抗菌肽CGA-N12對腹腔注射熱帶念珠菌小鼠的治療作用

李瑞芳，李超楠，陸志方，張慧茹，張瑞玲，劉政偉

(河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南鄭州 450001)

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抗菌肽CGA-N12對腹腔注射熱帶念珠菌小鼠的治療作用

李瑞芳，李超楠，陸志方，張慧茹，張瑞玲，劉政偉

(河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南鄭州 450001)

CGA-N12為嗜鉻粒蛋白A的N端65-76位氨基酸組成的衍生肽，前期研究表明，CGA-N12具有特異性抗念珠菌活性，尤其對臨床病原真菌熱帶念珠菌拮抗活性最強(qiáng)。為研究CGA-N12體內(nèi)抗真菌活性，建立了熱帶念珠菌深部感染小鼠模型，分別用每日15 mg/kg和30 mg/kg的CGA-N12對小鼠進(jìn)行治療，并設(shè)每日15 mg/kg伊曲康唑治療對照組和感染對照組。通過測定治療后小鼠存活率、體重變化、腎臟載菌量，以及組織器官病理變化，判斷CGA-N12對小鼠的治療效果。結(jié)果表明，每日15 mg/kg和30 mg/kg的CGA-N12治療14 d后與感染對照組相比，小鼠腎臟載菌量分別降低97.6%和99.1%，小鼠存活率分別提高40%和45%，體重分別增加1.3 g和5.9 g，免疫器官指數(shù)均顯著增加，而與治療對照組差異不顯著。病理切片觀察，每日15 mg/kg和30 mg/kg的CGA-N12對組織器官的病變均有明顯改善，并且沒有出現(xiàn)伊曲康唑治療后產(chǎn)生的肝小葉血管內(nèi)皮細(xì)胞增生和腎出血現(xiàn)象。結(jié)果表明，CGA-N12對熱帶念珠菌深部感染小鼠具有治療作用。

抗菌肽；CGA-N12；熱帶念珠菌；體內(nèi)抗真菌活性

隨著腫瘤、艾滋病、糖尿病、血液病和老年疾病等發(fā)病率的不斷上升，以及器官和骨髓移植技術(shù)、導(dǎo)管技術(shù)等檢查治療手段的開展，真菌感染尤其是深部真菌感染日益增多[1]。念珠菌屬是侵襲性感染中最常見的真菌病原體，幾乎40%的傳播性念珠菌病是致命的[2]。深部真菌病致死率高于瘧疾和肺結(jié)核，每年約150萬人死于深部真菌病[3]。廣譜抗生素、類固醇和細(xì)胞毒素類藥物的廣泛應(yīng)用，使念珠菌的耐藥性不斷升高，這也是導(dǎo)致念珠菌病發(fā)病率上升的重要原因之一[4]。除了常見的煙曲霉菌、白念珠菌、熱帶念珠菌和新生隱球菌，以前對現(xiàn)有抗真菌藥物敏感性極低的鐮孢屬、賽多孢屬和接合菌，現(xiàn)在也成了致病性較高的真菌[1]。由于念珠菌耐藥性的增長速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于新型抗真菌化合物的研發(fā)速度，新型抗菌藥物的研發(fā)顯得非常迫切和必要[5]。

抗菌肽是由基因編碼的兩親性多肽?？咕男纬傻南忍烀庖邽闄C(jī)體對抗病原菌提供了第一道防線。這種免疫形式在目前所存在的物種中均有發(fā)現(xiàn)，具有廣譜抗菌活性[6]，對多種微生物包括細(xì)菌、真菌、病毒，甚至是腫瘤細(xì)胞均有抑制作用。能殺死耐藥性真菌也是它們的主要優(yōu)點(diǎn)之一[7]。與傳統(tǒng)的抗菌藥物相比，抗菌肽具有水溶性和熱穩(wěn)定性好、無免疫原性、作用溫和、細(xì)胞毒性小、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)[8]。

