去氧腎上腺素介導的孕期母體高鹽飲食對子代腎血管功能影響的研究

仲 元，王 娟，施林領(lǐng)，徐智策，茅彩萍

(蘇州大學附屬第一醫(yī)院生殖醫(yī)學中心&胎兒醫(yī)學研究所，江蘇 蘇州 215006)

去氧腎上腺素介導的孕期母體高鹽飲食對子代腎血管功能影響的研究

仲 元，王 娟，施林領(lǐng)，徐智策，茅彩萍

(蘇州大學附屬第一醫(yī)院生殖醫(yī)學中心&胎兒醫(yī)學研究所，江蘇 蘇州 215006)

目的 探討母體高鹽飲食對子代腎臟血管發(fā)育的影響及其相應機制。方法 自然懷孕的Sprague-Dawley大鼠隨機分為高鹽組和對照組，高鹽組孕鼠懷孕期間給予含8%NaCl的高鹽飼料，對照組給予含1% NaCl的正常飼料，兩組孕鼠均正常飲水。子代出生后，所有母鼠恢復正常飼料，新生鼠正常哺乳至1個月分籠。取成年子代公鼠腎臟葉間動脈進行血管功能檢測、單個血管平滑肌(vascular smooth muscle cell, VSMC)細胞電生理實驗。結(jié)果 高鹽組子代腎臟小動脈對去氧腎上腺素(phenylephrine,Phe)引起的收縮反應強于對照組(P<0.05)，蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)非選擇性阻斷劑GF109203X對Phe收縮反應的作用兩組間差異也有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；電生理實驗結(jié)果顯示：Phe在兩組子代腎臟小血管VSMC中，均可抑制大電導鈣激活性鉀通道(high-conductance Ca2+-activated K+channel, BK通道)電流，但在高鹽組的作用更為明顯(P<0.05)，GF109203X的存在使BK電流在Phe作用前后差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)論 孕期高鹽飲食可能通過改變Phe介導的成年♂性子代腎臟小動脈血管收縮的敏感性、PKC對BK通道的調(diào)控作用，從而影響其腎臟血管功能的發(fā)育，并可能由此增加其子代腎臟疾病發(fā)生的易感性。

孕期；高鹽飲食；子代；去氧腎上腺素；腎血管發(fā)育和功能；鉀離子通道

胚胎期是人類初始發(fā)育過程中最關(guān)鍵而敏感的時期，胎兒在母體子宮內(nèi)的時間約占整個妊娠期(從受精到分娩)的75%。近年來，大量研究表明孕期多種不良因素(包括體內(nèi)、外環(huán)境)均會對胎兒的生長發(fā)育造成影響，誘發(fā)機體組織結(jié)構(gòu)、代謝功能等出現(xiàn)可逆或永久性損傷，進而可能導致出生后個體罹患某些疾病的易感性增加[1-2]。英國Barker教授在20世紀初期首次提出了胎源性疾病理論[3]：成年期的某些疾病可能起源于胚胎期，即宮內(nèi)胎兒可因孕期不良環(huán)境的影響“種下”病根，并在出生后或成年時期表現(xiàn)出對某種疾病的易感性，即產(chǎn)生“印跡”效應。

世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦成人正常食鹽攝入量為3～5 g每天。由于中國膳食特點，流行病學調(diào)查顯示我國居民日常飲食中食鹽的攝入量普遍偏高，北方部分地區(qū)甚至達到14～20 g每天，已屬高鹽攝入范疇。健康機體調(diào)節(jié)自身水、電解質(zhì)平衡是有一定限度的。鹽的過量攝入可能會通過影響體液中電解質(zhì)濃度及血漿滲透壓水平等，誘發(fā)心血管和腎臟等組織器官功能損傷，引起循環(huán)血容量擴增、血壓升高等病理生理改變，最終導致機體的主要臟器及內(nèi)分泌系統(tǒng)功能的失衡[4]。大量鹽的攝入對腎臟血流動力學、腎臟功能乃至組織結(jié)構(gòu)均有影響[5]。既往研究報道了孕期母體過量攝鹽后，胎兒的攝(排)Na+量、醛固酮水平均可發(fā)生相應的改變[6]，且母體孕期高鹽飲食出生的子代血漿腎素活性明顯降低[7]。眾所周知，腎臟是機體維持和調(diào)控水、電解質(zhì)平衡的最重要器官之一。其中，腎臟小動脈發(fā)揮了重要的作用。腎臟血管(包括葉間動脈和腎動脈)的重塑，不僅對體液平衡調(diào)控有重大影響，而且與腎性高血壓的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。盡管現(xiàn)有研究已經(jīng)顯示孕期母體高鹽飲食對胎兒體液調(diào)節(jié)的相關(guān)因子有一定影響[6]，但對胎腎發(fā)育尤其是對腎臟血管功能的影響卻鮮有報道。因此本實驗將以此為切入點，研究孕期母體高鹽飲食對子代腎臟小動脈功能的影響及相關(guān)機制，進一步探討腎臟疾病的胎源性起源。

