槲皮素在實驗性大鼠腦出血模型中的對抗炎癥作用及細(xì)胞凋亡作用的研究

徐蘭娟 易波 李保林

·基礎(chǔ)研究·

槲皮素在實驗性大鼠腦出血模型中的對抗炎癥作用及細(xì)胞凋亡作用的研究

徐蘭娟 易波 李保林

目的 探討槲皮素對大鼠腦出血模型神經(jīng)功能恢復(fù)的作用及可能機制。 方法 采用膠原酶法制作大鼠腦出血模型，隨機分為假手術(shù)組、腦出血組、腦出血+槲皮素5mg/kg組和腦出血+槲皮素50mg/kg組。藥物實驗組通過腹腔注射槲皮素，通過實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)來檢測腦組織提取物中的炎癥指標(biāo)及使用TUNEL法觀察細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果經(jīng)過3 d最佳劑量（50 mg/kg）槲皮素的治療，與腦出血組相比可以顯著降低炎癥因子的表達(dá)量及減少TUNEL陽性細(xì)胞的數(shù)量。 結(jié)論 槲皮素的最佳劑量的早期治療通過抑制炎癥反應(yīng)和減少細(xì)胞凋亡，可以改善腦出血模型后的腦損傷，從而促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。

腦出血； 槲皮素； 炎癥反應(yīng)； 細(xì)胞凋亡

腦出血（intracerebral haemorrhage，ICH）是一種臨床上常見的腦卒中亞型，具有較高的病死率，而存活的患者也常常遺留有嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙[1]。有研究表明從1980年至2008年，ICH的發(fā)病率并未降低，總發(fā)病率為24.6/10萬，且發(fā)病率隨年齡的增長而增加[2]。目前，對ICH及其后遺癥仍然缺乏有效的針對治療。有研究證實ICH后在出血范圍內(nèi)的腦組織因為巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞的激活產(chǎn)生炎癥反應(yīng)形成腦水腫，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡，影響ICH患者的預(yù)后[3]。因此，針對ICH后的炎癥反應(yīng)，槲皮素作為一種抗炎和抗氧化藥物，可能具有潛在的治療作用。槲皮素已經(jīng)被證明了具有非常有效的抗氧化劑和細(xì)胞保護(hù)作用，可以阻止內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡[4]。目前對ICH后的炎癥反應(yīng)是否具有一定的作用還沒有得到實驗證明。本研究建立膠原酶法大鼠腦出血模型，經(jīng)腹腔注射不同劑量的槲皮素，通過檢測大鼠腦出血后的神經(jīng)功能評分，腦組織水腫，腦組織炎癥因子檢測及細(xì)胞凋亡，來觀察槲皮素針對ICH是否具有治療作用。

材料與方法

一、實驗材料與試劑

動物頭顱立體定位儀 （美國Stoelting公司）；10微升微量注射器（高鴿）；圖像分析系統(tǒng)（德國萊卡）；槲皮素制劑（美國Sigma公司）；VII型膠原酶（美國Sigma公司）；RNA提取液Trizol試劑及PCR試劑盒（日本TaKaRa公司）；TUNEL試劑盒 （德國Roche公司）。

二、動物分組及腦出血模型處理

雄性SD大鼠96只，體質(zhì)量300～320 g，由維通利華公司提供。隨機分為假手術(shù)組、腦出血組、腦出血+槲皮素5 mg/kg組和腦出血+槲皮素50 mg/kg組。每組24只，其中6只用于腦水腫檢測，6只用于腦出血病灶體積測量，6只用于實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測，6只用于TUNEL細(xì)胞凋亡檢測。采用“腦內(nèi)注入膠原酶法”制作大鼠腦出血模型。將3.6%水合氯醛麻醉處理好的大鼠置于動物頭顱立體定位儀上，定位大鼠左側(cè)尾狀核區(qū)，將0.5單位的Ⅶ型膠原酶通過微量注射器注入大鼠左側(cè)尾狀核區(qū)，留針10min，緩慢拔出，使用骨蠟封閉顱骨鉆孔，消毒手術(shù)區(qū)域，縫合頭皮。所有大鼠腦出血模型制備完成后給予相同飼養(yǎng)條件。假手術(shù)組只打開頭皮，不做其他處理，縫合頭皮。腦出血+槲皮素5mg/kg組術(shù)后1 h給予腹腔注射5mg/kg劑量槲皮素；腦出血+槲皮素50mg/kg組術(shù)后1 h給予腹腔注射50mg/kg劑量槲皮素；假手術(shù)組和腦出血組術(shù)后1 h經(jīng)腹腔注入等量生理鹽水。各組每12 h給藥1次，連續(xù)3 d。

