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      枇杷葉熊果酸對大鼠肝星狀細(xì)胞增殖抑制作用及對PPAR-γ、TGF-β1 表達(dá)的影響

      2017-04-14 02:27:58張揚武羅偉生譚全肖王仕衍禤傳鳳
      中國藥理學(xué)通報 2017年4期
      關(guān)鍵詞:枇杷葉果酸高濃度

      張揚武,羅偉生,陳 姍,黃 瑞,譚全肖,王仕衍,張 夏,禤傳鳳

      (廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院脾胃科,廣西 南寧 530001)

      枇杷葉熊果酸對大鼠肝星狀細(xì)胞增殖抑制作用及對PPAR-γ、TGF-β1 表達(dá)的影響

      張揚武,羅偉生,陳 姍,黃 瑞,譚全肖,王仕衍,張 夏,禤傳鳳

      (廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院脾胃科,廣西 南寧 530001)

      目的 研究枇杷葉熊果酸對大鼠肝星狀細(xì)胞增殖的抑制作用及對PPAR-γ、TGF-β1表達(dá)的影響,探討枇杷葉熊果酸抗肝纖維化的可能作用機制。方法 體外培養(yǎng)HSC-T6細(xì)胞,隨機分為空白組,羅格列酮對照組,枇杷葉熊果酸低、中、高濃度組,分別干預(yù)24、48、72 h后,運用CCK-8法檢測各組細(xì)胞的增殖情況;ELISA法檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的Ⅰ型膠原蛋白含量;Real-time PCR法檢測各組PPAR-γ、TGF-β1 mRNA的表達(dá);免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測各組PPAR-γ、TGF-β1蛋白的表達(dá)。結(jié)果 CCK-8結(jié)果顯示,隨著熊果酸作用時間的延長,藥物對細(xì)胞的增殖的抑制率增高(P<0.01);ELISA結(jié)果顯示,隨著熊果酸藥物濃度的增加,上清中的Ⅰ型膠原蛋白含量下降(P<0.01);Real-time PCR結(jié)果顯示,隨著熊果酸藥物濃度增加,PPAR-γ mRNA的表達(dá)量增加,TGF-β1 mRNA的表達(dá)量下降(P<0.01);免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示,隨著熊果酸藥物濃度增加,PPAR-γ 蛋白的表達(dá)增強,TGF-β1 蛋白的表達(dá)減弱(P<0.01)。以上作用具有劑量-效應(yīng)關(guān)系,高濃度組作用較對照組強。結(jié)論 枇杷葉熊果酸能夠抑制HSC-T6細(xì)胞增殖,降低細(xì)胞外基質(zhì)分泌,該機制可能與上調(diào)PPAR-γ 表達(dá),下調(diào)TGF-β1表達(dá)有關(guān)。

      枇杷葉熊果酸;肝星狀細(xì)胞;肝纖維化;膠原;細(xì)胞外基質(zhì);細(xì)胞因子

      肝纖維化是由于多種致病因素形成的慢性肝實質(zhì)炎癥、壞死導(dǎo)致肝臟纖維結(jié)締組織的過度沉積、異常增生的一種慢性肝臟疾病。肝纖維化的進(jìn)程中,肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)的活化和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的分泌起著關(guān)鍵作用。熊果酸(ursolic acid,UA)是枇杷葉的功能物質(zhì)之一,而且相對其它含有UA的中草藥含量豐富。前期研究表明[1],UA具有降低轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的mRNA及蛋白表達(dá),抑制TGF-β1與其受體的結(jié)合[2],誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞凋亡并降低Bcl2/Bax比值,激活天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate-specific proteinase-3,Caspase-3)相關(guān)蛋白[3]的作用。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ ,PPAR-γ)是存在于HSC里的一種配體激活轉(zhuǎn)錄因子。PPAR-γ通過阻斷TGF-β1/TβR-Ⅰ信號,抑制Smad磷酸化,進(jìn)一步抑制Smad靶基因的轉(zhuǎn)錄,從而抑制ECM生成[4]。UA是否也可通過激活PPAR-γ而抑制TGF-β1及其信號通路下游因子的表達(dá)而發(fā)揮抗肝纖維化的作用?因此,本實驗通過體外培養(yǎng)HSC-T6細(xì)胞,運用CCK-8法檢測UA對HSC-T6細(xì)胞的增殖情況,ELISA法檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的(Collagen Ⅰ,Col Ⅰ)含量,Real-time PCR法檢測各組PPAR-γ、TGF-β1 mRNA的表達(dá),免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測各組PPAR-γ、TGF-β1蛋白的表達(dá),探討UA抗肝纖維化的可能作用機制。

