二甲雙胍增強(qiáng)LPS激活的腹腔巨噬細(xì)胞在ATP刺激下的炎癥小體活化

魏紅霞，李陳廣，梁譯丹，徐麗慧，潘 浩，何賢輝，歐陽東云

(暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院1.免疫生物學(xué)系，2.細(xì)胞生物學(xué)系，廣東 廣州 510632)

二甲雙胍增強(qiáng)LPS激活的腹腔巨噬細(xì)胞在ATP刺激下的炎癥小體活化

魏紅霞1，李陳廣1，梁譯丹1，徐麗慧2，潘 浩1，何賢輝1，歐陽東云1

(暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院1.免疫生物學(xué)系，2.細(xì)胞生物學(xué)系，廣東 廣州 510632)

目的 以脂多糖(LPS)激活的腹腔巨噬細(xì)胞為炎癥細(xì)胞模型，探討糖尿病常用藥物二甲雙胍對(duì)胞外ATP誘導(dǎo)炎癥小體活化并釋放白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)的影響。方法 C57BL/6小鼠腹腔注射30 g·L-1巰基乙酸鹽(thioglycollate, TG)誘導(dǎo)腹腔巨噬細(xì)胞大量產(chǎn)生；利用LPS+ATP處理激活炎癥小體，采用碘化丙錠(PI)染色法檢測二甲雙胍對(duì)LPS+ATP誘導(dǎo)的腹腔巨噬細(xì)胞焦亡的影響，免疫印跡法檢測該細(xì)胞胞內(nèi)及上清中IL-1β和caspase-1的表達(dá)水平；免疫熒光技術(shù)檢測巨噬細(xì)胞P2X7嘌呤能ATP受體7(P2X7R)的亞細(xì)胞分布及熒光強(qiáng)度。結(jié)果 單獨(dú)二甲雙胍不會(huì)導(dǎo)致LPS激活細(xì)胞發(fā)生焦亡，但二甲雙胍呈劑量依賴性促進(jìn)LPS+ATP誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡 ；免疫印跡法顯示，在蛋白水平上，單獨(dú)LPS(或LPS+二甲雙胍)刺激不能誘導(dǎo)細(xì)胞釋放成熟IL-1β(17 ku)到細(xì)胞外；當(dāng)加入ATP刺激后，成熟IL-1β和活化caspase-1(10 ku)釋放到胞外；而二甲雙胍可以劑量依賴性地促進(jìn)LPS激活、ATP刺激下腹腔巨噬細(xì)胞釋放成熟IL-1β和活化caspase-1的水平。結(jié)論 二甲雙胍增強(qiáng)LPS激活的腹腔巨噬細(xì)胞在ATP刺激下的炎癥小體活化，提高caspase-1活化和成熟IL-1β釋放，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。

二甲雙胍；細(xì)胞焦亡；腹腔巨噬細(xì)胞；白細(xì)胞介素-1β；半胱氨酸天冬氨酸酶-1；炎癥小體

病原微生物感染，首先啟動(dòng)的是簡并識(shí)別的固有免疫系統(tǒng)，其中吞噬細(xì)胞起著關(guān)鍵作用。吞噬細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)部的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor, PRR)，識(shí)別病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern, PAMP)，如革蘭陰性菌的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)，啟動(dòng)炎癥反應(yīng)，包括激活NF-κB信號(hào)通路，上調(diào)腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β前體(pro-interleukin-1β, pro-IL-1β, 31 ku)等炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)；并能進(jìn)一步激活炎癥小體和caspase-1[1]，使pro-IL-1β剪切成為成熟的IL-1β(17 ku)。激活炎癥小體是機(jī)體最重要的固有免疫防御機(jī)制之一，包括：激活半胱氨酸天冬氨酸酶-1/-11(caspase-1/-11)，剪切pro-IL-1β、gasdermin D等，促進(jìn)IL-1β等炎癥因子成熟和釋放[2]。然而，最近有研究表明，成熟IL-1β只有在細(xì)胞死亡時(shí)才會(huì)被釋放到細(xì)胞外[3]。與成熟IL-1β釋放相關(guān)的細(xì)胞死亡可以通過PAMP(如：核酸、脂蛋白和LPS)首先激活巨噬細(xì)胞，然后以ATP或其他內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式(danger-associated molecular patterns, DAMPs)(如尿酸鈉晶體)刺激來誘導(dǎo)其發(fā)生；這種細(xì)胞死亡方式伴隨著炎癥小體和caspase-1的活化(產(chǎn)生caspase-1 p10活性片段)，稱之為細(xì)胞焦亡。細(xì)胞焦亡的特征表現(xiàn)為細(xì)胞膜孔的快速形成(碘化丙錠等細(xì)胞核染料可籍此進(jìn)入細(xì)胞)，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)炎癥物質(zhì)的釋放和細(xì)胞破裂，而有研究表明caspase-1的活化可以增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平和細(xì)胞膜的通透性，從而有利于成熟IL-1β、HMGB1以及其他內(nèi)容物通過溶酶體胞吐作用釋放到胞外[4]。

