Ⅱ型膠原蛋白的結(jié)構(gòu)、功能及其最新研究進展

周曉輝，常亞南，何曉亮，張晉弘

(河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院, 河北石家莊 050018)

Ⅱ型膠原蛋白的結(jié)構(gòu)、功能及其最新研究進展

周曉輝，常亞南，何曉亮，張晉弘

(河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院, 河北石家莊 050018)

Ⅱ型膠原蛋白是動物體內(nèi)透明軟骨的主要成分，具有良好的生物相容性、可降解性、可促進細胞生長和再分化等生物學(xué)特性，可作為人體組織工程材料，也可應(yīng)用于食品、日化、包裝等領(lǐng)域。利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組Ⅱ型膠原蛋白是該領(lǐng)域的研究熱點。綜述了Ⅱ型膠原蛋白的結(jié)構(gòu)、功能及應(yīng)用，闡述了基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組Ⅱ型膠原蛋白的最新研究進展，對未來羥化膠原蛋白在大腸桿菌中的大規(guī)模生產(chǎn)進行了展望，以期為Ⅱ型膠原蛋白的進一步開發(fā)和同行研究提供指導(dǎo)和幫助。

蛋白質(zhì)工程；Ⅱ型膠原蛋白；透明軟骨；組織工程；基因重組

膠原蛋白(collagen)又稱膠原，是由動物細胞合成的一種生物大分子蛋白質(zhì)，廣泛存在于動物體內(nèi)，含量豐富，種類繁多，對細胞、組織乃至器官行使正常功能以及損傷修復(fù)都有重大影響[1]。

目前已發(fā)現(xiàn)了至少49種不同的膠原蛋白多肽鏈，可以形成的膠原蛋白類型已增加至28種[2]。根據(jù)膠原原纖維的特征，膠原蛋白可分為帶有周期性橫紋的原纖膠原蛋白和沒有周期性橫紋的非原纖膠原蛋白兩大類，其中原纖膠原蛋白約占膠原蛋白總數(shù)的90%，包括Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅴ，Ⅵ，ⅩⅩⅣ 和ⅩⅩⅦ 型膠原蛋白，其余種類均為非原纖膠原蛋白，非原纖膠原蛋白又可進一步分為FACIT族、網(wǎng)狀、念珠狀等6種，具體詳見表1[3-4]。根據(jù)在體內(nèi)的分布，膠原蛋白又可分為間質(zhì)膠原、基底膜膠原和細胞外周膠原，由于膠原蛋白多存在于細胞間質(zhì)中，故間質(zhì)膠原蛋白占整個機體膠原的絕大部分，包括Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ型膠原蛋白分子[5]。

表1 膠原蛋白的類型及其在組織中的分布

注：“—”表示目前尚未確定。

典型的膠原蛋白分子，是由3條左手螺旋且為聚脯氨酸Ⅱ型(PPⅡ)的α肽鏈，相互咬合纏繞，形成長且堅韌的右手超螺旋結(jié)構(gòu)，這是膠原蛋白特有的結(jié)構(gòu)區(qū)域，稱為“三螺旋域”，一級結(jié)構(gòu)分析表明三螺旋域的最大特點是氨基酸呈現(xiàn)(Gly-X-Y)n周期性重復(fù)排列，其中X位置通常為脯氨酸(Pro)，Y通常為羥脯氨酸(Hyp)和羥賴氨酸(Hyl)，而后兩種氨基酸在其他蛋白質(zhì)中很少見。所有類型的膠原蛋白都有這種重復(fù)序列，只是非原纖膠原的三螺旋域中該重復(fù)序列在某些特定位置被破壞[2]。這種三肽重復(fù)序列對膠原蛋白結(jié)構(gòu)的形成起著很大作用，甘氨酸是唯一適合肽鏈內(nèi)部空間位置折疊且能優(yōu)化折疊構(gòu)象的氨基酸，羥脯氨酸的羥基參與鏈間氫鍵的形成，用于穩(wěn)定膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)且保持其熱穩(wěn)定性，而羥賴氨酸參與分子內(nèi)和分子間的共價交聯(lián)，同時也作為膠原蛋白特定多糖附著的受體，對原纖維的形成有作用[6]。

