刺薏復方不同制備物對輻射后小鼠外周血白細胞的影響＊

伍明江，敖 靜，周 敏，蔣朝暉，吳曉黎

刺薏復方不同制備物對輻射后小鼠外周血白細胞的影響＊

伍明江，敖 靜，周 敏，蔣朝暉，吳曉黎

目的 比較刺薏復方不同提取方法制備的藥物對輻射損傷模型小鼠外周血白細胞的影響。方法 分別用水和75%乙醇溶液對刺薏復方中藥物進行提取，以干浸膏得率和刺五加中紫丁香苷作為提取考察指標，并將不同制備所得的干浸膏按處方比灌胃BALB/c小鼠14 d后，以4GY Co60γ射線一次性全身照射，比較小鼠照射前、照射后第3天、照射后第14天外周血白細胞的變化。結果 刺薏復方水提取干浸膏得率和紫丁香苷含量均較75%乙醇提取要高，烏梅單獨水提取按處方比加入復方水提取灌胃小鼠，能顯著增加輻射損傷模型小鼠外周血白細胞數(shù)的作用。結論 刺薏復方以烏梅單獨水提取并加入復方水提取的方法能顯著增加輻射后外周血白細胞總數(shù)。

刺薏復方；提?。豢馆椛?；外周血白細胞

輻射是一種新型污染，人體長期受到輻射，會使造血系統(tǒng)細胞受損，導致外周血白細胞減少，機體免疫功能下降，甚至機體的蛋白質(zhì)、核酸、酶、染色體發(fā)生畸變［1，2］，造成對多個系統(tǒng)的危害［3］，特別是對男性生殖系統(tǒng)有較大影響［4］。人體遭受輻射后出現(xiàn)疲乏無力、頭昏眩暈、五心煩熱等癥狀。中醫(yī)學認為是熱盛傷陰、津液受損、氣血不和、脾胃失調(diào)、耗氣傷血及肝腎虧損，因而提出了運用復方制劑進行清熱解毒、生津潤燥、涼補氣血、健脾和胃、滋補肝腎的治療原則，以達到對機體整體調(diào)理的目的［5］。

刺薏復方由貴陽中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院資深中醫(yī)專家根據(jù)長期治療腫瘤、血液病、體虛的臨床經(jīng)驗和現(xiàn)代醫(yī)藥研究進展組成的方劑。該方由刺五加、薏苡仁、酸棗仁、烏梅等藥物組成。刺五加為君，能益氣健脾，溫陽補腎，培補先天，培其生命之本；以薏苡仁為臣，健脾利濕，培養(yǎng)后天之本，健脾胃、強氣血，有生化之源；酸棗仁養(yǎng)心安神，安心神定，睡眠充足，脾腎功能運轉正常，脾腎二臟相輔相成，氣旺精足，用之為佐；烏梅用其收斂之性，止其汗，用其酸味開胃生津，用之為使。據(jù)報道，該方中刺五加、薏苡仁等藥物均有不同程度的抗輻射輔助保護作用，整方注重從提高機體免疫功能來達到抗輻射輔助保護作用［6-10］。

基于刺薏復方抗輻射的有效作用，本研究從后續(xù)擬開發(fā)的有關刺薏復方抗輻射制劑角度考慮，重點考察刺薏復方不同提取方法浸膏得率以及所配比藥物對輻射外周血白細胞的影響，通過不同提取方法有關指標考察和外周血白細胞恢復作用的實驗研究，以期確定刺薏復方的提取方法以及增加輻射后外周血白細胞的藥物配比。本研究旨在為刺薏復方及其抗輻射有關制劑的開發(fā)應用提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料動物為BALB/c小鼠，重量（20±2）g，雌性，一級清潔動物，由中國科學院上海實驗動物中心提供。實驗藥物為刺五加、薏苡仁、酸棗仁、烏梅，均購買于貴陽市中藥材市場。各藥材均經(jīng)貴州省藥檢所林開中老師鑒定；紫丁香苷對照品購買于中國藥品生物制品檢定所，批號：111574-200502；螺旋藻片購買于南寧健星生物技術有限公司，批準文號：南衛(wèi)食字［2004］第20180號。主要試劑為乙醇、甲醇，均購買于天津市康科德科技有限公司，白細胞稀釋液自制（冰醋酸2.0ml、1%甲紫，蒸餾水加至100ml），5%火棉膠，消毒碘酒等。主要儀器為GWGP 80型鈷-60治療機（中國核動力院設備制造廠），Agilent 1100高效液相色譜儀 （美國安捷倫科技有限公司），潔凈動物飼養(yǎng)柜（蘇杭實驗動物發(fā)展科技發(fā)展公司），CX31光學顯微鏡 （日本Olympus公司）等。