二甲雙胍(metformin)是一種用于治療2型糖尿病的一線藥物，許多研究也表明二甲雙胍不僅能通過改善代謝參數(shù)，如高血糖、胰島素抵抗、動(dòng)脈粥樣硬化、血脂異常等來改善慢性炎癥，同時(shí)具有直接的抗炎作用[5]。為了探索二甲雙胍藥物對(duì)急性炎癥條件下發(fā)生的細(xì)胞焦亡和IL-1β釋放的影響，本研究利用LPS作為PAMP活化腹腔巨噬細(xì)胞，以ATP作為DAMP激活炎癥小體并誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡的發(fā)生，探討了二甲雙胍對(duì)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞焦亡、caspase-1活化和成熟IL-1β釋放的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 C57BL/6小鼠，♀，6～8 周齡，體質(zhì)量(20.0±2.0)g，購于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。細(xì)菌脂多糖(LPS)、三磷酸腺苷(ATP)、碘化丙錠(propidium iodide, PI)、Hoechst 33342、Tween-80、兔抗P2X7嘌呤能受體7抗體等購于Sigma-Aldrich公司。巰基乙酸鹽(thioglycolate, TG)購自Becton Dickinson 公司。DMEM、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、青霉素、鏈霉素、L-谷氨酰胺為Gibco/Invitrogen公司的產(chǎn)品。二甲雙胍(metformin)購買于Beyotime公司。抗β-tubulin、IL-1β、caspase-1等抗體以及辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗購買于Cell Signaling Technology公司。AlexaFluor488-CD11b購自eBioscience公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 SDS-PAGE電泳系統(tǒng)(美國 Bio-Rad公司 MINI Protean2)；Zeiss熒光倒置顯微鏡(德國Zeiss公司，Axio Observer D1)；Alpha化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(美國Alpha Innotech，F(xiàn)luorChem 8000)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) C57BL/6小鼠腹腔注射500 μL 30 g·L-1TG溶液，4 d后，斷頸處死，用含50 mL·L-1FBS和0.5 mmol·L-1EDTA的PBS洗出小鼠腹腔液，300×g離心10 min，重懸于完全培養(yǎng)基中(含青霉素100 000 U·L-1、鏈霉素100 mg·L-1、L-谷氨酰胺25 mmol·L-1、100 mL·L-1FBS)。在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，洗去非貼壁細(xì)胞，換成新鮮的完全培養(yǎng)基，剩下的貼壁細(xì)胞即為腹腔巨噬細(xì)胞，將其在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。