      1 材料

      1.1 細(xì)胞系 HSC-T6細(xì)胞購自中國科學(xué)院昆明動物研究所細(xì)胞庫。

      1.2 藥物與試劑 枇杷葉熊果酸(批號:160623)購自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司;羅格列酮(批號:HY-17386)購自MCE上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司;FBS、DMEM高糖培養(yǎng)基購自加拿大維森特公司;CCK-8試劑盒購自日本Dojindo公司;Col-Ⅰ ELISA試劑盒購自基爾頓(上海)生物科技有限公司;總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒、PPAR-γ、TGF-β1、GAPDH內(nèi)參引物均購自寶生物工程 (大連) 有限公司;PPAR-γ、TGF-β1第一抗體購自美國Abcam公司;兔SP檢測試劑盒、DAB顯色劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

      1.3 主要儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱(371-184L,蘇州);低速離心機(DL-5M,湖南);恒溫水浴槽(SY-1220,美國);倒置顯微鏡(IX71,日本);生物安全柜(BSC-1600IIA2,蘇州);超微量紫外可見分光光度計(UV1901PC,上海);酶標(biāo)儀(Epoch Biotek,美國);實時熒光定量PCR儀(PIKOREAL,美國)。

      2 方法

      2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6運用10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基置于5% CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每3~4天傳代1次,取處于對數(shù)期生長期的細(xì)胞用于實驗。實驗分組為:空白組、羅格列酮對照組、UA低、中、高濃度組。

      2.2 CCK-8法檢測HSC-T6細(xì)胞增殖 取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞消化進(jìn)行細(xì)胞計數(shù),調(diào)整細(xì)胞密度為2×107·L-1,吹懸打勻后以每孔100 μL接種于96孔培養(yǎng)板,設(shè)置空白對照組(無藥培養(yǎng)基)、羅格列酮對照組[4](15 μmol·L-1羅格列酮) 、UA低濃度組(10 μmol·L-1UA)、UA中濃度組(25 μmol·L-1UA)、UA高濃度組(40 μmol·L-1UA),每組設(shè)定5個復(fù)孔。細(xì)胞接板24 h完全貼壁后棄去舊培養(yǎng)基,分別加入不同藥物的工作液,干預(yù)24、48、72 h后棄培養(yǎng)基,加入新的完全培養(yǎng)基后每孔加入10 μL的CCK-8溶液,置于37℃培養(yǎng)箱孵育1 h,多功能酶標(biāo)讀數(shù)儀上測定450 nm處的OD值。按以下公式計算不同藥物濃度對HSC-T6細(xì)胞的增殖抑制率:抑制率(IR)/%=[(空白對照組OD值-實驗組OD值)/(空白對照組OD值-空白孔OD值)]×100%,根據(jù)不同藥物濃度對細(xì)胞增殖的能力,選擇后續(xù)實驗藥物最佳作用時間。

      2.3 ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中Col-Ⅰ含量 取處于對數(shù)期細(xì)胞以10×107·L-1密度,每孔2.5 mL接種于6孔板中,每組設(shè)3個復(fù)孔,細(xì)胞貼壁后按CCK-8法中的各組藥物濃度干預(yù)細(xì)胞72 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。先在各小試管中稀釋標(biāo)準(zhǔn)品,然后設(shè)置空白孔、待測樣品孔進(jìn)行加樣,溫育30 min,用30倍濃縮液稀釋后進(jìn)行洗滌,每孔加入酶標(biāo)試劑后再進(jìn)行溫育30 min,重復(fù)洗滌后加入顯色劑顯色15 min,加入終止液終止反應(yīng),以空白孔調(diào)零于450 nm波長依次測量各孔的吸光度(OD值)。以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo),在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)樣品OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度。