1 材料

1.1 動物 由蘇州大學實驗動物中心提供的清潔級Sprague-Dawley大鼠，使用許可證號為SYXK(蘇)2012-0045。♀♂大鼠性成熟后，于每晚6:00點以1 ∶1合籠，次日9：00～11：00收集陰道涂片，以觀察到精子視為妊娠d 1，并將♂鼠與其分籠。將孕鼠隨機分為實驗組及對照組，每組10只。實驗組在妊娠期d 1～21給予高鹽鼠糧(8% NaCl)，對照組標準鼠糧(1% NaCl)喂養(yǎng)，兩組均自由飲水，自然分娩。妊娠期其它時間及哺乳期兩組均給予標準鼠糧和水。子代大鼠于1月齡時♀♂分籠。待實驗組和對照組子代生長至成年(18～20周時)，取♂鼠用于實驗。

1.2 藥物與儀器 KCl、Phenylephrine、Acetylcholine、IBXT、GF109203X均購自美國Sigma公司；一抗腎上腺素α1受體(AR-α1)購自美國Santa Cruz公司；一抗β-actin、二抗山羊抗兔IgG購自碧云天；Myograph微血管張力檢測系統(tǒng)購自丹麥DMT公司；Axon膜片鉗700B型購自美國Axon Instruments公司；UVP生物成像系統(tǒng)購自上海斯高勒生物科技有限公司。

2 方法

2.1 血管功能檢測 ♂大鼠麻醉后打開腹腔取出腎臟，迅速置于4℃已預飽和的HEPES緩沖液中，顯微鏡下快速分離出腎臟葉間動脈(直徑100～200 μm)，并立即將血管移至DMT浴槽中，讀出血管最佳預張力下的長度(IC1值，此時的血管張力等效于其在體時的狀態(tài))，然后將血管牽張長度調(diào)整于此。穩(wěn)定30 min后，以60 mol·L-1KCl刺激血管收縮3次，當收縮反應穩(wěn)定后，記錄并計算血管的平均收縮強度。穩(wěn)定于基線張力的微血管，以1 μmol·L-1的Phe預收縮達到平臺后，即以10 μmol·L-1的乙酰膽堿使血管舒張，若舒張幅度>60%的1 μmol·L-1Phe的血管收縮強度，則認為血管內(nèi)皮是完整的。隨后分別檢測腎臟葉間動脈對Phe(0.01～100 μmol·L-1)的反應，以及在PKC非選擇性阻斷劑GF109203X(1 μmol·L-1)存在下血管對Phe(0.01～100 μmol·L-1)的反應。

2.2 電生理實驗 將分離好的腎臟葉間動脈在4℃預飽和的分離液中剪碎，靜置10 min，用配好的消化酶液置于37℃恒溫水槽中緩慢搖晃消化25 min，取出用0℃的分離液終止消化，靜置10 min，最后用吸管輕柔吹打消化的血管2～3 min，過濾懸液，顯微鏡下觀察到長梭形的即為血管平滑肌細胞。懸液置于4℃冰箱內(nèi)4～6 h可保持良好活性，可用于膜片鉗實驗。全細胞模式形成后，在電壓鉗模式下，將細胞膜鉗制電壓調(diào)至-70 mV，測試電壓從-60 mV去極化至+60 mV，步階10 mV，時程500 ms，刺激間隔10～15 s，記錄各刺激電壓下的電流。當記錄到穩(wěn)定電流5 min后，分別孵育IBTX(0.1 μmol·L-1)、Phe(10 μmol·L-1)或GF109203X(1 μmol·L-1)。最終，數(shù)據(jù)導出后以電流(I)密度對電壓(V)做圖，即I-V曲線。

