master Mix熒光實時定量PCR法測定細胞中HDAC1和p21WAF1/CIP1的mRNA表達水平。

1.2.3 Western blot將上述Leptin和SAHA處理后的MDA-MB-231細胞經(jīng)胰蛋白酶消化、離心后，取細胞團塊經(jīng)M-PER裂解液裂解，應(yīng)用BCA法檢測蛋白濃度。取20 μg蛋白上樣進行SDS-PAGE電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜、封閉。加入1︰1 000稀釋的羊抗HDAC1單克隆抗體，羊抗乙?；M蛋白H3多克隆抗體、羊抗組蛋白H3多克隆抗體、羊抗乙酰化組蛋白H4多克隆抗體、羊抗組蛋白H4多克隆抗體和羊抗p21WAF1/CIP1多克隆抗體4℃孵育過夜，以羊抗β-actin多克隆抗體作為對照。再加入1︰5 000 HRP標記的兔抗羊多克隆抗體室溫孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光法測定細胞裂解液中各因子表達變化情況。

1.2.4 ChIP 按EZ-ChIP試劑盒操作程序進行。將5×106/ml處于對數(shù)生長期的乳腺癌MDA-MB-231細胞接種于35 mm培養(yǎng)皿中，經(jīng)血清饑餓同步化處理后，加入0.625 nmol/L Leptin和5 μmol/L SAHA共同培養(yǎng)（培養(yǎng)方法與孵育時間同1.2.2）。經(jīng)預(yù)冷磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗2次后，37%戊二醛室溫孵育10 min使DNA和與之相互作用的蛋白交聯(lián)。PBS沖洗2次后用細胞鏟刮掉培養(yǎng)皿中細胞，700×g離心5 min后用SDS Lysis Buffer重新懸浮細胞團。超聲破碎細胞后離心取上清夜分別與羊抗乙?；M蛋白H3多克隆抗體和羊抗乙酰化組蛋白H4多克隆抗體4℃過夜孵育。加入Protein G Agarose和細胞IP孵育液4℃振蕩作用1 h，5 000×g離心1 min后取Protein G Agarose/細胞IP復(fù)合物依次經(jīng)低鹽、高鹽、LiCl、TE溶液沖洗后，經(jīng)Elution Buffer洗脫、5 mol/L NaCl 65℃去交聯(lián)、DNA柱純化后所得沉淀即為ChIP產(chǎn)物。應(yīng)用Power SYBR?Green PCR Master Mix熒光實時定量PCR法測定細胞與乙?；M蛋白抗體結(jié)合的GAPDH、p21WAF1/CIP1基因啟動子片段DNA的含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用Student's t-test分析軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，結(jié)果以表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Leptin通過影響組蛋白的乙?；秸{(diào)控乳腺癌細胞的增殖 將Leptin與乳腺癌MDA-MB-231細胞作用后發(fā)現(xiàn)，Leptin誘導(dǎo)乳腺癌細胞增殖與HDAC1活力增強有明顯關(guān)系，HDAC1 mRNA和蛋白表達水平明顯高于對照組，同時組蛋白H3、H4乙酰化水平降低；SAHA的作用則相反，經(jīng)其處理后HDAC1 mRNA和蛋白表達水平明顯低于對照組，同時組蛋白H3、H4乙?；缴?，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1A、1B。當應(yīng)用ChIP研究與乙酰化組蛋白H3、H4作用的染色質(zhì)區(qū)域時發(fā)現(xiàn)，Leptin處理后的乳腺癌細胞中富集于乙酰化組蛋白H3、H4區(qū)域的GAPDH啟動子片段明顯少于未處理細胞組，而SAHA處理后H3、H4區(qū)域GAPDH啟動子片段高于未處理細胞組（P＜0.05），見圖1C、1D。

圖1 Leptin誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231細胞HDAC1的mRNA和蛋白表達及對組蛋白H3、H4乙?；接绊?/p>

2.2 Lepin誘導(dǎo)乳腺癌細胞增殖過程中伴隨p21WAF/CIP1啟動子區(qū)域活性的下降 實時定量PCR和Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Leptin處理后的乳腺癌MDA-MB-231細胞p21WAF/CIP1mRNA及蛋白表達水平遠遠低于對照組細胞，而應(yīng)用SAHA處理后p21WAF/CIP1的mRNA及蛋白表達水平明顯高于對照組（P＜0.05），見圖2A、2B。ChIP結(jié)果顯示：Leptin處理后的乳腺癌細胞p21WAF/CIP1啟動子區(qū)域與乙?；M蛋白H3、H4結(jié)合的染色質(zhì)物質(zhì)明顯少于未處理細胞組的相同區(qū)域（P＜0.05），見圖2C、2D。

