金線蛙不同時(shí)期蝌蚪骨骼的雙染色研究

陳亞菲 高 鑫 張雅楠 王洪凱 王明山

（棗莊學(xué)院 山東 棗莊 277160）

金線蛙不同時(shí)期蝌蚪骨骼的雙染色研究

陳亞菲 高 鑫 張雅楠 王洪凱 王明山*

（棗莊學(xué)院 山東 棗莊 277160）

本文對(duì)金線蛙不同發(fā)育時(shí)期蝌蚪的后肢骨進(jìn)行雙重染色，研究其骨骼的發(fā)育。結(jié)果顯示，金線蛙后肢骨的發(fā)育模式基本遵循著由近端到遠(yuǎn)端發(fā)育的順序，體現(xiàn)了金線蛙由水棲到陸棲環(huán)境轉(zhuǎn)換的骨骼系統(tǒng)形態(tài)改變和生態(tài)適應(yīng)。

金線蛙 蝌蚪 骨骼 雙染色法

金線蛙(Rana plancyi plancyi)在我國(guó)分布廣、數(shù)量較多，是害蟲的天敵。兩棲動(dòng)物代表著脊椎動(dòng)物發(fā)育的原始模型，蛙的發(fā)育機(jī)制與人類等高等動(dòng)物極為相似，從兩棲動(dòng)物還可以演繹出爬行動(dòng)物、鳥類和哺乳動(dòng)物的不斷改善的發(fā)育進(jìn)程。金線蛙是典型變態(tài)發(fā)育的兩棲動(dòng)物，其體發(fā)育過(guò)程經(jīng)歷了卵、蝌蚪、幼蟾蜍、成蟾蜍四個(gè)階段。在從受精卵發(fā)育到成蟾蜍的變態(tài)過(guò)程中會(huì)進(jìn)行骨骼的重構(gòu)和四肢的發(fā)育，進(jìn)而成為適應(yīng)陸生環(huán)境的四足兩棲類。對(duì)兩棲動(dòng)物肢體不同部位的發(fā)育模式及骨化次序進(jìn)行觀察并研究，并需要掌握好骨骼雙染色法制作標(biāo)本，為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

金線蛙卵采自魯南地區(qū)的山東省棗莊市市中區(qū)棗莊學(xué)院周圍的小水潭(E116°48′-117°49′，N34°27′-35°19′，海拔191m。蛙卵置于透明玻璃缸內(nèi)，放于向陽(yáng)處進(jìn)行馴養(yǎng)，在蝌蚪培育期間(60～90日齡)，每天對(duì)蝌蚪進(jìn)行采樣，每次隨機(jī)采集10尾，用顯微鏡或解剖鏡測(cè)定全長(zhǎng)后立即用5%的福爾馬林溶液進(jìn)行固定，供日后透明標(biāo)本制作。

1.2 染色液的配置

1.2.1 茜素紅染色液配制 按100ml的0.3mol/L的氫氧化鉀溶液加入5mg的茜素紅的比例配置成紅色的硬骨染液。

1.2.2 阿利新藍(lán)染液 取20mg阿利新藍(lán)染料，加人60ml無(wú)水乙醇，再加40mI冰乙酸（pH≤1.0）。

1.2.3 脫色液 梯度酒精(25%、50%、75%、100%)。

1.2.4 透明液的配制 （1）透明液一：丙三醇20ml、蒸餾水77ml、2%氫氧化鈉溶液3ml混合而成。（2）透明液二：丙三醇75ml、蒸餾水25ml。（3）透明液三：100%的丙三醇100ml。

1.2.5 胰酶溶液 30ml飽和硼酸溶液+70ml蒸餾水+胰蛋白酶1g。

1.3 染色處理步驟

1.3.1 軟骨染色 首先將用福爾馬林固定的蝌蚪用蒸餾水滴洗數(shù)次直到軟化為止，直接放置于阿利新藍(lán)染液中浸泡處理5d，染色時(shí)間視軟骨染色程度而定，直至后肢骨骼出現(xiàn)濃青色為止。