2.3 Western blot試驗 取大鼠腎葉間動脈液氮中研磨，與裂解液充分混勻后冰上靜置15 min， 4℃離心(3 500×g)30 min，吸上清液按Bradford法計算蛋白質(zhì)濃度。取70 μg總蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后按抗體說明書比例加入稀釋的AR-α1一抗，4℃孵育過夜，洗膜后加入按說明書比例稀釋的二抗，室溫孵育1～2 h后TBST充分漂洗。將ECL顯色液滴在PVDF膜上，UVP生物成像系統(tǒng)(上海斯高勒生物科技有限公司，上海)曝光條帶并分析灰度值。以β-actin單克隆抗體作為內(nèi)參照，方法同上。目的蛋白相對表達量以目的蛋白灰度值/β-actin灰度值表示。每組標本重復檢測3次，取平均值。

3 結(jié)果

3.1 腎血管組織學改變 與對照組相比，高鹽組腎臟葉間動脈血管壁組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯異常。表現(xiàn)為血管內(nèi)膜欠光滑，局部內(nèi)皮細胞缺失，中膜平滑肌層菲薄、排列紊亂以及外膜彈性纖維、膠原纖維等結(jié)締組織稀疏、斷裂。見Fig 1。

Fig 1 HE staning of renal interlobar arteries

Up:20×,Down:40×;Left:Control group, Right: High salt group

3.2 Phe介導的腎血管收縮效應 Phe引起收縮量效曲線的Emax兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但高鹽子代腎血管收縮量效曲線的EC50明顯小于對照組子代(P<0.01)。見Fig 2。

3.3 GF109203X在Phe介導的血管收縮中的調(diào)控作用 在GF109203X作用下，Phe引起的血管收縮量效曲線的EC50在兩組中均有所減小，但高鹽組減小的程度比對照組更明顯。EC50減小的差值(ΔEC50)在兩組間差異也有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見Fig 3。

3.4 Phe對子代腎臟小血管VSMC中BK電流的作用 在全細胞記錄模式下，分別記錄加入BK通道特異性阻斷劑IBTX前后的全鉀電流，可得到BK電流。在此基礎上再分別記錄加入Phe前后的電流，可觀察到Phe對兩組子代腎臟小動脈VSMC的BK電流均有抑制作用，但在高鹽組中的抑制作用更為明顯(P<0.05)。見Fig 4。

Fig 2 Contraction response of renal interlobar arteries to Phe

High salt groupvsControl group,**P<0.01

Aftervsbefore,*P<0.05,**P<0.01

3.5 GF109203X在Phe抑制BK電流作用中的調(diào)控作用 預先孵育了PKC抑制劑GF109203X后，用上述同樣的方法分別記錄加入IBTX和Phe前后的電流。Fig 5結(jié)果顯示，無論在高鹽組還是對照組，孵育GF109203X時得到的BK電流與再加入Phe后得到的BK電流相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。由此結(jié)果提示，PKC抑制劑可能會影響Phe對BK電流的抑制作用。

Fig 4 Inhibition of Phe to BK current in VSMC

Aftervsbefore,*P<0.05

3.6 腎血管AR-α1受體蛋白表達 Fig 6結(jié)果顯示，高鹽組與對照組腎血管AR-α1受體蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

4 討論

近年研究表明，出生缺陷除了與傳統(tǒng)意義上的“遺傳”有關(guān)之外，還與孕期環(huán)境的影響密切相關(guān)[2]。大量研究已證實孕期不良環(huán)境因素(如：吸煙、缺氧、高糖飲食等)與諸多成人慢性疾病的發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性，即胎源性疾病的“印跡”效應[3]。本研究著眼于探討孕期母體高鹽飲食對子代腎臟小動脈發(fā)育和功能的影響及其機制。研究發(fā)現(xiàn)孕期母體高鹽飲食會引起：① 子代腎臟小動脈組織結(jié)構(gòu)異常；② 子代腎臟小動脈對Phe引起的血管收縮的敏感性增加，且與PKC對BK通道調(diào)節(jié)作用的改變有關(guān)。