嗜鉻粒蛋白A是人體內(nèi)分泌細(xì)胞中的一種蛋白質(zhì)，由31-76位氨基酸組成的CGA-N46具有特異抗念珠菌活性[9]，但抗菌活性不強(qiáng)，對CGA-N46進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，發(fā)現(xiàn)由嗜鉻粒蛋白A N端65-76位氨基酸組成的衍生肽CGA-N12的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，抗菌活性高，安全性好[10]，對熱帶念珠菌的抗菌活性最高[11]。本文在前期研究的基礎(chǔ)上，建立了熱帶念珠菌深部感染小鼠模型，研究CGA-N12對熱帶念珠菌感染小鼠的臨床治療效果，為將CGA-N12開發(fā)成新型抗菌肽提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和菌種 SPF級昆明小鼠，購自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，雌雄各半，體重20 g±2 g。采用常規(guī)飼養(yǎng)，自由攝食、飲水，環(huán)境溫度16℃～22℃，自然光照。試驗(yàn)開始前，小鼠常規(guī)飼養(yǎng)7 d，以適應(yīng)試驗(yàn)環(huán)境。熱帶念珠菌，鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科惠贈(zèng)，為臨床分離株。

1.1.2 藥品 CGA-N12，河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院微生物與生化藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室采用Fmoc固相合成法合成，反相高效液相色譜法純化，純度95%以上；伊曲康唑注射液(商品名：斯皮仁諾)，西安楊森制藥公司產(chǎn)品；注射用環(huán)磷酰胺，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品；以上藥品均用PBS(pH7.0，0.20 mmol/L)配制成所需濃度。

1.2 方法

1.2.1 熱帶念珠菌的復(fù)壯 挑取熱帶念珠菌單菌落接種于SD培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min培養(yǎng)14 h。隨機(jī)挑選3只小鼠，腹腔注射熱帶念珠菌液300 μL。24 h后，將小鼠脫頸處死，750 mL/L無水乙醇中浸泡5 min，無菌條件下解剖小鼠，從小鼠腹腔中吸取黏液接種于含雙抗的SD培養(yǎng)基中。重復(fù)上述步驟，直到小鼠在注射菌液后12 h內(nèi)出現(xiàn)死亡，即得到熱帶念珠菌的復(fù)壯株。

1.2.2 熱帶念珠菌深部感染最佳濃度確定 隨機(jī)挑選40只雌性小鼠，每日以200 mg/kg的劑量腹腔注射環(huán)磷酰胺1次，連續(xù)注射3 d。在最后一次給藥24 h后，隨機(jī)分為4組，每組10只。第1組腹腔注射濃度為106CFU/mL的菌液 200 μL，第2組注射107CFU/mL的菌液200 μL，第3組注射108CFU/mL的菌液 200 μL，第4組注射109CFU/mL的菌液200 μL，10 d后觀察各組小鼠行為反應(yīng)及死亡情況,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。感染10 d后，小鼠出現(xiàn)體重嚴(yán)重下降、脊背彎曲、身體蜷縮、精神萎靡、行動(dòng)蹣跚等癥狀，死亡率在50%左右，剖檢出現(xiàn)熱帶念珠菌系統(tǒng)性感染癥狀，腎臟能分離出熱帶念珠菌，判定為建立深部感染的最佳濃度。

1.2.3 小鼠深部感染模型的建立 隨機(jī)挑選80只雌性小鼠，以200 mg/kg的劑量腹腔注射環(huán)磷酰胺，每日1次，連續(xù)注射3 d，24 h 后，腹腔注射最佳感染濃度的新鮮熱帶念珠菌懸液 200 μL，建立熱帶念珠菌深部感染小鼠模型。

1.2.4 熱帶念珠菌深部感染小鼠的治療 熱帶念珠菌感染10 d左右，隨機(jī)剖檢小鼠，腎臟分離熱帶念珠菌。此時(shí)開始治療，記錄為試驗(yàn)起始時(shí)間。將小鼠隨機(jī)分為4組，每組20只，第1、2組為試驗(yàn)組，每日分別腹腔注射CGA-N12 15 mg/kg和 30 mg/kg，第3組治療對照組，每日腹腔注射伊曲康唑15 mg/kg；第4組為感染對照組，每日1次腹腔注射200 μL PBS(0.2 mmol/L，pH7.0)。連續(xù)治療 2 周。