三、神經(jīng)功能評分標(biāo)準(zhǔn)

使用雙盲法，參照改良大鼠神經(jīng)功能缺損評分（modified neurological severity score，mNSS）標(biāo)準(zhǔn)：在大鼠腦出血模型制作完成及在處死各組大鼠之前進(jìn)行mNSS評分。包括運動試驗，感覺試驗，反射喪失和不正常運動及癲癇、肌陣攣、肌張力障礙4個方面進(jìn)行行為學(xué)評分。最高值18分，1～6分為輕度損傷，7～12分為中度損傷，13～18分為重度損傷。在模型制作完成時觀察到大鼠評分＞7分表示模型制作成功，入選本實驗。本實驗96只大鼠中在模型制作過程中死亡或神經(jīng)功能缺損評分未達(dá)到7分共5只，均在實驗過程中補充完整。

四、腦水腫測定

大鼠腦出血模型建立3 d后，3.6%水合氯醛麻醉，快速取出大鼠全腦，使用電子天平稱取大腦標(biāo)本濕重，將標(biāo)本放入160℃烤箱中48 h后稱取干重。腦組織水含量測定=（濕重－干重）/濕重×100%。

五、出血量病灶體積測定

大鼠腦出血后3 d，多聚甲醛灌注大鼠固定后，在冠狀面連續(xù)切片（厚度20mm），測量出血區(qū)最大切面的長和寬。血腫體積計算公式為：總病灶體積（mm3）=1／2×A×B×C（A代表血腫長徑、B代表血腫的寬徑、C代表血腫的層數(shù)）。

六、RT-PCR檢測炎癥因子

通過RT-PCR檢測腦組織提取物中的炎癥指標(biāo)。大鼠腦出血模型建立3 d后，3.6%水合氯醛麻醉，快速取出大鼠全腦，放入無RNA酶的離心管內(nèi)，液氮中保存。按照Trizol試劑使用步驟提取大鼠腦出血部位炎癥因子RNA，計算提取出RNA純度（A260/A280介于1.8～2.0之間有效）；參照三步法操作說明，白細(xì)胞介素-1β （interleukine-1β，IL-1β），白細(xì)胞介素-6（interleukine-6，IL-6） 和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosisfactor-α，TNF-α）引物序列見表1。IL-1β，IL-6和TNF-α擴增條件：（1）反轉(zhuǎn)錄，45℃，45min；（2）變性，96℃，2min；（3）二次變性，94℃，45 s；（4）退火，58℃，1min；（5）延伸，68℃，2min；（6）以上（3）～（5）三項35個循環(huán)；（7）最后延伸，68℃，7min，分析擴增產(chǎn)物。

表1 RT-PCR擴增產(chǎn)物大小

七、細(xì)胞凋亡檢測

使用TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡。3.6%水合氯醛麻醉，經(jīng)大鼠左心室插入針頭至主動脈入口，剪開右心耳，快速滴注200ml生理鹽水置換大鼠血液，再用4%多聚甲醛溶液（4℃）快速灌注。迅速斷頭取腦，將取出大腦標(biāo)本放入4%多聚甲醛溶液（4℃）過夜處理。將標(biāo)本在蔗糖溶液中梯度脫水48 h。恒溫冰凍切片機連續(xù)切片，厚度20μm。按照Roche公司生產(chǎn)的TUNEL試劑盒操作規(guī)程進(jìn)行染色，觀察到胞核為黃棕色是為TUNEL陽性細(xì)胞，在目的區(qū)域的5個不重復(fù)視野，觀察100 mm3范圍內(nèi)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)，取均值。

