溶劑及其體積分?jǐn)?shù)對6種肺癌細胞的細胞毒作用

董芳蕊，臧詩蕾，黎莉莉，郭紀(jì)全，臧林泉

(1.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院,廣東 廣州 510006；2.廣東省人民醫(yī)院呼吸科,廣東 廣州 510080；3.廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

溶劑及其體積分?jǐn)?shù)對6種肺癌細胞的細胞毒作用

董芳蕊1，臧詩蕾1，黎莉莉1，郭紀(jì)全2，臧林泉3

(1.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院,廣東 廣州 510006；2.廣東省人民醫(yī)院呼吸科,廣東 廣州 510080；3.廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

目的 探索既能提高難溶性中藥單體的溶解度，又對腫瘤細胞低毒或者無毒的有機溶劑及其體積分?jǐn)?shù)窗口，闡明溶劑不同體積分?jǐn)?shù)(volume fraction,VF)對模型化合物莪術(shù)醇藥效作用的影響。方法 采用四甲基偶氮唑藍顯色(MTT)法，研究二甲基亞砜(DMSO)和乙醇兩種有機溶劑對人惡性腫瘤細胞A549、NCI-H460、NCI-H1299、NCI-1650、LTEP-a2和SPC-A1等細胞活力的影響和毒性作用，并進一步研究用不同體積分?jǐn)?shù)乙醇配制的莪術(shù)醇對A549和NCI-H460的細胞毒作用及其差異性。結(jié)果 在48 h內(nèi)，當(dāng)DMSO體積分?jǐn)?shù)(DMSO volume fraction，DVF)≤0.008時對A549無細胞毒作用；DVF≤0.004時對NCI-H1650無細胞毒作用；DVF≤0.002時對NCI-H460無細胞毒作用；然而，另外3種細胞NCI-H1299、LTEP-a2和SPC-A1 細胞則在DVF<0.001時即表現(xiàn)出一定的細胞毒性。在48 h內(nèi)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)(ethanol volume fraction，EVF)≤0.004時對A549無細胞毒作用；EVF≤0.002時對NCI-H460和NCI-H1650無細胞毒作用；當(dāng)EVF≤0.001時對NCI-H1299無細胞毒作用；對LTEP-a2和SPC-A1細胞則在EVF<0.001時即表現(xiàn)有一定毒性作用。當(dāng)EVF低于0.01時乙醇對A549和NCI-H460無細胞毒作用，以其配制的莪術(shù)醇溶液對細胞活力的影響僅代表莪術(shù)醇的藥效作用，由于EVF 0.01的乙醇比EVF 0.001的乙醇具有更好的助溶作用，又具有細胞毒作用，兩細胞株細胞活力差異極大，分別從93.84%和95.67%降至35.35%和36.41%。結(jié)論 A549、NCI-H1650可以首選DMSO作為溶劑，NCI-H1299可以首選乙醇作為溶劑，NCI-H460可選擇其中任一溶劑，而LTEP-a2和SPC-A1則不宜以DMSO或者乙醇作為溶劑。

MTT；細胞毒性；中藥單體；溶劑；DMSO；乙醇；莪術(shù)醇

在體外篩選中，許多具有抗腫瘤作用的中藥單體，往往由于其較差的水溶性而受到限制，此時常利用有機溶劑提高該中藥單體的溶解度，以發(fā)揮良好的藥效作用。關(guān)于溶劑選擇討論的已有大量報道，其研究對象多為肝癌[1]、消化道癌[2]以及黑色素瘤[3]等，對于肺癌細胞株實驗中溶劑的選擇的報道很少。然而肺癌作為目前發(fā)病率最大的惡性腫瘤之一，對人類健康造成了極大的威脅，有關(guān)針對肺癌藥物的報道也層出不窮，卻少見溶劑對肺癌的細胞毒作用研究。本文以實驗室常用的溶劑DMSO和乙醇為代表溶劑[4-6]，對包括A549、NCI-H460、NCI-H1299、NCI-1650、LTEP-a2和SPC-A1在內(nèi)的6種肺癌細胞進行了溶劑細胞毒作用研究。莪術(shù)醇是常見的具有抗腫瘤作用的難溶性中藥單體，在本研究中將作為模型化合物被使用。