1.4 細(xì)胞焦亡檢測 參考前文[6]方法，簡述如下：將30 g·L-1TG誘導(dǎo)產(chǎn)生的腹腔巨噬細(xì)胞接種在24孔板中。過夜后，加入二甲雙胍處理1 h，其濃度從低到高依次為0.22、0.67、2 mmol·L-1，接著用0.5 mg·L-1的LPS誘導(dǎo)4 h，然后加入2 mmol·L-1ATP刺激30 min，最后PI和Hoechst 33342雙染色10 min，置于蔡司倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 免疫印跡法 將30 g·L-1TG誘導(dǎo)產(chǎn)生的腹腔巨噬細(xì)胞接種在6孔板中，分成9組；先用0.5 mg·L-1的LPS誘導(dǎo)4 h，然后二甲雙胍(0.22、0.67、2 mmol·L-1)處理1 h，最后加入2 mmol·L-1ATP刺激30 min；分別提取細(xì)胞和上清(各樣品等體積)中的總蛋白，對(duì)細(xì)胞裂解液中的蛋白進(jìn)行定量；分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用封閉液(含50 g·L-1脫脂奶粉和1 mL·L-1Tween-20的PBS溶液)封閉1 h，一抗在4℃搖床孵育過夜，然后辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗37℃孵育1 h，碧云天公司的BeyoECL Plus化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，X光片顯影。最后用FluorChem 8000成像儀記錄結(jié)果，用AlphaEaseFC軟件進(jìn)行條帶灰度分析。

1.6 免疫熒光分析 參考前文[7]方法，簡述如下：將30 g·L-1TG誘導(dǎo)產(chǎn)生的腹腔巨噬細(xì)胞接種在玻底培養(yǎng)皿中，LPS和二甲雙胍的處理方法同上。最后吸棄其培養(yǎng)基，每孔加1 mL 40 g·L-1多聚甲醛，室溫固定15 min，然后每孔加2 mL冷甲醇于-20℃條件下通透 10 min，再用封閉液室溫封閉1 h，加一抗(100 μL每孔，其中P2X7R為1 ∶100，AlexaFluor488-CD11b為1 ∶50)，4℃孵育過夜，洗滌后加無交叉反應(yīng)的CF568-山羊抗兔IgG(美國Biotium公司)，室溫孵育1 h，Hoechst 33342染核10 min并避光，蔡司熒光顯微鏡觀察，拍照。

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍促進(jìn)ATP誘導(dǎo)的腹腔巨噬細(xì)胞的細(xì)胞焦亡 在本實(shí)驗(yàn)中，采用文獻(xiàn)常用的LPS+ATP處理誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡，PI染色用于指示焦亡的細(xì)胞[8]。結(jié)果表明，LPS和二甲雙胍本身不能誘導(dǎo)腹腔巨噬細(xì)胞發(fā)生焦亡(Fig 1A)。ATP可刺激LPS激活的腹腔巨噬細(xì)胞發(fā)生焦亡，且二甲雙胍處理，可明顯促進(jìn)LPS+ATP誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡并具有量效關(guān)系(Fig 1B, 1C)。從細(xì)胞形態(tài)上，加入ATP之后，細(xì)胞膜明顯變圓腫脹，甚至破裂成細(xì)胞碎片。PI染料可穿過細(xì)胞膜進(jìn)入核內(nèi)，發(fā)出紅色熒光。上述結(jié)果表明，二甲雙胍可劑量依賴性地促進(jìn)ATP誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞焦亡。

Fig 1 Metformin promotes cell pyroptosis of TG-elicited peritoneal macrophages induced by LPS+ATP(n=4)

A & B: Fluorescence images of TG-elicited peritoneal macrophages stained with propidium iodide(PI)(red) and Hoechst 33342(blue) dyes. The insets showed one of the PI-positive(pyroptotic) cells.C:Statistical analysis of the ratios of pyroptotic cells(PI-positive) in each group;**P<0.01vsLPS+ATP group