      2.4 Real-time PCR法檢測細(xì)胞內(nèi)PPAR-γ、TGF-β1 mRNA的表達(dá) 細(xì)胞按10×107·L-1密度,每孔2.5 mL接種于6孔板中,每組設(shè)3個復(fù)孔,細(xì)胞貼壁后按CCK-8法中的各組藥物濃度干預(yù)72 h后TRIzol法提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ說明書進(jìn)行Real -time PCR檢測,以GAPDH引物為內(nèi)參。GAPDH上游5′-ATGGGAAGCTGGTCATCAAC-3′,GAPDH下游5′-GTGGTTCACACCCATCACAA-3′;PPAR-γ上游5′-CTGTTTTATGCTGTTATGGGT-3′;PPAR-γ下游5′-GTCAAAGGAATGGGAGTGGTC-3′;TGF-β1上游5′-CTGGGGCCCTGCCCCTACAT-3′,TGF-β1下游5′-CTTGGGCTTGCGACCCACGT-3′。兩步法反應(yīng)條件如下:95℃ 30 s;95℃ 5 s,60℃ 30 s,44個循環(huán)。讀取Ct值,以2-△△Ct表示目的基因mRNA的表達(dá)水平(-△△Ct計算公式:-△△Ct XY=Ct XY-Ct GAPDH Y-Ct X對照,其中X代表基因,Y代表處理因素)。

      2.5 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測細(xì)胞內(nèi)PPAR-γ、TGF-β1蛋白的表達(dá) 采用免疫組化SP法,將對數(shù)生長期的HSC-T6細(xì)胞接種于放有蓋玻片的6孔板中,每組設(shè)2個復(fù)孔,待細(xì)胞貼壁生長后,不同藥物分組干預(yù)。藥物與細(xì)胞共孵育72 h后,取出蓋玻片置于載玻片上,用4%多聚甲醛固定,3% H2O2消除內(nèi)源性過氧化氫酶,正常血清封閉后分別加入鼠抗人PPAR-γ、TGF-β1單克隆抗體,4℃孵育過夜,隨后加入生物素二抗工作液及辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液,經(jīng)DAB顯色,脫水、封片,光學(xué)顯微鏡下觀察。結(jié)果判讀:在每組的2 片細(xì)胞蓋玻片中隨機選取6個有意義的高倍鏡視野進(jìn)行觀察,可見細(xì)胞質(zhì)呈特異性棕褐色陽性染色,陽性表達(dá)率/%=(500個細(xì)胞內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)/500個細(xì)胞數(shù))×100%[5]。

      3 結(jié)果

      3.1 HSC-T6細(xì)胞的增殖情況 不同藥物濃度分別干預(yù)5組細(xì)胞24、48、72 h后CCK-8分析發(fā)現(xiàn),UA具有劑量-效應(yīng)關(guān)系抑制HSC-T6細(xì)胞的增殖,在72 h抑制率達(dá)到最大;與對照組比較,UA高濃度組抑制作用較強,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),中、低濃度組的抑制率較低(P<0.05)。后續(xù)實驗采用72 h干預(yù)時間。見Tab 1。

      3.2 各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液Col-Ⅰ含量比較 藥物干預(yù)細(xì)胞72 h后,與空白組比較,Col-Ⅰ含量明顯低于空白組(P<0.01);與對照組比較,UA高濃度組Col-Ⅰ含量低于對照組(P<0.01),低、中濃度組Col-Ⅰ含量高于對照組(P<0.01)。見Tab 2。

      Tab 1 Effect of different group on OD value of HSC-T6 cells(± s,n=5)

      *P<0.05,**P<0.01vsblank;#P<0.05,##P<0.01vscontrol

      Tab 2 Comparison of content of Col-Ⅰ in different groups(±s,n=3)

      **P<0.01vsblank;##P<0.01vscontrol

      3.3 各組細(xì)胞PPAR-γ、TGF-β1 mRNA的表達(dá)比較 藥物干預(yù)細(xì)胞72 h后,與空白組比較,藥物干預(yù)組中PPAR-γ mRNA的表達(dá)量均明顯增加(P<0.01),TGF-β1 mRNA的表達(dá)量均降低(P<0.05);與對照組比較,UA高濃度組PPAR-γ mRNA的表達(dá)量明顯高于對照組(P<0.01),低濃度組明顯低于對照組(P<0.01),中濃度組表達(dá)量低于對照組,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與對照組比較,UA低濃度組TGF-β1 mRNA的表達(dá)量明顯增加(P<0.01),UA中濃度組TGF-β1 mRNA的表達(dá)量增加,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),高濃度組表達(dá)量降低,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見Fig 1、Fig 2。