二甲基亞砜(DMSO)作為極性溶劑，能與大多數(shù)有機溶劑互溶，被譽為“萬能溶劑”，它對于細胞膜親和力強，能夠幫助難溶性中藥單體通過細胞膜，促進藥物的吸收利用[7]，體積分?jǐn)?shù)10%的DMSO可用于細胞低溫凍存，但是凍存過程的時間必須較短，否則細胞活性將明顯降低[8]；乙醇作為最為常用的低毒溶劑之一，常被用于提高難溶性單體在培養(yǎng)基中的溶解度。然而無論因DMSO或是乙醇，超過一定濃度都必然會對細胞產(chǎn)生毒性作用，而不同細胞對不同種類的有機溶劑及其不同濃度的敏感性必然具有差異。

本文旨在考察6種腫瘤細胞對DMSO和乙醇的耐受范圍，和最大耐受濃度，為難溶性中藥單體在細胞水平的干預(yù)試驗提供濃度參考；以難溶性中藥單體莪術(shù)醇[9]為模型藥物，探討乙醇濃度對其藥效影響。

1 實驗材料

1.1 腫瘤細胞系 人腫瘤細胞A549、NCI-H460、NCI-H1299、NCI-1650、LTEP-a2和SPC-A1，購自中國科學(xué)院上海生科院細胞資源中心，在本實驗室保存培養(yǎng)。

1.2 儀器 顯微鏡(廣州湘儀)；超凈工作臺(SW-CJ-2FD蘇州凈化)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo)；酶標(biāo)儀(Thermo)。

1.3 試劑 胎牛血清，R&S公司；RPMI 1640培養(yǎng)基，DMEM完全培養(yǎng)基，胰蛋白酶，青鏈霉素，均購自Gibco公司；MTT，美國Sigma公司；無水乙醇(生物純)，二甲基亞砜(生物純)，均購自阿拉丁試劑。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) 將人腫瘤細胞NCI-H460、NCI-H1299、NCI-1650、LTEP-a2、SPC-A1和A549細胞株分別接種無菌細胞培養(yǎng)瓶中，加入適量含體積分?jǐn)?shù)為0.10胎牛血清、體積分?jǐn)?shù)為0.01青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基或DMEM完全培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1～2天換液。貼壁生長狀態(tài)良好，處于對數(shù)生長期的細胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后，傳代(以1 ∶2或1 ∶3比例傳代)、凍存(DMSO ∶培養(yǎng)基 ∶胎牛血清=6 ∶3 ∶1)或展開實驗。

2.2 MTT法檢測不同濃度溶媒對細胞活力的影響 取對數(shù)生長期的細胞，接種于96孔板(細胞密度根據(jù)細胞不同，在3×107～5×107/L)，每孔100 μL；待細胞貼壁后棄去培養(yǎng)基，加入含0、0.001、0.002、0.004、0.008、0.016、0.032、0.064、0.128、0.256(V/V)DMSO或者乙醇的無血清培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)12，24和48 h后，每孔加入10 μL MTT(5 g·L-1)，繼續(xù)在37 ℃，5% CO2條件下孵育4 h，最終棄去培養(yǎng)液，每孔加入100 μL DMSO，在搖床上震蕩10 min，至藍紫色結(jié)晶甲臜完全溶解，用酶標(biāo)儀測定570 nm處每孔吸光度值(OD值)，實驗重復(fù)4次。按照下面公式計算細胞相對活力：

細胞相對活力/%=實驗組OD值/對照組OD值×100%[10]