2.2 二甲雙胍促進(jìn)ATP刺激下腹腔巨噬細(xì)胞炎癥因子IL-1β的釋放 文獻(xiàn)提示，細(xì)胞焦亡伴隨著炎癥小體和caspase-1的活化以及成熟的IL-1β(17 ku)的釋放[3]。由于ATP誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡，因此本研究通過免疫印跡法從蛋白表達(dá)水平上分析二甲雙胍對(duì)LPS+ATP處理的腹腔巨噬細(xì)胞表達(dá)IL-1β及其他炎癥小體活化標(biāo)志性蛋白caspase-1活化的影響。結(jié)果顯示，單獨(dú)LPS刺激可促進(jìn)腹腔巨噬細(xì)胞pro-IL-1β(31 ku)的表達(dá)，但不影響腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)pro-caspase-1(45 ku)的表達(dá)水平(Fig 2A, cell lysates)，而且細(xì)胞培養(yǎng)上清中未檢測到活化的caspase-1p10(10 ku)和成熟的IL-1β(17 ku)釋放(Fig 2A, supernatant，所有樣品來自等體積的細(xì)胞培養(yǎng)上清)。當(dāng)細(xì)胞加入第二信號(hào)ATP刺激后，細(xì)胞培養(yǎng)上清中可明顯檢出被細(xì)胞釋放的活化的caspase-1p10(10 ku)和成熟的IL-1β(17 ku)(Fig 2A, 2B, 2C, supernatant)。二甲雙胍處理可進(jìn)一步促進(jìn)上述ATP誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞釋放活化的caspase-1p10(10 ku)和成熟的IL-1β(17 ku)蛋白，并具有明顯的量效關(guān)系；但如果沒有ATP的刺激，二甲雙胍本身(或與LPS聯(lián)合)不能促進(jìn)活化的caspase-1和成熟的IL-1β的釋放水平(Fig 2A, 2B, 2C, supernatant)。因此，上清中活化的caspase-1p10和成熟的IL-1β的釋放水平，可能與細(xì)胞焦亡率密切相關(guān)。這一點(diǎn)與上述細(xì)胞焦亡檢測結(jié)果以及前人發(fā)表的文獻(xiàn)相符[3]。值得一提的是，細(xì)胞裂解液中只檢測到pro-caspase-3(35 ku)的表達(dá)，而沒有檢測到活化的caspase-3(17、19 ku)的表達(dá)水平(Fig 2A, cell lysates)，說明細(xì)胞凋亡(一種依賴caspase-3的細(xì)胞死亡方式)可能未參與上述活化的caspase-1p10和成熟的IL-1β的釋放過程。

2.3 二甲雙胍上調(diào)P2X7R受體在細(xì)胞膜上的表達(dá) 上述結(jié)果中發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可促進(jìn)LPS+ATP誘導(dǎo)的腹腔巨噬細(xì)胞發(fā)生焦亡，并伴隨成熟IL-1β和活化caspase-1p10的釋放。有趣的是，機(jī)體受細(xì)菌感染后可釋放ATP，胞外ATP經(jīng)細(xì)胞膜上的受體介導(dǎo)，尤其是P2X7R，導(dǎo)致K+的釋放和炎癥小體的活化[9]，提示二甲雙胍促進(jìn)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞焦亡可能與上調(diào)ATP受體P2X7R的表達(dá)有關(guān)。結(jié)果如Fig 3(A, B)所示，經(jīng)2 mmol·L-1二甲雙胍處理的LPS激活的腹腔巨噬細(xì)胞的細(xì)胞膜上P2X7R的熒光強(qiáng)度明顯大于對(duì)照組和單獨(dú)LPS處理組的熒光強(qiáng)度。這表明，二甲雙胍可能是通過上調(diào)P2X7R在細(xì)胞膜上的表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞焦亡以及成熟IL-1β和活化caspase-1p10的釋放。