1.2 實驗方法

1.2.1 藥物制備 以傳統(tǒng)用藥方法為提取的基本依據(jù)，對刺薏復方進行水和75%乙醇提取。但基于烏梅中含有大量有機酸，具有較強的酸性（經(jīng)測試：烏梅8倍量水提液pH=3，其他藥物提取液為中性），與復方中其他藥物一起提取可能會造成有效成分的酸水解，因此，考察了烏梅另行提取的方案。水提取或75%乙醇提取均檢測了刺五加中紫丁香苷的含量。

提取方法有兩種：（1）水煎煮提取。分別將刺薏復方四味藥，刺五加、薏苡仁、酸棗仁三味藥，烏梅一味藥三組藥物進行水煎煮2次，3 h/次。第1次加10倍量水，過濾，藥渣第2次加8倍量水，過濾，將2次濾液合并，3000 rpm離心15min，分離上清液，水浴蒸干濃縮，再減壓干燥成干浸膏，即得。（2）75%乙醇回流提取。分別將刺薏復方四味藥，刺五加、薏苡仁、酸棗仁三味藥，烏梅一味藥三組藥物加75%乙醇回流提取2次，第1次加8倍量75%乙醇，回流提取12 h，過濾，藥渣第2次加5倍量75%乙醇，回流提取3 h，過濾，將2次濾液合并，3000 rpm離心15min，分離上清液，減壓濃縮，再干燥成干浸膏，即得。

干浸膏得率按“干浸膏重量/藥材重量×100%”進行計算，從不同提取方法可以看出水煎煮所得干浸膏明顯高于75%乙醇回流提取所得干浸膏，見表1。

紫丁香苷的含量測定：（1） 色譜條件。20RBAXSB-C18色譜柱，以甲醇∶水（18∶82）為流動相，檢測波長265 nm，柱溫40℃。（2）標準品的制備。取紫丁香苷對照品適量，精密稱定，用50%甲醇溶解，制成80μg/mL的溶液，即得。（3）樣品處理。分別稱取含有刺五加的干浸膏樣品0.1 g，加10ml 50%的甲醇溶解，超聲提取30min，取上清液10 000 rpm離心10min，過0.45μm濾膜，即得。（4）檢測結果。紫丁香苷是刺五加中成分，故未對烏梅干浸膏測定。從結果可以看出，刺五加、薏苡仁、酸棗仁水提取干浸膏中紫丁香苷含量最高，見表1。