1.2.5 治療效果判斷

1.2.5.1 小鼠腎臟載菌量的測定 隨機(jī)取感染后10 d、治療7 d和14 d小鼠，每組3只，脫頸處死后，750 mL/L乙醇浸泡3 min。無菌條件下剖檢，摘取小鼠腎臟，稱腎臟重量。將腎臟置于無菌勻漿器中，加入 2 mL PBS，勻漿腎臟至無顆粒。吸取 100 μL 腎臟勻漿液，于含雙抗的SD固體培養(yǎng)基上涂板，培養(yǎng)24 h后記錄培養(yǎng)基上菌落個(gè)數(shù)。

1.2.5.2 免疫器官指數(shù)測定 分別在用藥后3、5、7、10、12、14 d，脫頸處死小鼠，稱體重，剖檢，取脾臟、胸腺稱重，計(jì)算脾指數(shù)和胸腺指數(shù)。脾指數(shù)=脾重量(mg)/小鼠體重(g)，胸腺指數(shù)=胸腺重量(mg)/小鼠體重(g)。

1.2.5.3 組織切片觀察 分別在用藥3、5、7、10、12、14 d脫頸處死小鼠，無菌剖檢，分別取小鼠肝、肺、脾和腎，觀察并記錄各組織器官形態(tài)和顏色變化，將各組織修剪固定，制作石蠟切片[12]，觀察各組織病理學(xué)變化。

2 結(jié)果

2.1 熱帶念珠菌深部感染小鼠模型的建立

健康昆明小鼠接種不同濃度熱帶念珠菌懸液，感染10 d后，各組小鼠存活率見表1。

表1 不同濃度熱帶念珠菌深部感染小鼠存活率

剖檢109CFU/mL試驗(yàn)組小鼠，均可見熱帶念珠菌系統(tǒng)性感染癥狀，具體表現(xiàn)為肝臟和腎臟布滿白色斑點(diǎn)。取腎臟勻漿涂板，平板上長出肉眼可見熱帶念珠菌菌落。因此，判定熱帶念珠菌深部感染小鼠模型成立，感染熱帶念珠菌最佳濃度為109CFU/mL。

2.2 治療效果

2.2.1 治療小鼠的載菌量 系統(tǒng)性真菌感染小鼠模型中，腎臟是真菌感染的主要靶器官。取感染后10 d、治療7 d和14 d 的小鼠腎臟，勻漿涂板，并計(jì)算治療14 d后，CGA-N12對熱帶念珠菌的抑制率，結(jié)果見表2。

從表2可以看出，感染10 d后，各試驗(yàn)組腎臟載菌量差異不顯著。治療7 d后，感染對照組載菌量不斷增加，與1、2、3組小鼠腎臟載菌量差異顯著。隨治療時(shí)間的增加，1、2、3組小鼠腎臟載菌量逐漸減少，治療14 d，每日30 mg/kg組腎臟載菌量減少99.1%，而感染對照組4組載菌量仍在增加。結(jié)果表明，CGA-N12在小鼠體內(nèi)具有較強(qiáng)的殺菌活性。

表2 CGA-N12對熱帶念珠菌深部感染小鼠腎臟載菌量的影響

注：角標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)；不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note：Values with same letters indicate no significant difference in the same column(P>0.05),and with different letters mean significant difference(P<0.05).

2.2.2 存活率 治療期間，對照組小鼠精神萎靡、被毛無光澤，行動(dòng)蹣跚,食欲降低，存活率僅有55%；CGA-N12治療組在試驗(yàn)后期小鼠活躍，死亡減少， 每日15 mg/kg試驗(yàn)組在治療7 d時(shí)死亡1只(表3)，存活率為95%，每日30 mg/kg試驗(yàn)組存活率為100%，與伊曲康唑治療對照組相同(圖 1)。

2.2.3 體重 治療期間，感染對照組小鼠平均體重減少4.3 g， 每日15 mg/kg試驗(yàn)組平均體重增加1.3 g，每日30 mg/kg試驗(yàn)組平均體重增加5.9 g，伊曲康唑治療對照組體重增加4.9 g(表4，圖2)。CGA-N12能夠使深部感染小鼠體重顯著提高，與伊曲康唑治療組差異不顯著。

表3 CGA-N12對熱帶念珠菌深部感染小鼠存活量的影響

圖1 CGA-N12對熱帶念珠菌深部感染小鼠存活率的影響

表4 CGA-N12對熱帶念珠菌感染小鼠體重的影響

注：角標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)；不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note：Values with same letters indicate no significant difference in the same column(P>0.05),and with different letters mean significant difference(P<0.05).