3 討論

LPS是革蘭陰性菌表達(dá)的PAMP，可被Toll樣受體4(TLR4)或細(xì)胞內(nèi)的caspase-11識(shí)別[10]。LPS與TLR4結(jié)合后，可以激活炎癥信號(hào)通路，上調(diào)pro-IL-1β和炎癥小體組分NLRP3等蛋白的表達(dá)；當(dāng)以ATP為第二信號(hào)刺激后，引起NLRP3炎癥小體的組裝，激活caspase-1的活化(形成具有蛋白酶活性的caspase-1p10片段并釋放到胞外)，促進(jìn)IL-1β的成熟，并在細(xì)胞膜上形成孔洞，使成熟的IL-1β等炎癥因子得以釋放[3]。因此，活化的caspase-1p10和成熟的IL-1β的釋放，可作為巨噬細(xì)胞炎癥小體激活的標(biāo)志。多項(xiàng)研究表明，caspase-1/-11的表達(dá)及其介導(dǎo)的炎癥因子釋放和細(xì)胞焦亡，有利于抑制感染(包括葡聚糖硫酸鈉DSS誘導(dǎo)的小鼠急性腸炎)，加快組織修復(fù)[11-12]。細(xì)胞焦亡有利于胞內(nèi)致病菌的釋放，并被其他吞噬細(xì)胞所吞噬、殺傷而清除，防止致病菌在胞內(nèi)的繁殖和持續(xù)存在[13]。因此，增強(qiáng)感染部位的炎癥小體的活化和感染細(xì)胞(或被激活細(xì)胞)的焦亡，可能有利于加強(qiáng)局部炎癥反應(yīng)，加速清除致熱源(病原微生物及其PAMP所激活的固有免疫細(xì)胞)、促進(jìn)損傷組織的修復(fù)和疾病的痊愈。另一方面，細(xì)胞焦亡是活化巨噬細(xì)胞的重要退出機(jī)制之一；如果巨噬細(xì)胞持續(xù)激活而不發(fā)生焦亡，其免疫代謝通路已經(jīng)發(fā)生改變，導(dǎo)致脂類沉積，成為泡沫細(xì)胞或脂肪巨噬細(xì)胞，這些細(xì)胞持續(xù)不斷地分泌炎癥因子和趨化因子，募集其他免疫細(xì)胞至病灶組織，將增加動(dòng)脈粥樣硬化和肥胖癥等慢性炎癥性疾病的風(fēng)險(xiǎn)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可以促進(jìn)LPS激活的腹腔巨噬細(xì)胞在ATP刺激下導(dǎo)致的細(xì)胞焦亡以及成熟IL-1β的釋放。有趣的是，介導(dǎo)IL-1β成熟的蛋白酶caspase-1p10(活性形式)的釋放量亦隨之增加。也就是說，二甲雙胍可增強(qiáng)ATP誘導(dǎo)的腹腔巨噬細(xì)胞的炎癥小體的活化及其信號(hào)通路。該結(jié)果提示，二甲雙胍可用于增強(qiáng)感染部位的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)被感染細(xì)胞(或被激活細(xì)胞)發(fā)生焦亡，從而清除病灶中的活化細(xì)胞，防止其因細(xì)胞長期存活而持續(xù)釋放炎癥細(xì)胞因子，降低慢性炎癥性疾病(如動(dòng)脈粥樣硬化和肥胖)的風(fēng)險(xiǎn)。

Fig 2 Metformin promotes release of IL-1β and caspase-1 p10 from TG-elicited peritoneal macrophages induced by LPS+ATP stimulation(n=3)

A:Western blot bands of proteins from the supernatants and cell lysates, respectively; Total proteins in the supernatant of each group came from an equal volume of supernatant of equal cell numbers. B & C: The relative gray levels of the Western blot bands of caspase-1 p10(B) and mature IL-1β(C) from respective cell culture supernatants, setting the gray-scale value of(LPS+ATP) bands as 1, respectively.*P<0.05,**P<0.01vsLPS+ATP group

Fig 3 Metformin increases membranous immunofluorescence intensity indicating redistribution of P2X7R (n=100)

A:Immunofluorescence images of P2X7R(red) and CD11b(green, cell membrane marker of peritoneal macrophages);the nuclei were revealed by Hoechst 33342 staining(blue) and the merged images of P2X7R, CD11b and nuclei were also shown. B:Statistical analysis of the mean fluorescence intensities of P2X7R on cell membranes.**P<0.01vscontrol

然而，全身性感染(敗血癥)可引起多器官功能衰竭，因感染而誘發(fā)的細(xì)胞焦亡可能是器官功能衰竭的原因之一[15-16]。由于多器官功能衰竭進(jìn)程非常迅速，機(jī)制尚不明確，目前尚無特異性的治療辦法。在這種情況下，防止細(xì)胞焦亡可能是防止敗血癥病人多器官功能衰竭的關(guān)鍵。二甲雙胍可以促進(jìn)ATP誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞發(fā)生焦亡，提示在機(jī)體受到嚴(yán)重感染(包括敗血癥)的情況下，2型糖尿病患者不宜服用二甲雙胍。