腎臟葉間動脈作為腎臟阻力血管，在體液的調(diào)節(jié)中起重要作用。臨床上常以其阻力指數(shù)作為評價腎臟血管損傷(如腎動脈狹窄、腎血管血栓形成等)的輔助診斷標準[8-9]。因此本文選用腎臟葉間動脈作為研究對象。在組織學研究中，高鹽組子代腎血管相比對照組出現(xiàn)明顯血管壁各層結(jié)構(gòu)異常，提示其相關(guān)的血管功能可能發(fā)生一定變化。在血管功能實驗中，孕期母體高鹽飲食后其子代對Phe引起的收縮反應更敏感。與對照組相比，高鹽組子代腎臟血管在更低濃度的Phe作用下即能發(fā)生收縮反應，但在收縮量效曲線中，Phe引起的最大收縮張力在兩組并無統(tǒng)計學差異，這與本實驗室近期研究結(jié)果相符[10]。AR-α1是Phe發(fā)揮藥理作用的特異型受體，蛋白印記實驗顯示，兩組AR-α1的蛋白表達量無明顯差異。而EC50的明顯改變提示AR-α1受體下游信號通路可能發(fā)生了相關(guān)變化，因此我們展開了進一步研究。

Fig 5 Regulation of GF109203X in inhibition effect of Phe to BK currents

血管張力在調(diào)節(jié)血管阻力和血流量中起關(guān)鍵作用，而鉀離子通道活性的改變能夠直接影響血管張力。鉀離子通道是機體內(nèi)分布最廣泛、具有重要生理功能的離子通道。當鉀離子通道被抑制時，細胞膜發(fā)生去極化，進而促使電壓依賴性鈣通道開放，細胞內(nèi)鈣離子增加，導致血管收縮。反之，當鉀離子通道被激活時，細胞膜靜息電位會出現(xiàn)超極化并進一步導致血管舒張。此外，鉀離子通道的開放還可促進VSMC動作電位的復極，起到穩(wěn)定細胞膜的作用。因此，鉀離子通道不但是調(diào)節(jié)VSMC靜息膜電位的關(guān)鍵因素，且在穩(wěn)定血管張力和血壓的過程中也有著不可忽視的作用。大量研究表明，許多心血管疾病如高血壓、動脈粥樣硬化，內(nèi)分泌疾病如糖尿病等的發(fā)生發(fā)展與鉀通道功能的改變有著密切的聯(lián)系[10-11]。目前已知的VSMC鉀離子通道主要有4種：大電導鈣激活性鉀通道(high-conductance Ca2+-activated K+channel, BK通道)、電壓依賴性鉀通道(voltage-dependent K+channel, KV通道)、ATP敏感的鉀通道(ATP-sensitive K+channel, KATP通道)以及內(nèi)向整流性鉀通道(inward rectifying K+channel, Kir通道)。其中BK通道在VSMC上有著廣泛的表達[12-13]，可通過調(diào)控血管(尤其是小動脈)的肌源性張力，直接影響器官或組織的血流動力學。本研究結(jié)果表明Phe對BK電流有抑制作用，且抑制幅度在高鹽組和對照組中差異有統(tǒng)計學意義。該結(jié)果提示：Phe在離體血管功能研究中引起兩組不同強度的血管收縮反應可能與Phe對兩組VSMC上的BK電流抑制作用不同有關(guān)。PKC是參與細胞功能調(diào)節(jié)的一類蛋白激酶，主要與平滑肌的生長和收縮有關(guān)。研究表明PKC對不同類型鉀通道具有不同調(diào)節(jié)作用[14]，而PKC的激活會抑制BK通道的開放。本文中，PKC通路非選擇性阻斷劑GF109203X在Phe介導的收縮反應中兩組間作用效應不同，提示PKC可能參與了Phe對BK的調(diào)節(jié)。電生理實驗的結(jié)果進一步驗證了該種假設，阻斷PKC通路后Phe對BK的抑制作用基本被消除。綜合以上結(jié)果可以表明，Phe在高鹽組與對照組子代腎臟小動脈引起的血管收縮反應的差異，是由于Phe對兩組動脈平滑肌細胞上BK的不同抑制作用導致的，且這一作用與PKC通路的調(diào)節(jié)相關(guān)。