表1 不同提取組分在水和75%乙醇提取的干浸膏得率及紫丁香苷含量

1.2.2 外周血細胞計數(shù)實驗［11］（1）動物分組。BALB/c小鼠64只，隨機分成8組，即A組為輻射模型對照組（生理鹽水組），B組為陽性藥物對照組（螺旋藻片組），C組為刺五加、薏苡仁、酸棗仁三味藥水提取干浸膏組，D組為刺五加、薏苡仁、酸棗仁三味藥水提取干浸膏另加烏梅水提取干浸膏組，E組為刺五加、薏苡仁、酸棗仁三味藥75%乙醇提取干浸膏組，F(xiàn)組為刺五加、薏苡仁、酸棗仁三味藥75%乙醇提取干浸膏另加烏梅75%乙醇提取干浸膏組，G組為刺薏復方四味藥水提取干浸膏組，H組為刺薏復方四味藥75%乙醇提取干浸膏組，每組小鼠8只。（2）給藥劑量。小鼠給藥量按成人劑量的15倍計，即按“成人生藥材處方量×干浸膏得率×15/ 60”進行計算，各組給藥量見表2。螺旋藻片按成人劑量15倍的給藥量為1.13 g/kg）（螺旋藻片成人劑量是9片/d），灌胃時將藥物用飲用水溶解。（3）給藥方式。動物于潔凈動物飼養(yǎng)柜中適應性飼養(yǎng)1周后開始給藥，于每天上午給藥1次，照射前給藥14 d，照射后給藥14 d。（4）造模方法。以Co60γ射線按4GY劑量全身照射小鼠一次，引起小鼠輻射損傷。

1.2.3 樣品采集和計數(shù)方法 分別于實驗照射前、照射后第3天，照射后第14天三次采尾部末梢血10μl，每次采血后用5%火棉膠涂抹小鼠的尾部，將采取的血立即加入到裝有490μl的白細胞稀釋液的試管中，充分混勻后加入到血球計數(shù)板中于顯微鏡下進行計數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計分析，結果采用均數(shù)±標準差（±s）表示。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

按 “四個大方格中白細胞總數(shù)/4×稀釋倍數(shù)× 107”計算血球計數(shù)板中白細胞總數(shù)，結果如表2和圖1顯示，輻射前后外周血白細胞變化較大，說明輻射損傷模型已建立，組內(nèi)數(shù)據(jù)滿足統(tǒng)計學正態(tài)分布。藥物組，與生理鹽水組比較，B、D、F三組均在輻射后對小鼠的外周血白細胞有顯著性差異，其中D組在三個階段均有顯著性差異 （與生理鹽水組比較，P<0.05），其余各組在統(tǒng)計學上無較大差異。

表2 不同制備方法對輻射前后小鼠外周血白細胞的影響（n=8，±s，109/L）

表2 不同制備方法對輻射前后小鼠外周血白細胞的影響（n=8，±s，109/L）

注：與生理鹽水組比較，＊P<0.05，#P<0.01。

編號 劑量（g/kg） 照射前第3天 照射后第3天 照射后第14天A - 16.24±3.42 4.05±0.87 6.09±0.47 B 1.13 17.59±3.03 4.49±1.57 7.12±1.04＊C 2.00 18.55±1.42 5.16±1.14 6.41±2.00 D 3.00 21.63±3.06# 5.18±0.81＊ 7.18±1.09＊E 1.17 19.13±2.96 5.01±1.55 5.96±1.27 F 1.50 20.56±3.58＊ 4.83±0.87 6.98±0.83＊G 3.14 18.24±2.35 4.51±1.21 6.46±0.89 H 1.26 19.08±3.25 5.03±1.06 6.55±1.96

圖1 不同制備方法對輻射前后小鼠外周血白細胞的影響

3 討論

實驗選擇了干浸膏得率和君藥刺五加中紫丁香苷含量［12］作為整方的提取控制指標。不同提取方法研究顯示，水煎煮較75%乙醇回流提取干浸膏得率要高，考慮到后續(xù)制劑工業(yè)化生產(chǎn)，水煎煮提取是更理想的提取方式，此時紫丁香苷的含量為最高，又基于烏梅在煎煮過程中可能會影響復方中的化學成分，最好的提取方法就是刺五加、薏苡仁、酸棗仁三味藥水提取干浸膏另加烏梅水提取干浸膏（簡稱“水3加1”）。從藥理作用效果來看，根據(jù)外周血白細胞計數(shù)結果，“水3加1”組和刺五加、薏苡仁、酸棗仁三味藥75%乙醇提取干浸膏另加烏梅75%乙醇提取干浸膏組均能顯著增加輻射損傷模型小鼠外周血白細胞的作用，表明其具有一定的抗輻射輔助作用，雖兩者之間無統(tǒng)計學差異，但從統(tǒng)計數(shù)據(jù)來看，“水3加1”組更明顯地增加了小鼠輻射后外周血白細胞的作用。因此，“水3加1”是刺薏復方最佳的提取方法以及在該制備下所得的藥物具有顯著增加小鼠輻射后外周血白細胞的作用。