在膠原家族的眾多成員里，Ⅱ型膠原蛋白主要分布在軟骨、玻璃體中，占成人軟骨基質(zhì)膠原蛋白總量的90%以上[7]。Ⅱ型膠原蛋白基因的表達是骨型形成、軟骨形成、骨骼生長和成熟軟骨維持等所必需的。許多軟骨性疾病的發(fā)生發(fā)展，都與Ⅱ型膠原蛋白的結(jié)構(gòu)或功能異常密切相關(guān)[8-10]。本文著重對Ⅱ型膠原蛋白的結(jié)構(gòu)、功能及其發(fā)展現(xiàn)狀進行了論述，為Ⅱ型膠原蛋白的進一步研究開發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。

1 Ⅱ型膠原蛋白的結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)

1.1 Ⅱ型膠原蛋白的結(jié)構(gòu)

圖1 Ⅱ型膠原蛋白的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of procollagen type Ⅱ

早在20世紀70年代初，MILLER[11]就從雞軟骨組織中分離出一種新型的膠原蛋白，稱之為Ⅱ型膠原蛋白(collagen type Ⅱ，簡稱CⅡ)。Ⅱ型膠原蛋白，是由3條相同的α1(Ⅱ)鏈構(gòu)成的同型三聚體超螺旋結(jié)構(gòu)[12]，見圖1。人類Ⅱ型膠原蛋白的基因COL2A1位于12號染色體12q13.11位點上，全長約33 kb，由54個外顯子組成，所編碼的成熟α1肽鏈包含1 487個氨基酸。利用光鑷技術(shù)，發(fā)現(xiàn)在pH值呈中性的溶液中Ⅱ型膠原單分子的長度為295.8 nm，具有柔性，而非剛性[13]。

在軟骨結(jié)締組織中，Ⅱ型膠原蛋白最初是由軟骨細胞合成其前體形式即前Ⅱ型膠原，由于Ⅱ型膠原蛋白的編碼基因在不同階段會受到mRNA可變拼接的調(diào)控，主要集中于編碼N-端半胱氨酸富集區(qū)的外顯子2上，故前膠原形成3種不同形式，分別為ⅡA，ⅡD和ⅡB形式[14]，見圖2。前膠原ⅡA/D的N-端含有半胱氨酸富集區(qū)，而ⅡB形式則沒有。相對于ⅡA形式，ⅡD形式在N-端多一個色氨酸，由于ⅡD至今都沒有特定抗體，和ⅡA又沒有嚴格區(qū)分，故人們主要關(guān)注ⅡA，ⅡB形式的研究。在人體內(nèi)，ⅡA形式主要在胚胎外骨骼組織、前軟骨間質(zhì)和不成熟的軟骨細胞中表達，而ⅡB形式主要存在于成熟軟骨內(nèi)，因此ⅡA形式與ⅡB形式的轉(zhuǎn)換可作為監(jiān)測軟骨細胞分化的標志。然后，前膠原分泌到細胞外，經(jīng)細胞基質(zhì)中的ADAMTS(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs)-3和BMP(bone morphogenetic protein)-1分別將其N-端和C-端的前肽水解掉[15-16]，進而通過聚合、二硫鍵等共價交聯(lián)成膠原纖維，成為軟骨基質(zhì)的骨架。

圖2 Ⅱ型前膠原可變拼接ⅡA/D，ⅡB的結(jié)構(gòu)Fig.2 Structure of procollagen type Ⅱ A/D and B splice variants

Ⅱ型膠原蛋白自組裝形成的纖維直徑較細小，在軟骨中構(gòu)成纖細的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，更容易結(jié)合蛋白聚糖以及一些其他成分，賦予了軟骨良好的彈性、拉伸強度和減震特性，軟骨的大多數(shù)生理特征都依賴于Ⅱ型膠原蛋白網(wǎng)絡(luò)的完整性。成熟的Ⅱ型膠原蛋白不含色氨酸[17]，與另外2個成纖膠原蛋白Ⅰ型和Ⅲ型在氨基酸組成上也有一個主要區(qū)別，即Ⅱ型膠原蛋白中羥賴氨酸的含量是后兩者的2～4倍，且大部分羥賴氨酸都被糖基化[18]。

1.2 Ⅱ型膠原蛋白的理化性質(zhì)

目前，Ⅱ型膠原蛋白的生產(chǎn)主要是利用傳統(tǒng)提取法獲得，即選取不同種類的動物軟骨組織(例如豬、牛、魚等)，經(jīng)氯仿脫脂、鹽酸胍去多糖、胃蛋白酶消化等處理，然后經(jīng)過透析、離心濃縮等方法純化得到可溶的Ⅱ型膠原蛋白[9-20]。