1.3.2 脫色 將標(biāo)本從軟骨染色液中取出，放入脫色液中脫色，接著用95%乙醇水溶液浸泡2h兩次，然后再依次分別用25%、50%、75%、100%的乙醇水溶液各處理2h，最后將標(biāo)本移入蒸餾水中放置24h直到標(biāo)本沉下。

1.3.3 去組織處理 經(jīng)蒸餾水浸泡后的標(biāo)本用胰酶溶液36℃條件下進(jìn)行去組織處理，每隔2d溶液呈藍(lán)色時(shí)，及時(shí)更換酶溶液，反復(fù)多次直至蝌蚪骨骼清晰可見。

1.3.4 硬骨染色 將經(jīng)酶溶液處理后的標(biāo)本放入茜紅素染液，染色3～5h，直至硬骨染紅為止

1.3.5 褪色和透明 然后將茜紅素染液換成0.5%的NaOH溶液，浸泡數(shù)小時(shí)，直至多余染色液完全去除。

1.3.6 脫水和固定 再依次轉(zhuǎn)換成透明液一、透明液二和透明液三溶液，各處理5h。

1.3.7 觀察 使用配備有數(shù)碼照相機(jī)的生物顯微鏡和解剖鏡觀察各日齡蝌蚪骨骼發(fā)育形態(tài)特征，并進(jìn)行拍照[1,4]。

2 結(jié)果

（1）雙染成功的標(biāo)本，已骨化的骨骼被茜素紅染成紅色或紫紅色，軟骨則被阿利新藍(lán)染成藍(lán)色，在紅色的骨周圍或兩端都是染成藍(lán)色的軟骨，界限明顯，骨骼完好無(wú)損。雙染的標(biāo)本在顯微鏡下可清楚地觀察到骨骼的發(fā)育形態(tài)。（2）金線蛙蝌蚪的后肢(hind limb)是由股骨(femur)、脛腓骨(tibio-ibula)、跗 骨 (tarsus)、蹠骨(metatarsus)、趾骨(phalanges)。（3）股骨為股部的一根棒狀硬骨，其近端呈圓球狀，與髂臼連接，稱股骨頭，股骨頭嵌入髖臼構(gòu)成髖關(guān)節(jié)，遠(yuǎn)端與脛腓骨相關(guān)節(jié)。股骨的長(zhǎng)度隨時(shí)間的增長(zhǎng)有所增加，軟骨性股骨的骨干逐漸骨化，股骨骨干的骨化由中央的骨干向兩端逐漸延伸。到圖三時(shí)期，股骨的骨干已完全骨化，但兩端骨骺仍未骨化[5]。（4）脛腓骨為脛部的一根長(zhǎng)骨，骨干內(nèi)外兩面中間各有一條淺縱溝，表明此骨系由脛、腓兩骨合并而成，其近端與股骨形成膝關(guān)節(jié)，遠(yuǎn)端與跗骨相關(guān)節(jié)。稍長(zhǎng)于股骨。（5）跗骨(2-I)5枚，排成2列。與脛腓骨相關(guān)節(jié)的是一堆短棒狀骨，外側(cè)的為腓跗骨(跟骨)，內(nèi)側(cè)的稱脛跗骨(距骨)，兩骨上端愈合，下端相互靠攏。另3枚呈顆粒狀，在跟骨、距骨和跖骨之間排成一橫列。（6）蹠骨(2-II)為5支細(xì)長(zhǎng)骨節(jié)，第4支最長(zhǎng)，第3支和第5支次之，第2支又次之，第1支最短。（7）趾骨(2-III)是與蹠骨相連的骨節(jié)，趾節(jié)向遠(yuǎn)端逐漸細(xì)小，每個(gè)隊(duì)、趾各關(guān)節(jié)兩端都覆以軟骨髓。后肢五趾，第1、2趾有2枚趾骨，第3、5趾有3枚趾骨，第4趾有4枚趾骨[6]。