2.3 MTT法檢測不同濃度乙醇對莪術(shù)醇藥效的影響 參照“2.2”實驗方法，取對數(shù)生長期的A549和NCI-H460細胞，接種于96孔板(細胞密度為3×107/L)，每孔100 μL；待細胞貼壁后棄去培養(yǎng)基，加入含0、0.001、0.01、0.1(V/V)乙醇的無血清培養(yǎng)基和以含0.001、0.01、0.1(V/V) 乙醇的無血清培養(yǎng)基配制的100 μmol·L-1莪術(shù)醇藥液，37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后，按照“2.2”方法進行實驗，并計算細胞相對活力。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism 6統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用t檢驗進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

3 結(jié)果

3.1 兩種溶劑對6種腫瘤細胞相對活力的影響 不同濃度DMSO及乙醇處理6種人腫瘤細胞12，24，48 h后，MTT檢測細胞活力變化，當(dāng)有機溶劑的濃度超過一定值以后，均表現(xiàn)出一定的時間和劑量的依賴性，然而針對不同細胞株卻稍有差異。

A549細胞株對DMSO的敏感性高于乙醇，當(dāng)DMSO的體積分?jǐn)?shù)≤0.008時，A549細胞株的細胞活力在各時間點與對照組比較差異均無顯著性，即在此濃度范圍以下，DMSO對A549細胞活力無影響。當(dāng)DMSO的體積分?jǐn)?shù)與>0.008時，細胞活力隨其濃度升高呈現(xiàn)明顯的下降趨勢，且與作用時間呈現(xiàn)負相關(guān)性，干預(yù)12、24和48 h的IC50分別為體積分?jǐn)?shù)0.0893、0.0720和0.0522。乙醇干預(yù)12、24和48 h的IC50分別為0.0540、0.0392和0.0213。見Tab 1。

相較于A549細胞株對DMSO的敏感性高于乙醇，NCI-H460則呈現(xiàn)相反結(jié)果， DMSO干預(yù)12、24和48 h的IC50分別為0.0690、0.0336和0.0196。乙醇干預(yù)12、24和48 h的IC50分別為0.0707、0.0635和0.0310。當(dāng)DMSO干預(yù)時間≤24 h，其體積分?jǐn)?shù)≤0.008時，對NCI-H460細胞活力無明顯影響，而乙醇在干預(yù)時間≤12 h時，體積分?jǐn)?shù)可以達到0.016，而對細胞活力無明顯影響。見Tab 2。

NCI-H1299對兩種有機溶劑的敏感性均高于其他5種腫瘤細胞，DMSO和乙醇干預(yù)48 h的IC50分別僅為0.0098和0.0096。當(dāng)作用時間≥24 h的情況下，體積分?jǐn)?shù)0.001的DMSO即可以細胞活力產(chǎn)生明顯影響，體積分?jǐn)?shù)0.002的乙醇同樣可以明顯影響細胞活力。見Tab 3。

NCI-H1650對兩種有機溶劑的敏感性均低于其他5種腫瘤細胞。DMSO干預(yù)12 h的IC50超過0.1。而作用時間≤12 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)低于0.016時，其細胞活力無明顯影響，這一數(shù)據(jù)也低于其他細胞株數(shù)據(jù)。見Tab 4。

Tab 1 Effect of different volume fraction organic solvent on A549 in cell viability(±s,n=4,%)

*P<0.05vscontrol group(volume fraction of DMSO or ethanol=0)

Tab 2 Effect of different volume fraction organic solvent on NCI-H460 in cell viability(±s,n=4,%)

*P<0.05vscontrol group(volume fraction of DMSO or ethanol=0)

Tab 3 Effect of different volume fraction organic solvent on NCI-H1299 in cell viability(±s,n=4,%)

*P<0.05vscontrol group(volume fraction of DMSO or ethanol=0)

DMSO干預(yù)LTEP-a2細胞，12、24和48 h的IC50分別為0.0657、0.0149和0.0104，當(dāng)干預(yù)時間超過48 h，體積分?jǐn)?shù)0.001的DMSO就會對該細胞的細胞活力產(chǎn)生明顯影響。乙醇干預(yù)12，24和48 h的IC50分別為0.0605，0.0241和0.0168，當(dāng)干預(yù)時間超過24 h，體積分?jǐn)?shù)0.001的乙醇亦會對該細胞的細胞活力產(chǎn)生明顯影響。見Tab 5。