盡管來源種類不同，但所得到的Ⅱ型膠原蛋白具有一些基本的物理化學(xué)性質(zhì)[21]。Ⅱ型膠原蛋白的主鏈主要為β-折疊、無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，不包含α-螺旋；甘氨酸殘基占氨基酸總數(shù)的30%左右，是羥脯氨酸含量的4～5倍；不含有色氨酸，且芳香族氨基酸含量較少；在220～230 nm近紫外區(qū)出現(xiàn)最大吸收峰；水解的α1肽鏈分子質(zhì)量均在110～130 kDa之間；變性溫度均在34 ℃以上，比較穩(wěn)定；是典型的纖維狀蛋白質(zhì)。

然而，對于不同物種、不同來源的Ⅱ型膠原蛋白，其DNA以及mRNA序列具有獨特性，表現(xiàn)為氨基酸的組成和比例上存在差異，也直接體現(xiàn)在Ⅱ型膠原蛋白的物化性質(zhì)上。例如，豬Ⅱ型膠原蛋白α1鏈的分子質(zhì)量為120 kDa[22-23]，而牛的則在130 kDa以上[24]。同是鯊魚，藍鯊的軟骨Ⅱ型膠原蛋白，分子質(zhì)量為130 kDa，在226 nm處有最大紫外吸收峰，變性溫度為41 ℃[25]，而斑竹鯊的Ⅱ型膠原蛋白分子質(zhì)量約為116 kDa，變性溫度為34.56 ℃[26]。甚至來自不同組織(如雞胸和雞胸箭突軟骨)的Ⅱ型膠原蛋白，前者分子質(zhì)量為110 kDa，最大紫外吸收峰在220 nm處，變性溫度為44 ℃[27]，而后者則為120 kDa，最大吸收峰在230 nm處[28]。從Ⅱ型膠原蛋白的變性溫度也可推測海洋生物要明顯低于陸地生物，而不同生長環(huán)境的海洋生物變性溫度也有差異。所有這些均充分體現(xiàn)了不同生物甚至不同組織間Ⅱ型膠原蛋白的獨特性，推測Ⅱ型膠原蛋白的理化性質(zhì)與其生物本身的生活環(huán)境很可能息息相關(guān)[21]。

2 Ⅱ型膠原蛋白的生物學(xué)功能及應(yīng)用

2.1 Ⅱ型膠原蛋白的生物學(xué)功能

Ⅱ型膠原蛋白除了具備膠原蛋白基本的生物學(xué)功能，如止血性能、生物相容性、生物可降解性、低免疫原性等，它還具備一些獨特的生物學(xué)功能。

1) 維持軟骨組織的完整性 在軟骨形成和生長成熟過程中，軟骨細胞主要分泌蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白。因此，Ⅱ型膠原蛋白是透明軟骨細胞外基質(zhì)中表達最豐富的蛋白質(zhì)，同時也是軟骨細胞表達的特征性蛋白[29]。Ⅱ型膠原蛋白形成的網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)，可以和蛋白聚糖以及其他成分緊密結(jié)合，維持基質(zhì)成分平衡，使關(guān)節(jié)可以靈活運動且具有減震特性和彈性。

2) 刺激軟骨細胞生長和再分化 ANNAMALAI等[30]采用瓊脂糖混合Ⅱ型膠原蛋白的微體系能明顯激活人骨髓間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞的分化，并且Ⅱ型膠原蛋白的加入可促進軟骨細胞的增殖。同時蔣萍等[29]發(fā)現(xiàn)Ⅱ型膠原蛋白還可以延長去分化現(xiàn)象出現(xiàn)的時間，有利于細胞再分化。

3) 誘導(dǎo)免疫耐受 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種自身免疫性疾病，而Ⅱ型膠原蛋白是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎最主要的自身抗原之一[31-32]，以適宜濃度的Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)人體免疫耐受，可預(yù)防或緩解類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病癥。LUGO等[33]將未變性的雞Ⅱ型膠原蛋白對膝關(guān)節(jié)炎患者給藥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ⅱ型膠原蛋白可使患者癥狀明顯改善，且耐受性良好。

2.2 Ⅱ型膠原蛋白的應(yīng)用

在臨床醫(yī)學(xué)上，由于軟骨組織的自愈能力極低，一旦發(fā)生損傷或病變，必須進行修復(fù)甚至替換。但是軟骨的修復(fù)和再生始終是骨科上的一大難題[12]?；冖蛐湍z原蛋白的生物相容性、可降解性、低免疫原性，以及可促進軟骨細胞的生長和再分化等能力，Ⅱ型膠原蛋白成為軟骨組織工程中極具潛力的支架材料。許多學(xué)者紛紛利用Ⅱ型膠原蛋白或者與其他成分(例如透明質(zhì)酸等)按一定比例結(jié)合，構(gòu)建成支架或者水凝膠，這為臨床上軟骨缺損修復(fù)奠定了實驗基礎(chǔ)[34-35]。