      3.4 各組細(xì)胞PPAR-γ、TGF-β1蛋白的表達(dá)差異 藥物干預(yù)72 h后,不同組別細(xì)胞中均出現(xiàn)棕褐色染色,與空白組比較,藥物干預(yù)組PPAR-γ蛋白的表達(dá)量均增加,TGF-β1蛋白的表達(dá)量均減少(P<0.01);與對照組比較,UA低、中濃度組PPAR-γ蛋白的表達(dá)量均低于對照組,UA高濃度組高于對照組(P<0.01);與對照組比較,UA低、中濃度組TGF-β1蛋白的表達(dá)量均高于對照組,UA高濃度組低于對照組(P<0.01)。見Tab 3、Fig 3、4。

      **P<0.01vsblank group;##P<0.01vscontrol group

      Fig 2 Comparison of TGF-β1 mRNA expression in different groups(±s,n=3)

      *P<0.05,**P<0.01vsblank group;##P<0.01vscontrol group

      Tab 3 Percentage of PPAR-γ protein and TGF-β1 protein expression in different groups(±s,n=6)

      **P<0.01vsblank;##P<0.01vscontrol

      4 討論

      肝纖維化是各種肝病發(fā)展成肝硬化的必經(jīng)病理過程。在我國常以乙型或丙型病毒性肝炎遷延不愈所致,30%慢性丙型肝炎患者最終出現(xiàn)嚴(yán)重的肝纖維化或肝硬化病變。肝病的治療重點轉(zhuǎn)移到如何控制肝病的進(jìn)展,防止肝纖維化以致肝硬化的發(fā)生、發(fā)展已成為國內(nèi)外生物醫(yī)學(xué)研究的熱點之一[6]。肝纖維化的特征表現(xiàn)為以膠原為主的ECM的降解減少,合成增多,沉積于肝內(nèi)過度表達(dá)從而造成假小葉的形成與肝小葉的結(jié)構(gòu)重建,而HSC的活化與增殖是ECM產(chǎn)生的主要來源,在肝纖維疾病的進(jìn)程中起著絕對作用[7]。肝纖維化狀態(tài)下ECM的質(zhì)和量會發(fā)生明顯變化,Ⅰ型膠原在肝臟中的含量比正常值高3~8 倍。所以我們可以認(rèn)為HSC 細(xì)胞的分泌功能以Ⅰ 型膠原表達(dá)水平的測定來直接地反映[8]。前期實驗研究表明,UA在體內(nèi)具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗癌、免疫調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)靜、肝損傷保護等多種藥理作用[9],但在抗肝纖維化的報道還比較少。本實驗中,UA對HSC-T6細(xì)胞的抑制率隨著濃度升高而升高,與對照組比較,UA高濃度干預(yù)組抑制率更高,說明UA具有明顯的抑制HSC-T6細(xì)胞增殖的作用,并呈劑量-效應(yīng)的關(guān)系。ELISA測定各組細(xì)胞上清液Ⅰ型膠原含量實驗中發(fā)現(xiàn),UA能夠使Ⅰ型膠原降解,在UA高濃度組中該作用最為明顯,說明UA能夠抑制HSC-T6細(xì)胞中的膠原分泌。

      Fig 3 Expression of PPAR-γ protein in different groups(×200)

      Fig 4 Expression of TGF-β1 protein in different groups(×200)

      肝纖維化的形成是一個多因素、多細(xì)胞參與的復(fù)雜過程。肝纖維化過程中,HSC的激活是其中心環(huán)節(jié)。PPAR-γ在配體作用下通過啟動或參與復(fù)雜的信號通路發(fā)揮眾多生物效應(yīng),但目前對PPAR-γ與TGF-β-Smad信號交聯(lián)及其對下游因子在肝纖維化細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路中作用知之甚少。有研究表明,PPAR-γ活化后對c-Ski始發(fā)于轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào),并提示c-Ski可能是PPAR-γ的又一靶基因[10]。c-Ski是TGF-β的smad途徑的阻遏子,其可以通過阻止smad2、smad3磷酸化,以及阻止磷酸化smad3與smad4結(jié)合形成有活性的smad復(fù)合物及募集大量輔抑制子而阻斷TGF-β/smad途徑對靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[11]。TGF-β激活能夠促進(jìn)HSC增殖、產(chǎn)生膠原,同時抑制細(xì)胞外基質(zhì)的降解,加速肝纖維化發(fā)展。羅格列酮可作為PPAR-γ的特異性誘導(dǎo)劑,通過上調(diào)PPAR-γ表達(dá),下調(diào)TGF-β表達(dá)而抑制HSC細(xì)胞的活化,實現(xiàn)肝纖維化的逆轉(zhuǎn)[12]。本實驗研究發(fā)現(xiàn),UA能夠使HSC-T6細(xì)胞中的PPAR-γ基因和蛋白表達(dá)水平上調(diào),下調(diào)TGF-β1基因和蛋白的表達(dá),并且存在劑量依賴性,這可能是UA抗肝纖維的分子機制之一。