Fig 6 Protein expression of AR-α1in renal interlobar arteries

綜上所述，本研究顯示孕期母體高鹽飲食可對其成年♂子代的腎臟小動脈的發(fā)育產(chǎn)生“印跡”效應，表現(xiàn)為腎臟小動脈組織結(jié)構(gòu)異常、對血管活性物質(zhì)收縮效應以及VSMC電生理行為改變等。這些結(jié)構(gòu)和功能的異常變化可能會增加子代某些心、腦血管疾病和腎臟疾病的發(fā)生風險。本文的研究結(jié)果不僅進一步驗證并豐富了胎源性疾病的“印跡”機理，并且為相關(guān)的發(fā)育源性血管、腎臟疾病的早期預防、治療以及藥物靶點的選取提供了重要實驗信息和理論依據(jù)，同時也為圍產(chǎn)期營養(yǎng)保健提供了一定的科學指導。

(致謝：本文實驗主要在蘇州大學附屬第一醫(yī)院胎兒醫(yī)學研究所內(nèi)完成，在此對實驗室內(nèi)各位老師、同學對本實驗的指導和幫助表示衷心的感謝！)

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Effect of response to phenylephrine-mediated signal pathway in renal arteries of offspring rats induced by maternal high-salt diet

ZHONG Yuan,WANG Juan,SHI Lin-ling,XU Zhi-ce, MAO Cai-ping

(ReproductiveMedicineCenter&FetalMedicineCenter,theFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,SuzhouJiangsu215006，China)

Aim To study the effect of high salt diet during pregnancy on the development of renal vessels in offspring rats and its mechanism.Methods Natural pregnant Sprague-Dawley rats were randomly divided into high-salt group and control group. The pregnant rats in the high-salt group were given high-salt diet of 8% NaCl content , while the control group normal diet with 1% NaCl content. In both groups, pregnant rats were given normal drinking water. After delivery, all mothers returned to normal diet and all neonatal rats were breast-fed until one month old. The adult male off springs were used as experimental animals. The vessel tone of renal interlobar arteries and electrophysiological behavior of single vascular smooth muscle cells (VSMCs) were detected respectively.Results The contractile response of renal arteries to phenylephrine(Phe) in high-salt group was stronger than that in the control group(P<0.05).The effect of protein kinase C(PKC) non selective blocker GF109203X on Phe-induced contraction in two groups also showed significant difference(P<0.05). In electrophysiology experiments, Phe inhibited high-conductance Ca2+-activated K+channel(BK channel) currents in renal arteriolar smooth muscle cells in two groups, and the inhibitory effect was more pronounced in high-salt offsprings (P<0.05).GF109203X could eliminate the response of Phe on BK currents in both groups(P>0.05).Conclusions High-salt diet during pregnancy could increase the sensitivity of renal interlobar arterial contractile response to Phe in adult male offsprings, which is associated with PKC-mediated BK channels pathway. Maternal high-salt diet during pregnancy may increase the risk of renal vascular diseases in adult offsprings.

pregnancy; high-salt diet; offspring; phenylephrine; development and function of renal vessels；potassium channels

時間：2017-3-13 8:38

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170324.1247.020.html

2016-12-17，

2017-02-15

國家自然科學基金資助項目(No 81370719);江蘇省社會發(fā)展項目(No BE2015642)；江蘇省醫(yī)學重點人才項目

仲 元(1990-)，女，碩士生，研究方向：胎兒醫(yī)學與生殖醫(yī)學，E-mail：yzhong@stu.suda.edu.cn； 茅彩萍(1968-)，女，博士，教授，博士生導師，通訊作者，研究方向：胎兒醫(yī)學與生殖醫(yī)學，E-mail：maocaiping@suda.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.04.010

A

1001-1978(2017)04-0492-06

R-332；R151.1；R322.12；R322.61；R331.32；R715.3；R971.93