八、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS16.0版本軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。組間樣本比較采用兩樣本的t檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、神經(jīng)功能缺損評分mNSS結(jié)果

3組大鼠腦出血模型制作成功后均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)，mNSS評分比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。處死大鼠之前，假手術(shù)組、腦出血組與腦出血+槲皮素5 mg/kg組之間mNSS評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；腦出血組和腦出血+槲皮素50mg/kg組之間mNSS評分差異明顯，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；腦出血+槲皮素5 mg/kg組與腦出血+槲皮素50mg/kg組之間mNSS評分差異明顯，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），具體內(nèi)容見表2。

表2 4組大鼠腦出血神經(jīng)功能缺損評分（x±s，分）

二、腦水腫和TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)檢測

腦組織水含量和TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)在腦出血+槲皮素50 mg/kg組低于腦出血組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；且低于腦出血+槲皮素5mg/kg組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖1），具體內(nèi)容見表3。

表3 4組大鼠腦出血腦組織水含量和TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)（x±s）

圖1 各組大鼠腦出血標(biāo)本TUNEL染色結(jié)果（×200）

三、出血量病灶體積檢測

大鼠腦出血后3 d，在腦出血組、腦出血+槲皮素5 mg/kg組及腦出血+槲皮素50 mg/kg組均可見出血灶。與腦出血組比較，腦出血+槲皮素50 mg/kg組出血灶體積明顯縮小，表明槲皮素能降低腦出血病灶體積，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖2），具體內(nèi)容見表4。

表4 4組大鼠腦出血病灶體積（x±s）

圖2 各組大鼠腦出血標(biāo)本出血灶體積

四、炎癥因子檢測

每組實驗大鼠均有炎癥因子mRNA的表達(dá)，但是假手術(shù)組表達(dá)量微弱。大鼠腦出血后腦組織內(nèi)IL-1β，IL-6和TNF-α在mRNA水平表達(dá)的結(jié)果。與腦出血組和腦出血+槲皮素5mg/kg組比較，腦出血+槲皮素50mg/kg組各炎癥因子在mRNA表達(dá)量均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），具體內(nèi)容見表5。

表5 4組大鼠炎癥因子mRNA的表達(dá)量（x±s）

討論

在ICH引起的繼發(fā)性損傷中，由炎癥反應(yīng)引發(fā)的腦組織水腫和細(xì)胞凋亡是2種相關(guān)的危險因素，對ICH的預(yù)后有十分重要的影響[3-5]。對于如何減輕由炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的腦水腫及細(xì)胞凋亡是目前研究ICH的熱點。作為一種抗氧化和抗炎藥物，五羥黃酮的化合物槲皮素應(yīng)被認(rèn)為在急性期中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷后具有潛在有用的治療作用。目前有研究表明，槲皮素對脊髓損傷的大鼠動物模型在運動功能恢復(fù)方面具有重要保護(hù)的作用，并能降低大鼠脊髓損傷模型的繼發(fā)性損害[6]。但是在槲皮素對ICH后的影響，目前尚無研究報道。本實驗研究了槲皮素對大鼠腦出血模型中的炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡的影響，觀察其對ICH是否具有保護(hù)作用。本實驗采用膠原酶法制作大鼠腦出血模型，模型制作技術(shù)成熟，相對可靠。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)功能缺損評分mNSS測試中，大鼠腦出血后給予最佳劑量槲皮素，能明顯改善其神經(jīng)功能缺損癥狀，評分高于單純腦出血組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。因此，可以說明經(jīng)腹腔注射最佳治療劑量的槲皮素，能促進(jìn)ICH模型后的神經(jīng)功能恢復(fù)。對大鼠腦出血具有保護(hù)作用。