圖2 p21WAF/CIP1調(diào)控Leptin誘導(dǎo)HDAC1的mRNA和蛋白的表達及對組蛋白H3、H4乙?；接绊?/p>

3 討論

盡管乳腺癌發(fā)生和發(fā)展的原因十分復(fù)雜，但歸根到底都和基因表達及基因表達產(chǎn)物活性異常密切相關(guān)。隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)表觀遺傳性狀改變在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中具有更普遍的意義，其作用主要是通過影響基因轉(zhuǎn)錄活性而非DNA序列突變、可經(jīng)細胞分裂和增殖得以穩(wěn)定遺傳［8］。正是由于表觀遺傳改變所具有的這種獨特表達調(diào)控方式使其逐漸成為乳腺癌研究和治療的熱點。在正常乳腺細胞中，組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶（histone acetyltransferase，HAT）將乙酰輔酶A上的疏水乙?；糠洲D(zhuǎn)移至染色質(zhì)核心組蛋白氨基末端特定賴氨酸殘基上，中和氨基上的正電荷，使DNA與組蛋白之間的空間位阻增大，使DNA易于解聚、舒展，從而轉(zhuǎn)錄因子、調(diào)節(jié)因子復(fù)合物和RNA合成酶能更好地與DNA模板相結(jié)合，激活特定基因的轉(zhuǎn)錄。而HDAC則通過移去組蛋白氨基末端賴氨酸殘基的乙酰基，恢復(fù)組蛋白的正電荷，從而與帶負電荷的DNA緊密結(jié)合，抑制基因的轉(zhuǎn)錄。在乳腺細胞功能異常時，HDAC的活性明顯增強，組蛋白處于低乙?；癄顟B(tài)，基因表達平衡狀態(tài)被破壞，使一些調(diào)控細胞增殖、分化、凋亡的基因表達失衡，導(dǎo)致乳腺癌的形成［9-10］。

雖然目前尚無腫瘤相關(guān)HDAC突變的報道，但研究表明在乳腺癌組織中HDAC呈高表達，HDAC在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中扮演了非常重要的角色［11-13］。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Leptin作用乳腺癌MDA-MB-231后，細胞中HDAC1 mRNA和蛋白表達水平明顯增高，同時伴隨著核心組蛋白H3、H4乙?；降慕档?。當應(yīng)用ChIP研究與乙?；M蛋白H3、H4作用的染色質(zhì)區(qū)域時發(fā)現(xiàn)，Leptin作用后的乳腺癌細胞中富集于乙?；M蛋白H3、H4區(qū)域的GAPDH啟動子片段明顯減少。這說明Leptin誘導(dǎo)乳腺癌細胞增殖過程中伴隨著表觀遺傳學(xué)性狀的改變，特別是組蛋白乙?；降淖兓＿M一步的實驗表明，Leptin處理后的乳腺癌細胞p21WAF/CIP1mRNA及蛋白表達水平遠遠低于Leptin未處理組細胞。當應(yīng)用HDAC抑制劑SAHA作用后p21WAF/CIP1的表達水平明顯升高。ChIP分析結(jié)果顯示Leptin處理的乳腺癌細胞p21WAF/CIP1啟動子區(qū)域與乙?；M蛋白H3、H4結(jié)合的染色質(zhì)物質(zhì)明顯少于未處理細胞組的相同區(qū)域，而用SAHA處理后結(jié)果則相反。這說明Leptin誘導(dǎo)乳腺癌細胞增殖過程中通過激活HDAC1的活性使核心組蛋白去乙?；瑥亩种苝21WAF/CIP1的表達，最終促進細胞周期從G1→S期的進程。

由于有關(guān)乙?；?去乙?；揎椇腿橄侔┑年P(guān)系還有很多問題亟待解決，特別是在p21WAF1/CIP調(diào)控乳腺癌細胞增殖過程中相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的具體作用方式以及去乙?；碛^遺傳學(xué)修飾所誘導(dǎo)的抑癌基因特異性表達機制均值得進一步研究。本研究對于進一步探討乳腺癌發(fā)生過程中的有關(guān)表觀遺傳修飾的作用機制，拓寬乳腺癌研究方向，尋找潛在、有效的乳腺癌靶基因治療位點奠定了堅實的實驗和理論基礎(chǔ)。

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（文敏編輯）

Histone Acetylation Involved in Leptin-induced Proliferation ofBreastCancer MDA-MB-231 Cells

ZHOU Weiqiang

（Shenyang Medical College，Key Laboratory of Environmental Pollution and Microecology of Liaoning Province，Shenyang 110034，China）

Objective：To study the role of histone acetylation on Leptin-induced proliferation of breast cancer MDA-MB-231 cells.Methods：Quantitative real-time PCR and Western blot were used to measure the effects of Leptin and SAHA（a histone deacetylase inhibitor）on proliferation of breast cancer MDA-MB-231 cells.Chromatin immunoprecipitation（ChIP）was used to detect the levels of histone acetylation after Leptin and SAHA treatment.Results：Leptin significantly enhanced the HDAC1 activity in MDA-MB-231 cells，accompanied with lower levels of histone H3 and H4 acetylation（P＜0.05）.ChIP analysis showed that activated HDAC1 reduced the load of acetylated histones（H3 and H4） to the p21WAF1/CIP1promoter，which significantly decreased the expression levels of p21WAF1/CIP1mRNA and protein（P＜0.05），and accelerated the cell cycle progression.Conclusion:Leptin's effects on MDA-MB-231 cells are associated with HDAC1 activation，which decrease H3/H4 acetylation status and restrains the effects of p21WAF1/CIP1on cell cycle，thereby contributing to triple-negative breast carcinogenesis.

breast cancer；MDA-MB-231；SAHA；deacetylation

R394.3

A

1008-2344（2017）01-0011-04

10.16753/j.cnki.1008-2344.2017.01.003

2016-06-06

國家自然科學(xué)基金項目（No.81172509）

周偉強（1970—），男（漢），教授.研究方向：乳腺癌發(fā)生與調(diào)控.E-mail：zhouwq@hotmail.com