2.2.4 免疫器官指數(shù) 免疫器官是生物體免疫和抵抗病原菌感染入侵的器官。藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)中常以藥物對免疫器官重量的影響作為衡量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫功能強(qiáng)弱的指標(biāo)。本試驗(yàn)通過測定各組小鼠胸腺和脾臟的指數(shù)變化，研究 CGA-N12對深部感染熱帶念珠菌小鼠免疫器官的影響。胸腺指數(shù)變化結(jié)果見表5和圖3；脾臟指數(shù)變化結(jié)果見表6和圖4。

從圖3和圖4可以看出，與感染對照組相比，從第9天開始，治療組胸腺指數(shù)顯著增加，CGA-N12的治療作用具有濃度依賴性。隨著治療時(shí)間的延長，各治療組間差異不顯著。感染小鼠脾指數(shù)從CGA-N12治療第5天開始就顯著提高，治療組間差異不顯著。但與感染對照組相比，免疫器官指數(shù)明顯提高，差異顯著(P<0.05)。

圖2 CGA-N12對熱帶念珠菌感染小鼠體重的影響

表5 CGA-N12 對熱帶念珠菌感染小鼠胸腺指數(shù)的影響

注：角標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)；不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note：Values with same letters indicate no significant difference in the same column(P>0.05),and with different letters mean significant difference(P<0.05).

圖3 CGA-N12 對熱帶念珠菌感染小鼠胸腺指數(shù)的影響

2.2.5 感染小鼠組織器官病理切片觀察 對各組

存活小鼠的組織器官進(jìn)行病理切片觀察(圖5)，正常組肝小葉完整，肝索清晰可見；脾小體結(jié)構(gòu)清晰，紅髓白髓界限明顯；肺泡結(jié)構(gòu)清楚，肺泡腔內(nèi)無浸潤；腎臟有典型的腎小球結(jié)構(gòu)，無炎性出血。感染對照組肝索結(jié)構(gòu)不清楚，肝血竇中血細(xì)胞較多；脾臟切片看不到正常的脾小體結(jié)構(gòu)，紅髓白髓界限模糊；肺泡變形，嚴(yán)重充血；腎臟炎性細(xì)胞浸潤，腎小管損傷及再生。每日15 mg/kg和30 mg/kg兩個(gè)劑量的CGA-N12經(jīng)過14 d的治療后治療效果相近。與感染對照組相比，肝、脾、肺、腎恢復(fù)正常。而伊曲康唑治療對照組，小鼠肝小葉血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，腎臟有明顯的炎性出血。因此，與伊曲康唑相比，CGA-N12具有明顯的生物安全性。

表6 CGA-N12 對熱帶念珠菌感染小鼠脾指數(shù)的影響

注：角標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)；不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note：Values with same letters indicate no significant difference in the same column(P>0.05),and with different letters mean significant difference(P<0.05).

圖4 CGA-N12 對熱帶念珠菌感染小鼠脾指數(shù)的影響

3 討論

伊曲康唑(商品名：斯皮仁諾)是一種合成的三唑類廣譜抗真菌藥物，是目前治療真菌病常用的藥物，常用于治療甲真菌病、皮膚真菌感染、泌尿生殖系統(tǒng)真菌感染等[13]。不過，臨床使用伊曲康唑造成的不良反應(yīng)也不容忽視。Wang J L等[14]對39個(gè)研究中的8 000多個(gè)病人進(jìn)行匯總發(fā)現(xiàn)： 由于肝中毒，有1.5%的病人停止了伊曲康唑治療，19.7%的伏立康唑使用者和17.4%的伊曲康唑使用者血清肝酶水平升高。楊忠慧[15]對關(guān)于伊曲康唑?qū)е碌牟涣挤磻?yīng)的184例文獻(xiàn)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),伊曲康唑會(huì)導(dǎo)致腎臟損傷，52例患者中，腎功能損害發(fā)生率為9.61%。本試驗(yàn)驗(yàn)以伊曲康唑作為CGA-N12治療小鼠時(shí)的治療對照，通過觀察小鼠組織器官病理切片發(fā)現(xiàn)，治療14 d后，每日15 mg/kg和30 mg/kg兩種劑量的CGA-N12均達(dá)到與每日15 mg/kg伊曲康唑相同的治療效果，但與正常肝、腎組織切片相比，伊曲康唑治療組肝臟組織肝小葉血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，腎臟有明顯出血。CGA-N12表現(xiàn)出更高的生物安全性。