在醫(yī)藥方面，由于Ⅱ型膠原蛋白可以誘導(dǎo)人體免疫耐受，口服或經(jīng)鼻給藥Ⅱ型膠原蛋白，會使患者的關(guān)節(jié)炎癥狀明顯改善[36]。故Ⅱ型膠原蛋白可以作為疫苗預(yù)防關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[37]，并且補給來自同物種Ⅱ型膠原蛋白的治療效果最佳[18]。雖然目前的研究仍停留在實驗室階段，相信不久的將來，隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，Ⅱ型膠原蛋白的療效將進一步提升。

此外，Ⅱ型膠原蛋白可以作為澄清劑、乳化劑、發(fā)泡劑等應(yīng)用于食品領(lǐng)域，可以添加到洗發(fā)水、唇膏等日化品中，還可以作為微型膠囊、片劑包衣等應(yīng)用在制藥行業(yè)[12]。

3 重組Ⅱ型膠原蛋白的研究進展

隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，傳統(tǒng)提取法根本無法滿足市場需求，利用基因重組表達外源蛋白成為目前的研究熱點。重組人膠原蛋白是通過生物工程技術(shù)將人膠原蛋白的一段cDNA或重新優(yōu)化設(shè)計合成的一段基因序列，構(gòu)建到表達載體進而在宿主細胞內(nèi)經(jīng)誘導(dǎo)表達出的具有人膠原蛋白特征的高分子蛋白質(zhì)[38]。作為一種新型材料，除了具有動物膠原蛋白的基本生物特性外，還具有可加工、無病毒隱患、變性溫度高、酸堿度呈中性等優(yōu)勢，具有極其廣闊的應(yīng)用前景。目前，已廣泛應(yīng)用在止血材料以及人造骨頭、人造皮膚和血管支架等人造生物材料上[39]。

早在1991年，ALAKOKKO等[40]就在小鼠3T3細胞中表達出人軟骨Ⅱ型前膠原蛋白。1998年，NOKELAINEN等[18]利用桿狀病毒系統(tǒng)將分別含有人Ⅱ型前膠原α鏈基因和脯氨酸-4-羥化酶α，β亞基基因的2個病毒共轉(zhuǎn)染，在昆蟲細胞內(nèi)成功生產(chǎn)出具有穩(wěn)定三螺旋結(jié)構(gòu)的軟骨特異性Ⅱ型膠原蛋白。2000年，MYLLYHARJU等[41]利用甲基畢赤酵母，將人Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ型膠原蛋白與脯氨酸-4-羥化酶α，β亞基共表達，獲得全長且具有穩(wěn)定三螺旋結(jié)構(gòu)的人Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ型膠原蛋白。事實上，將膠原蛋白基因與脯氨酸羥化酶在宿主細胞內(nèi)共表達，可顯著促進膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)的形成。相對于漢遜酵母，將目的膠原的自身信號序列用釀酒酵母α-交配因子取代后，在畢赤酵母中的表達量約是前者的5倍，故大多選用畢赤酵母作為宿主細胞[42]。

然而，由于動物細胞、昆蟲細胞的培養(yǎng)難度大，成本高，周期長，目前只限于實驗室規(guī)模[43]。而使用酵母生產(chǎn)重組膠原蛋白，產(chǎn)量也相對比較低，無法滿足市場的大量需求。所以人們開始轉(zhuǎn)向利用原核生物表達系統(tǒng)來生產(chǎn)重組類人膠原蛋白。

在國內(nèi)，研究重組Ⅱ型膠原蛋白較為深入的是西北大學(xué)的范代娣等[44-46]，他們利用PCR技術(shù)體外擴增獲得數(shù)段人Ⅱ型膠原蛋白的基因片段，進行拼接重復(fù)后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，成功生產(chǎn)出重組類人Ⅱ型膠原蛋白肽，經(jīng)過發(fā)酵優(yōu)化，通過補料分批培養(yǎng)，蛋白產(chǎn)量(質(zhì)量濃度)可達10.8 g/L。

然而，由于膠原蛋白的正確折疊至少得需要8個翻譯后修飾酶的加工處理，大腸桿菌則缺乏相應(yīng)的修飾酶，故至今在大腸桿菌表達系統(tǒng)中無法獲得全長且具有穩(wěn)定三螺旋結(jié)構(gòu)的膠原蛋白。