      綜上所述,UA能夠抑制HSC-T6細(xì)胞增殖,降解ECM的沉積,說明UA具有抗肝纖維化的作用,其中機制可能與上調(diào)PPAR-γ表達(dá),下調(diào)TGF-β1表達(dá)有關(guān)。肝纖維化的調(diào)控機制非常復(fù)雜,UA抗肝纖維化的作用機制有待進(jìn)一步研究,為UA抗肝纖維化提供實驗依據(jù)。

      (致謝:本研究全部在廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院分子生物學(xué)實驗室完成,特此感謝!)

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      Effects of ursolic acid from loquat leaves on proliferation inhibition and expression of PPAR-γ, TGF-β1 in rat hepatic stellate cells

      ZHANG Yang-wu, LUO Wei-sheng, CHEN Shan, HUANG Rui,TAN Quan-xiao, WANG Shi-yan, ZHANG Xia, XUAN Chuan-feng

      (DeptofStomachandSpleen,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiUniversityofChineseMedicine,Nanning530001,China)

      Aim To investigate the effects of ursolic acid from loquat leaves on proliferation inhibition and expression of PPAR-γ 、TGF-β1 in rat hepatic stellate cells, so as to explore the mechanism of anti-hepatic fibrosis of UA.Methods HSC-T6 cells were randomly divided into blank group, rosiglitazone control group, the low, medium and high concentration of UA group to detect the cell proliferation inhibition by CCK-8 after 24,48,72 h. The content of type collagen Ⅰ in cell culture supernatant of each group was examined by ELISA. The expression of PPAR-γ mRNA, TGF-β1 mRNA in HSC-T6 cells exposured were examined by real-time quantitative PCR. Effects on HSC-T6 PPAR-γ and TGF-β1 protein from each group were detected by immunocytochemical method.Results CCK-8 results showed that the inhibitory rate of UA on cell proliferation increased with the prolongation of drug action time(P<0.01). ELISA results showed that with the increase of the concentration of UA, the content of type Ⅰ collagen content decreased(P<0.01). Real-time PCR results showed that with the increase of the concentration of UA, and the expression of PPAR-γ mRNA increased, the expression of TGF-β1 mRNA decreased(P<0.01). The results of immunocytochemistry showed that the expression of PPAR-γ protein was increased, and the expression of TGF-β1 protein was decreased with the increase of the concentration of UA(P<0.01).All effects mentioned above were dose-dependent. Moreover, the effects in the high concentration groups were stronger than those in control group.Conclusion UA can inhibit the proliferation of HSC-T6 cells, Which may be associated with the up-regulation of PPAR-γ expression and the down-regulation of TGF-β1 expression.

      ursolic acid from loquat leaves;hepatic stellate cells; liver fibrosis; collagen;extracellular matrix; cytokine

      時間:2017-3-13 8:38

      http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170324.1247.028.html

      2016-12-20,

      2017-01-14

      國家自然科學(xué)基金地區(qū)資助項目(No 81360530);國家自然科學(xué)基金地區(qū)資助項目(No 81660779);廣西中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生科研創(chuàng)新重點項目(No YJS201617)

      張揚武(1987-),男,碩士生,研究方向:消化系統(tǒng)疾病的臨床和基礎(chǔ),E-mail:1013194142@qq.com; 羅偉生(1959-),男,博士,教授,主任醫(yī)師,研究方向:消化系統(tǒng)疾病的臨床和基礎(chǔ),通訊作者,E-mail:4011188@qq.com

      10.3969/j.issn.1001-1978.2017.04.014

      A

      1001-1978(2017)04-0517-05

      R-332;R284.1;R322.47;R329.24;R392.12;R575.202.2;R977.6

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