TNF-α是主要的促炎細(xì)胞因子之一，是炎癥反應(yīng)過程中重要的調(diào)節(jié)因子，可以刺激IL-1β、IL-4、IL-6的釋放，擴大其生物學(xué)效應(yīng)，是反映機體炎癥與組織損傷嚴(yán)重程度的重要敏感指標(biāo)。TNF-α在ICH后數(shù)小時即可檢測到，通過檢測TNF-α的含量，對預(yù)后的判斷具有重要的意義。因此，在ICH后給予一種阻斷TNF-α等炎癥因子表達(dá)的藥物，或許可以減少由ICH帶來的繼發(fā)性腦損傷和改善神經(jīng)功能。體外實驗發(fā)現(xiàn)，槲皮素可有效抑制細(xì)菌脂多糖誘導(dǎo)產(chǎn)生的IL-1β、IL-4、IL-6和TNF-α等炎癥因子[8]。但在健康成人體內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)槲皮素的血漿濃度與細(xì)菌脂多糖誘導(dǎo)產(chǎn)生的TNF-α相關(guān)，提示槲皮素只對那些機體內(nèi)存在氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的人群有作用。有研究表明槲皮素因抑制核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear factor-kappa B，NF-κB）的生物活性，從而直接減少了組織中NF-κB參與產(chǎn)生的相關(guān)細(xì)胞因子[9]。NF-κB是一種具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)，參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等重要的病理生理過程[7]。編碼炎癥因子的基因是NF-κB的反應(yīng)性基因，對IL-1β、IL-4、IL-6和TNF-α等炎癥因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是其最主要功能。槲皮素的抗炎機制可能與其能抑制NF-κB的生物活性所引起的中性粒細(xì)胞自發(fā)性凋亡延遲和降低中性粒細(xì)胞對炎癥因子的敏感性有關(guān)。

誘導(dǎo)大鼠腦出血已經(jīng)被證明可以誘導(dǎo)大鼠神經(jīng)元細(xì)胞死亡，在ICH后，細(xì)胞凋亡與神經(jīng)元細(xì)胞死亡有密切聯(lián)系[10]。天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3（cysteine-containing aspartate-specific proteases，caspase-3）表達(dá)上調(diào)的細(xì)胞凋亡是缺血性和出血性腦損傷的重要標(biāo)志。Caspase-3是Caspase家族成員之一，它在細(xì)胞凋亡執(zhí)行階段中起著核心作用，活化的Caspase-3導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞DNA斷裂，TUNEL陽性和Caspase-3陽性細(xì)胞在海馬的數(shù)量表達(dá)增加表示海馬中的神經(jīng)細(xì)胞死亡增加[11]。因此，ICH后理想的治療方法是降低細(xì)胞凋亡數(shù)量，改善神經(jīng)損傷情況。槲皮素已被證明改變的Nrf2基因的表達(dá)。槲皮素的一個關(guān)鍵功能是Nrf2在小腦顆粒細(xì)胞氧化應(yīng)激后的活化，從而導(dǎo)致基因編碼的G-谷氨酰半胱氨酸合成的誘導(dǎo)和增加還原氧化還原平衡神經(jīng)元谷胱甘肽水平的誘導(dǎo)，這些抗氧化活性的結(jié)果，使槲皮素對蛋白質(zhì)的合成重新建立起氧化還原，轉(zhuǎn)錄因子和生存信號通路的調(diào)控[12]。在大鼠心肌缺血再灌注模型中，結(jié)果表明經(jīng)槲皮素處理后，TUNEL陽性和Caspase-3陽性細(xì)胞的數(shù)量有所減少，從而抑制了細(xì)胞凋亡[13]。