DMSO干預(yù)SPC-A-1細胞，12、24和48 h的IC50分別為0.0823、0.0412和0.0233，當(dāng)干預(yù)時間不超過48 h，體積分?jǐn)?shù)0.004以下的DMSO均對該細胞的細胞活力無明顯影響。乙醇干預(yù)12、24和48 h的IC50分別為0.0507、0.0218和0.0134。見Tab 6。

Tab 4 Effect of different volume fraction organic solvent on NCI-H1650 in cell viability(±s,n=4,%)

*P<0.05vscontrol group(volume fraction of DMSO or ethanol=0)

Tab 5 Effect of different volume fraction organic solvent on LTEP-a2 in cell viability(±s,n=4,%)

*P<0.05vscontrol group(volume fraction DMSO or ethanol=0)

Tab 6 Effect of different volume fraction organic solvent on SPC-A-1 in cell viability(±s,n=4,%)

*P<0.05vscontrol group(volume fraction DMSO or ethanol=0)

3.2 不同濃度溶媒對藥物細胞水平藥效的影響 利用不同濃度的乙醇配制的培養(yǎng)基，溶解相同濃度的難溶性中藥單體莪術(shù)醇，并與對照組(乙醇體積分?jǐn)?shù)為0)，以及相同濃度的乙醇溶劑對照比較。

當(dāng)以體積分?jǐn)?shù)為0.001的乙醇作為溶劑溶解莪術(shù)醇時，莪術(shù)醇在溶劑中無法充分溶解，其對細胞的影響無法充分體現(xiàn)，然而當(dāng)以體積分?jǐn)?shù)為0.01的乙醇作為溶劑，雖然乙醇本身對細胞活力具有一定影響，但同時莪術(shù)醇對NCI-H460和A549的殺傷作用卻得到充分的體現(xiàn)，兩株細胞的活力分別從95.67%和93.84%降至36.41%和35.35%，如果將乙醇體積分?jǐn)?shù)提高至0.1，溶劑本身帶來的對細胞活力的影響過大，無法確證此時細胞活力的真正原因來自莪術(shù)醇或是乙醇。見Tab 7。

Tab 7 Effect of curcumol prepared with different volume fraction of ethanol on NCI-H460 and A549 in cell viability(±s,n=4,%)

4 討論

許多具有良好藥效的中藥單體的水溶性很差，在實驗過程中，為了達到實驗?zāi)康?，往往需要加入有機溶劑或者表面活性劑來提供溶解度，包括乙醇、DMSO、吐溫-80，泊洛沙姆188等，其中表面活性劑如吐溫-80，往往通過與細胞膜的作用提高藥物的溶解度，因此在細胞水平實驗過程中，對細胞的傷害較大[11]。因此作為難溶性中藥單體在細胞水平實驗中的重要角色，有機溶劑種類和濃度的選擇至關(guān)重要。標(biāo)準(zhǔn)主要包括，能夠保證藥物的溶解度，且不與藥物反應(yīng)，同時對細胞毒性小。目前雖有一些文獻報道[1-3,12]，但不同文獻對DMSO或者乙醇的用量的結(jié)論并不統(tǒng)一，造成這種差異的原因可能包括，有機溶劑的生產(chǎn)廠商或批號不同，不同細胞對不同有機溶劑的敏感性不同。本文旨在為篩選對肺癌有效的難溶藥物時提供溶劑參數(shù)。