本研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍促進(jìn)ATP誘導(dǎo)的腹腔巨噬細(xì)胞發(fā)生焦亡，可能與其上調(diào)ATP受體在細(xì)胞膜上的分布有關(guān)。由于細(xì)胞焦亡的發(fā)生非常迅速(30 min以內(nèi))，ATP受體如何通過快速重分布而增強(qiáng)ATP誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡的作用，需要更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)才能明確。另外，二甲雙胍有多種生物學(xué)效應(yīng)，包括上調(diào)AMPK的活性，其促進(jìn)細(xì)胞焦亡效應(yīng)是否與此有關(guān)，也需要更多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持。深入研究上述問題，可擴(kuò)展二甲雙胍的臨床用途，如用于增強(qiáng)局部炎癥小體的激活，促進(jìn)細(xì)胞焦亡，從而快速清除感染病灶，去腐生肌，防止發(fā)展為遷延性的慢性炎癥性疾?。灰灿欣诟玫刂笇?dǎo)糖尿病患者合理服用二甲雙胍。

(致謝：本論文實(shí)驗(yàn)在暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院免疫生物學(xué)系完成。魏紅霞、李陳廣負(fù)責(zé)動(dòng)物飼養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理等工作；徐麗慧、梁譯丹參與了動(dòng)物腹腔巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)和培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)；徐麗慧、潘浩參與了免疫熒光實(shí)驗(yàn)；歐陽東云教授、何賢輝教授參與了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)等工作。)

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Metformin enhances ATP-stimulated inflammasome activation in LPS-primed peritoneal macrophages

WEI Hong-xia1,LI Chen-guang1,LIANG Yi-dan1,XU Li-hui2, PAN Hao1, HE Xian-hui1, OUYANG Dong-yun1

(1.DeptofImmunobiology; 2.DeptofCellBiology,CollegeofLifeScienceandTechnology,JinanUniversity,Guangzhou510632,China)

Aim To explore the influence of metformin(a first-line drug for type 2 diabetes) on ATP-induced inflammasome activation and the release of interleukin-1β(IL-1β) by LPS-activated peritoneal macrophages, a commonly-used inflammatory cell model.Methods Peritoneal macrophages were elicited by intraperitoneal injection of 30 g·L-1thioglycollate into C57BL/6 mice. Inflammasome was activated and cell pyroptosis was induced by LPS plus ATP treatment, and the pyroptotic cells were calculated after propidium iodide(PI) staining. The protein levels of IL-1β and caspase-1 expressed in the cells and released from them into the supernatant were evaluated by Western blot. Immunofluorescent microscopy was recruited to detect the subcellular distribution and fluorescent intensity of the purinergic P2X7receptor(P2X7R).Results Metformin per se did not induce pyroptosis in LPS-activated peritoneal macrophages, but it significantly and dose-dependently increased cell pyroptosis induced by ATP treatment. At protein levels, maturated IL-1β(17 ku) could not be released from the cells upon single LPS or LPS plus metformin stimulation;but after ATP was added, maturated IL-1β was released into the supernatants of the cells. Moreover, metformin dose-dependently increased the protein levels of both maturated IL-1β and active caspase-1 released by the LPS-activated peritoneal macrophages upon ATP stimulation.Conclusion Metformin intensifies the activation of inflammasome and increases the release of active caspase-1 and maturated IL-1β upon ATP stimulation in the LPS-activated peritoneal macrophages, which should promote inflammatory responses.

metformin; pyroptosis; peritoneal macrophages; interleukin-1β (IL-1β); caspase-1; inflammasome

時(shí)間：2017-3-13 8:38

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170324.1247.014.html

2016-12-19,

2017-01-20

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81173604，81373423)

魏紅霞(1991-)，女，碩士生，研究方向：炎癥與抗炎免疫藥理學(xué)，E-mail: 289948128@qq.com; 歐陽東云(1967-)，男，博士，研究員，研究方向: 炎癥與抗炎免疫藥理學(xué)，通訊作者， E-mail: dongyun1967@aliyun.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.04.007

A

1001-1978(2017)04-0474-06

R-332；R329.24；R364.5；R392.11；R392.12；R977.15