圖5 CGA-N12 對熱帶念珠菌感染小鼠組織的影響(HE，400×，病理變化如箭頭所示)

盧亞麗等[9]對CGA-N46的抗菌譜進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)CGA-N46抑制克柔念珠菌的作用最強(qiáng)。李瑞芳等[11]研究發(fā)現(xiàn)CGA-N12的敏感菌為熱帶念珠菌。張琳等[16]測定了CGA-N46對克柔念珠菌深部感染小鼠的臨床治療效果，發(fā)現(xiàn)每日60 mg/kg的CGA-N46治療感染小鼠的效果最佳，治療14 d幾乎可以使小鼠肺、肝、脾組織恢復(fù)至正常狀態(tài)，小鼠存活率為95%。本研究發(fā)現(xiàn)，每日15 mg/kg的CGA-N12對熱帶念珠菌深部感染的小鼠治療14 d時(shí)，就可使小鼠內(nèi)臟恢復(fù)至正常狀態(tài)，且小鼠存活率為100%。因此，CGA-N12作為CGA-N46的衍生肽比母肽的抗菌活性有很大的提高。另外，CGA-N12沒有出現(xiàn)伊曲康唑所具有的腎毒性，因此，CGA-N12具有非常大的潛力可以成為新型抗菌藥物。

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Curative Effect of Antifungal Peptide CGA-N12 on Mice Systemically Infected withCandidatropicalis

LI Rui-fang，LI Chao-nan，LU Zhi-fang，ZHANG Hui-ru，ZHANG Rui-ling，LIU Zheng-wei

(CollegeofBiologicalEngineering,HenanUniversityofTechnology,Zhengzhou,Henan,450001,China)

CGA-N12,a derived peptide of chromogranin A which consists of the 65th to 76th amino acids,has specific antifungal activity,especially to clinical pathogenic fungusCandidatropicalis.The study was designed to research the antifungal activity of CGA-N12invivo.The mouse model systemically infected withCandidatropicaliswas established by injecting clinical isolated strain ofCandidatropicalisvia intraperitoneal.15 mg/kg and 30 mg/kg CGA-N12 were applied for treatment,respectively.We set 15 mg/kg itraconazole-treated mice as therapeutic control group and PBS-treated mice as infected control group.The survival rate,the changes of body weights and theCandidas-loading amount of kidney were calculated;pathological lesions of tissues and organ with HE staining were observed.The results showed that,compared with control group,after treatment with 15 mg/kg and 30 mg/kg CGA-N12 for 14 d,theCandidas-loading amount of kidney reduced 97.6% and 99.1%,the survival rate increased 40% and 45%,the average body weight increased 1.3 g and 5.9 g,and the immune organ indexes increased significantly,respectively.The difference of the results between 30 mg/kg CGA-N12 and 15mg/kg/d itraconazole was not significant.The results of pathological lesions showed that 15 mg/kg and 30 mg/kg CGA-N12 both had therapeutic activity on the organ lesions of the infected mice and had no proliferation of hepatic vessel endothelial cell hyperplasia and renal hemorrhage which were found in itraconazole treated group.In conclusion,CGA-N12 has therapeutic activity on the mice systemically infected withCandidatropicalis.

antifungal peptide；CGA-N12；Candidatropicalis；antifungal activityinvivo

2016-07-25

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31071922,31572264)；河南省省屬高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2015RCJH03)

李瑞芳(1971-)，女，河南南樂人，教授,博士，主要從事微生物與生化藥學(xué)研究。

S859.796.7;S852.661

A

1007-5038(2017)04-0062-06