該課題組前期研究表明薏苡仁中薏苡仁酯對輻射后小鼠外周血白細胞及胸腺脾臟具有一定的保護作用［10］，但由于薏苡仁酯屬于脂肪酸類衍生物，不易溶于水和乙醇，故薏苡仁酯的提取采用了超臨界二氧化碳萃取法［10］或乙酸乙酯浸提法［13］。在該實驗中，研究重點是考察整方在水煎煮和75%乙醇回流提取下，刺薏復方對輻射后小鼠外周血白細胞的影響，為了考慮到薏苡仁酯可能對整方抗輻射產(chǎn)生協(xié)同作用，薏苡仁酯另行提取后按處方比加在復方提取物中進行相關實驗研究，后續(xù)工作還有待進一步進行。

輻射與人們的生活、工作關系越來越密切，如經(jīng)常接觸輻射的工作人員、醫(yī)療上接受診斷和放化療患者、接觸礦物質(zhì)輻射的采礦工人，而現(xiàn)代生活接觸最普遍的就是計算機、手機、紫外線等一系列不可避免的輻射，直接或間接傷害人們的身體健康。人們對抗輻射的途徑有多種，如穿戴防護衣、出門攜帶防護傘等，但這些防護措施不僅給人們的生活帶來極大不便，而且從根本上消除不了輻射對機體的傷害。目前市場上抗輻射制劑較少，且效果多不盡如人意，而一些抗輻射合成藥物在給藥的同時也給機體帶來了不良反應。中藥以其療效好、不良反應小為特點，制成的制劑在市場上大受青睞，因此對中藥抗輻射復方制劑的研發(fā)刻不容緩。本實驗選用臨床抗輻射有效復方，從藥物提取方法和抗輻射藥理篩選進行研究，該研究主要為刺薏復方及其制劑的開發(fā)奠定了基礎，為中藥抗輻射制劑的應用帶來新市場前景。

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［2016－09－13收稿，2016－10－11修回］

［本文編輯：劉一洋］

The effect of different extracts of CiYi Compound on white cell of peripheral blood in radiated injury m ice

WU Ming-jiang①，AO Jing，ZHOU Min，et al.①Department of Pharmacy，Zunyi Academy of Medicine＆Drug，Zunyi，Guizhou 563002，China

ObjectiveTo study the effects of different extracts of CiYi compound on white cell of periphery blood in radiational injury mice.M ethodsThe drugs were extracted with water or 75%ethanol from CiYi compound respectively；the obtained dry extract yield and the content of syringin were used as the index of extraction.The BALB/c mice were exposed to 4GY Co60γ ray at one time on the 14th day after orally administered dry extracts of CiYi Compound and the change of white cells of periphery blood were compared on the third day before radiation，on the third day and 14th day after radiation.ResultsThe dry extract yield and the content of syringin of the water extract were higher than those of the 75%ethanol.The water extract of Wumei was added to other drugs of CiYi Compound could significantly increase white cells of periphery blood in radiational injury mice.ConclusionThe water extract（Wumei alone water added to compoand water）of CiYi Compound can increase white cells of periphery blood in mice after radiation.

CiYi Compound；Extraction；Anti-radiation；White cell of peripheral blood

R931.71

A

10.14172/j.issn1671-4008.2017.04.023

貴州省科技合作計劃項目（黔科合LH字［2015］7577號）

563002貴州遵義，遵義醫(yī)藥高等?？茖W校藥學系（伍明江，周敏）；遵義市第一人民醫(yī)院乳甲科（敖靜）；550002貴州貴陽，貴陽中醫(yī)學院制劑重點實驗室（蔣朝暉，吳曉黎）