1.Cosner39期，附骨出現(xiàn)，而且脛骨和膝骨兩端逐漸有愈合現(xiàn)象; 2.Cosner40期，趾骨以3-4-3-2-2的排列模式出現(xiàn)，而且可觀察到前拇趾的第二趾骨; 3.Cosner43期，趾骨已完全骨化，但前拇趾及遠(yuǎn)端趾骨仍未骨化

3 討論

金線蛙后肢骨的發(fā)育模式基本遵循著由近端到遠(yuǎn)端發(fā)育的順序。變態(tài)過(guò)程中后肢股骨與脛腓骨相對(duì)長(zhǎng)度的變化趨勢(shì)是幼蛙登陸的重要指標(biāo)。兩棲類蝌蚪的形態(tài)在多樣性的變態(tài)過(guò)程中，后肢脛腓骨的愈合體現(xiàn)了無(wú)尾類骨骼發(fā)育的保守性，以及由水棲到陸棲環(huán)境轉(zhuǎn)換的骨骼系統(tǒng)形態(tài)改變和生態(tài)適應(yīng)。兩棲動(dòng)物變態(tài)過(guò)程中骨骼的骨化增加了骨密度，導(dǎo)致支撐能力增強(qiáng)，也進(jìn)一步解決了無(wú)尾目動(dòng)物由水生到陸棲身體重量擔(dān)負(fù)問(wèn)題。

3.1 染液的配制和保存

用蒸餾水配制茜素紅飽和液(即原液)時(shí)并不需要精確稱量，配制好后轉(zhuǎn)入棕色試劑瓶中避光保存。茜素紅染液、阿利新藍(lán)染液均要求常溫避光保存，否則會(huì)致標(biāo)本著色過(guò)淺或無(wú)法著色。

3.2 染色和透明處理

在進(jìn)行軟骨染色時(shí)，要在強(qiáng)陽(yáng)光下進(jìn)行，如果遇到陰天，則需要借助紫外光的照射。用透明液進(jìn)行透明時(shí)，時(shí)間不要過(guò)長(zhǎng)，應(yīng)定時(shí)觀察標(biāo)本情況，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致骨骼過(guò)軟而散掉。

3.3 染色后標(biāo)本的保存

為便于對(duì)染色后標(biāo)本骨骼的觀察，可用寬底的玻璃稱量瓶(40mm×40mm)裝標(biāo)本，這樣既便于觀察，同時(shí)能防止染液被蒸發(fā)，但應(yīng)注意在一個(gè)容器內(nèi)不要放置過(guò)多的標(biāo)本，最好是每瓶1～2個(gè)，因?yàn)闃?biāo)本過(guò)多，過(guò)于擁擠會(huì)延長(zhǎng)染色時(shí)間。對(duì)于已有部分損傷的標(biāo)本，如尾部斷開、四肢與軀干分開的標(biāo)本，則每個(gè)瓶只裝一個(gè)。沒有經(jīng)過(guò)脫水處理的標(biāo)本，容易發(fā)生霉變，從而影響觀察。因此，雙染成功的標(biāo)本經(jīng)過(guò)逐級(jí)梯度甘油進(jìn)行透明和脫水后，加入100%甘油保存，同時(shí)加少許麝香草酚以防腐?？傊趋离p染標(biāo)本的制作，為動(dòng)物學(xué)的骨骼研究、比較解剖學(xué)的研究和實(shí)驗(yàn)教學(xué)提供了直觀、真實(shí)的形態(tài)學(xué)素材，在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中能激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，使學(xué)生對(duì)動(dòng)物骨骼的發(fā)育過(guò)程和各骨的位置關(guān)系有更直觀的認(rèn)識(shí)，同時(shí)骨骼雙染的標(biāo)本可以長(zhǎng)期保存作為陳列和展覽所用。

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