本實驗表明，在大鼠腦出血模型后使用一定劑量的槲皮素，有利于大鼠腦出血后的神經(jīng)功能的恢復(fù)。ICH之后在第3天進(jìn)行動物神經(jīng)功能行為測試。測試結(jié)果是腦出血+槲皮素50mg/kg組的行為學(xué)評分明顯高于腦出血組，但是腦出血+槲皮素5mg/kg組與腦出血組的行為學(xué)評分沒有明顯差別。這可能是由于幾個不同的機制：（1）最佳治療劑量的槲皮素對ICH后具有對抗炎癥的作用。通過抑制NF-κB的生物活性，從而減少了IL-1β、IL-4、IL-6和TNF-α的表達(dá)。本實驗結(jié)果中，IL-1β、IL-4、IL-6和TNF-α的表達(dá)在腦出血+槲皮素50 mg/kg組比腦出血組明顯降低。降低炎癥因子的含量，從而抑減弱ICH后的繼發(fā)性損傷，保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞；（2）在本實驗中通過膠原酶誘導(dǎo)大鼠腦出血，在腦出血組可以觀察到有大量TUNEL陽性細(xì)胞及Caspase-3蛋白表達(dá)。通過最佳治療劑量的槲皮素能降低 TUNEL陽性和Caspase-3蛋白表達(dá)的數(shù)量，在腦出血+槲皮素50 mg/kg組與腦出血組相比。從而減少ICH部位的神經(jīng)元細(xì)胞死亡，降低ICH后的繼發(fā)性損傷。（3）本實驗中腦出血+槲皮素50mg/kg組大鼠腦出血量病灶體積與腦出血組和腦出血+槲皮素5 mg/kg組相比，病灶體積明顯縮小，說明最佳劑量的槲皮素能明顯縮小ICH后病灶體積，改善ICH后血腫的占位效應(yīng)，對ICH的預(yù)后有所幫助。綜合以上的機制，50 mg/kg劑量的槲皮素在大鼠ICH后通過降低炎癥反應(yīng)和抑制細(xì)胞凋亡，有助于神經(jīng)功能的恢復(fù)。

本實驗研究表明腹腔注射治療最佳劑量的槲皮素的早期治療，能促進(jìn)ICH模型后的神經(jīng)功能恢復(fù)。此外，槲皮素通過對抗炎癥反應(yīng)和抑制神經(jīng)元細(xì)胞死亡來改善ICH后的神經(jīng)功能的恢復(fù)。然而反應(yīng)ICH神經(jīng)功能損傷的指標(biāo)很多，本實驗僅選取了幾個代表性的指標(biāo)，因此，在實驗程序下一步中將要進(jìn)一步評估槲皮素作為一種神經(jīng)保護(hù)劑在ICH治療中的其他機制。

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Study on the effect of quercetin on inflammation and apoptosis in experimental intracerebral hemorrhage model in rats

Xu Lanjuan,Yi Bo,Li Baolin. ICU,Zhengzhou Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University,Zhengzhou 450007,China

Li Baolin,Email:libaolin136@163.com

Objective To investigate the effect of quercetin on neuronal functional recovery in intracerebral hemorrhage(ICH)rats and its underlyingmechanisms.M ethodsIn the present study,we established an ICH model by injecting type VIIbacterial collagenase(0.5 U)into the central striatum of male Sprague-Dawley rats.The animals were randomized to four groups:sham-operation group;ICH+ vehicle group;ICH+5 mg/kg quercetin group;and ICH+50 mg/kg quercetin group.The expression levels of inflammatory cytokines in the brain tissue were assayed by real-time PCR,and cell apoptosis was assayed by TUNEL staining 3 d aftermodel establishment.ResultsIt was found that the expression levels of inflammation markers and the number of apoptotic cells were reduced significantly in ICH rats receiving quercetin in 50 mg/kg quercetin group.ConclusionThese results confirmed the therapeutic efficacy of quercetin in repairing brain injury,probably by inhibiting inflammatory response and apoptosis,thus promoting nerve functional restoration.

Intracerebral hemorrhage;Quercetin;Inflammation;Apoptosis

2017-02-13）

（本文編輯：張麗）

10.3877/cma.j.issn.2095-9141.2017.02.008

450007鄭州，鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科

李保林，Email：libaolin136@163.com

徐蘭娟,易波,李保林.槲皮素在實驗性大鼠腦出血模型中的對抗炎癥作用及細(xì)胞凋亡作用的研究[J/CD].中華神經(jīng)創(chuàng)傷外科電子雜志,2017,3(2):093-097.