本實驗考察了兩種有機溶劑對6種人腫瘤細胞的A 549、NCI-H460、NCI-H1299、NCI-1650、LTEP-a2和SPC-A1細胞活力的影響，結(jié)果表明同一細胞株對不同溶劑表現(xiàn)出不同的敏感程度，而同一溶劑對不同細胞株的影響程度亦有較大差異，不同濃度的有機溶劑對同一細胞株的毒性也差別極大，同時還與細胞株被干預(yù)時長密切相關(guān)。針對難溶性中藥單體，在溶劑本身濃度對細胞無明顯影響的范圍內(nèi)，隨著有機溶劑濃度的增大，藥物的溶解度增加，藥效隨之增強。因此，對于不同的細胞株進行實驗，有必要通過查閱文獻或進行實驗來確定溶劑的種類和濃度，以篩選出既能充分溶解難溶性中藥單體，令其有效作用于實驗細胞，又能對細胞活力影響最低的有機溶劑及其最佳濃度。

(致謝: 本研究是在廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院新藥篩選與藥效學(xué)評價中心完成，感謝實驗室的各位同仁在實驗中給予的極大幫助以及鼓勵，令本實驗?zāi)軌蝽樌瓿伞?

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Effect of organic solvents on human lung cancer cells and effectiveness of curcumol

DONG Fang-rui1, ZANG Shi-lei1, LI Li-li1, GUO Ji-quan2, ZANG Lin-quan3

(1.CollegeofTraditionalChineseMedicine,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China;2.DeptofRespiratory,GuangdongGeneralHospital,Guangzhou510080,China;3.CollegeofPharmacy,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China)

Aim To explore the concentration range of organic solvent which can both effectively increase solubility of the difficult soluble medicine monomer, and have low toxicity to cells, and to clarify the influence of different concentration of ethanol on curcumol efficacy.Methods Different DMSO and ethanol concentrations were diluted in culture medium and incubated with cells A549, NCI-H460, NCI-H1299, NCI-1650, LTEP-a2 and SPC-A1 for 12 h, 24 h, or 48 h, cell viability was tested by a colorimetric assay with 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT), and different concentrations of ethanol with/without different concentrations of curcumol were also prepared with culture medium, then incubate with A549 and NCI-H460 cells for 24 h, and cell viability was tested by MTT as well.Results Within 48 h the solution with 0.008(V/V) DMSO or less had no significant effect on the cell A549 compared with control group, for NCI-H1650 the concentration was 0.004(V/V) or less, for NCI-H460 the result turned to be 0.002(V/V) or less, and the solution with DMSO below 0.001(V/V) had significant effect on the three other cells, NCI-H1299, LTEP-a2 and SPC-A1. While within 48 h, the liquor with 0.004(V/V) ethanol or less did not exhibit significant cytotoxic effect on the cell A549, for NCI-H460 and NCI-H1650 the result of ethanol concentration became 0.002(V/V) or less, for NCI-H1299 the data was 0.001(V/V) or less, and the liquor with ethanol below 0.001(V/V) showed significant cytotoxic effect on LTEP-a2and SPC-A1. When the proportion of ethanol in solution was below 0.01, it has no cytotoxic on cell A549 and NCI-H460, and the curcumol solution prepared with this kind of ethanol solution only represented the efficacy of curcumol on the cells. Since the solution with 0.01(V/V) ethanol dissolved the curcumol better, the cell viability changed from about 100% to about 35%.Conclusions Different organic solvent expressed different toxicity to the same cell, and the sensitivity of different cells to one organic solvent is dissimilar. and DMSO could be the optimum solvent for A549 and NCI-H1650, while the optimum solvent of NCI-H1299 is ethanol, for NCI-H460 it could be both and DMSO and ethanol, and DMSO and ethanol is not suitable for LETP-a2, SPC-A1 to be solvent.

MTT;cytotoxicity;Chinese traditional medicine monomer;solvent;DMSO;ethanol;curcumol

時間：2017-3-13 8:38

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170324.1247.024.html

2016-12-17,

2017-02-15

廣東省科技計劃項目(No 2015A020211028)

董芳蕊(1986-)，女，碩士，研究方向：中藥活性成分與新藥研發(fā)，E-mail:imdongfangrui@163.com; 臧林泉(1965-)，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：腫瘤藥理學(xué)及多肽藥物，通訊作者，E-mail: zanglq@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.04.012

A

1001-1978(2017)04-0506-06

R284.1；R287；R734.202.2