4 展 望

近年來，國內(nèi)外市場對膠原蛋白的需求日益增加，但是由于動物膠原蛋白在性能和來源方面的固有缺陷，如因剛性強而難以再加工、異體排斥反應(yīng)明顯，以及存在病毒、傳染病等安全隱患，直接限制了其開發(fā)利用。而重組類人膠原蛋白彌補了動物膠原蛋白的諸多缺陷，重組類人Ⅱ型膠原蛋白的開發(fā)會給組織工程、醫(yī)藥領(lǐng)域帶來極大的影響，其應(yīng)用前景極其廣闊。

目前，由于大腸桿菌遺傳背景極其清楚，且具有遺傳穩(wěn)定、易于人工改造、生長周期短、繁殖能力強、生產(chǎn)成本低、易于大規(guī)模培養(yǎng)、可調(diào)控性強，以及下游蛋白提取工藝簡單、易于操作等諸多優(yōu)勢，以大腸桿菌E.coli為代表的原核表達體系已成為表達外源蛋白的首選，“安全的基因工程表達系統(tǒng)”已獲得美國FDA批準。

盡管Ⅱ型膠原蛋白的基因序列較為復(fù)雜、空間構(gòu)型獨特，且原核細胞缺乏相應(yīng)的修飾酶類等諸多因素影響，限制了重組膠原蛋白在原核系統(tǒng)中的大規(guī)模生產(chǎn)。隨著2014年，RUTSCHMANN等[47]將人Ⅲ型膠原蛋白基因與巨病毒的脯氨酰和賴氨酰羥化酶基因在大腸桿菌中實現(xiàn)重組轉(zhuǎn)化并共表達，生產(chǎn)出的90mg/L重組膠原蛋白可實現(xiàn)羥基化，且羥基化水平可與天然膠原相媲美，其三螺旋結(jié)構(gòu)類似于天然膠原。這種通過大型巨病毒編碼的脯氨酰、賴氨酸羥化酶在原核生物內(nèi)的共表達揭示了一種生產(chǎn)羥基化膠原蛋白的新方法。這為利用大腸桿菌系統(tǒng)生產(chǎn)羥基化類人Ⅱ型膠原蛋白提供了實驗依據(jù)。

在大腸桿菌中，如果能夠?qū)崿F(xiàn)重組膠原蛋白的過表達以及脯氨酰、賴氨酰的羥基化，大規(guī)模生產(chǎn)重組羥基化膠原蛋白將指日可待。而且隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，具有天然膠原機械性能和結(jié)構(gòu)性質(zhì)的重組膠原蛋白，將更為廣泛地應(yīng)用在社會各個領(lǐng)域，服務(wù)于人類。

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Structure, function and latest research development of collagen of type Ⅱ

ZHOU Xiaohui, CHANG Yanan, HE Xiaoliang, ZHANG Jinhong

(School of Bioscience and Bioengineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang, Hebei 050018, China)

Collagen of type Ⅱ is the major component of hyaline cartilage in animals. Based on its biocompatibility, biodegradability and many other biological properties, for example promoting cell growth and differentiation, collagen of type Ⅱ has been widely applied in various fields, such as tissue engineering material, food, cosmetic, packaging, etc.. In recent years, using genetic engineering to produce recombinant collagen of type Ⅱ is popular. The structure, function and application of collagen of type Ⅱ are described, the latest research progress for producing recombinant collagen of type Ⅱ by genetic engineering is put forward, and the large-scale production of hydroxylated collagen inE.coliin the future is previewed, which would be helpful for the further development and study of collagen of type Ⅱ.

protein engineering; collagen of type Ⅱ; hyaline cartilage; tissue engineering; gene recombination

1008-1542(2017)02-0202-07

10.7535/hbkd.2017yx02016

2016-09-23；

2016-12-16；責(zé)任編輯：王海云

河北省“百人計劃”資助項目(E2012100005)；教育部留學(xué)回國人員科研啟動基金(4720131792)

周曉輝(1975—)，女, 黑龍江齊齊哈爾人，教授，博士，主要從事蛋白質(zhì)工程方面的研究。

E-mail：zhouxh2003@aliyun.com

Q816

A

周曉輝，常亞南，何曉亮，等.Ⅱ型膠原蛋白的結(jié)構(gòu)、功能及其最新研究進展[J].河北科技大學(xué)學(xué)報,2017,38(2):202-208.

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