聚γ谷氨酸生物合成與DegR關系及其免疫佐劑效果研究

田光明，游 蕾

(1.長江大學動物科學學院，湖北荊州 434023；2.長江大學城市建設學院，湖北荊州 434023)

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聚γ谷氨酸生物合成與DegR關系及其免疫佐劑效果研究

田光明1，游 蕾2*

(1.長江大學動物科學學院，湖北荊州 434023；2.長江大學城市建設學院，湖北荊州 434023)

為探討調(diào)節(jié)因子DegR對聚γ谷氨酸(γ-PGA)生物合成產(chǎn)量的影響，比較聚γ谷氨酸佐劑和傳統(tǒng)鋁佐劑的輔助免疫效果，利用P43啟動子構建了穿梭表達載體pHY-degR，通過電轉化地衣芽胞桿菌WX-02獲得重組菌株WX-02/pHYdegR。同時以福爾馬林滅活的金黃色葡萄球菌蛋白疫苗作為免疫原，分別以不同分子質(zhì)量聚γ谷氨酸佐劑和鋁佐劑制備相關疫苗并免疫小鼠，7 d后注射金黃色葡萄球菌，根據(jù)小鼠死亡數(shù)，計算其相對免疫保護率。結果顯示，過表達degR后，聚γ谷氨酸生物合成產(chǎn)量提高至28.5 g/L，相比對照菌株WX-02/pHY300提高22.6%。分子質(zhì)量2×103ku聚γ谷氨酸作為佐劑的相對免疫保護率效果最好(78.9%)，優(yōu)于鋁佐劑免疫保護率(52.6%)和未添加佐劑免疫保護率(42.1%)。結果表明，過表達degR基因能提高聚γ谷氨酸生物合成量，且聚γ谷氨酸作為疫苗佐劑能增強疫苗免疫效果，可作為理想的疫苗佐劑。

地衣芽胞桿菌；聚γ谷氨酸；degR；疫苗佐劑；免疫效果

聚γ谷氨酸(poly-γ-glutamic acid，γ-PGA)是一類天然的陰離子型高分子聚合物，由L-谷氨酸和D-谷氨酸單體通過γ酰胺鍵聚合而成，其分子質(zhì)量在1×101ku～1×104ku之間[1]。 由于γ-PGA具有良好的水溶性、可吸附性、可被生物降解，且無毒害等優(yōu)良特性，在動物醫(yī)學中應用研究越來越深入[2]。Tian M等[3]發(fā)現(xiàn)γ-PGA結合的造影劑成像效果相比其他造影劑具有更好的弛豫性和安全性。高分子質(zhì)量γ-PGA可顯著調(diào)節(jié)小鼠免疫系統(tǒng)NK細胞，飼喂小鼠高分子質(zhì)量γ-PGA后，小鼠NK細胞被激活，抗腫瘤的效果顯著優(yōu)于其他誘導劑[4]。γ-PGA和L-苯丙氨酸復合物可以激活吞噬細胞和小細胞，減輕炎癥反應癥狀，與常規(guī)類固醇類藥物可以引起并發(fā)癥相比，γ-PGA和L-苯丙氨酸復合物具有無毒副作用等明顯的優(yōu)勢[5]。在細菌性和病毒性傳染病研究中，Kim E H等[6]發(fā)現(xiàn)，γ-PGA可以促進感染流感病毒小鼠體內(nèi)產(chǎn)生IFN-β和IL-12等細胞因子，且小鼠體內(nèi)NK細胞和抗原CTL活性顯著提高。在藥物載體和疫苗佐劑研究中，Okamoto S等[7]在流感血球凝集素疫苗中添加γ-PGA，增強了小鼠體內(nèi)保護性免疫能力。進一步研究發(fā)現(xiàn)，γ-PGA作為疫苗佐劑能顯著提高腦炎小鼠血清抗體效價，且單劑量注射小鼠存活率為100%[8]。Hee S M等[9]在家兔中利用γ-PGA作為胃腸炎病毒疫苗佐劑，發(fā)現(xiàn)其抗體數(shù)量明顯高于未添加γ-PGA佐劑疫苗。眾多研究成果表明，γ-PGA在動物醫(yī)學中有著良好的應用前景。

γ-PGA主要由微生物發(fā)酵產(chǎn)生，生物合成量是限制γ-PGA在動物醫(yī)學領域的制約因素之一。目前關于提高γ-PGA產(chǎn)量的研究主要集中在以下幾個方面:利用基因工程技術進行代謝途徑改造[10]，改變γ-PGA中D/L型谷氨酸的比例[11]，改變γ-PGA的分子質(zhì)量[12]，提高細胞對氧的攝取能力[13]。優(yōu)化培養(yǎng)基，包括添加金屬離子Mn2+和Ca2+，一些前體物質(zhì)包括α-酮戊二酸、檸檬酸、谷氨酰胺等[14]。優(yōu)化發(fā)酵條件、改變通氣量、pH和攪拌轉速[15]等系列措施提高γ-PGA產(chǎn)量。但通過對γ-PGA合成調(diào)控途徑的改造來提高γ-PGA產(chǎn)量的報道較少。

DegU是一個多態(tài)性調(diào)節(jié)因子，通過促進或抑制受其調(diào)節(jié)的靶基因的轉錄[16]。不同磷酸化程度的DegU調(diào)控著不同的細胞活動。本試驗通過表達DegU磷酸化正調(diào)節(jié)因子degR的表達水平，研究其對地衣芽胞桿菌合成γ-PGA的影響，同時研究不同分子質(zhì)量γ-PGA作為疫苗佐劑對小鼠相對免疫保護率的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 大腸埃希菌DH5α(F-Φ80d/lacZΔM15,Δ(lacZYA-argF)U169,recA1,endA1,hsdR17 (rK-,mK+),phoA,supE44,λ-, thi-1,gyrA96,relA1);地衣芽胞桿菌WX-02(CCTCC M208065,野生菌)、地衣芽胞桿菌WX-02/pHYdegR(WX-02含pHYdegR質(zhì)粒的過表達菌株)、地衣芽胞桿菌WX-02/pHY300(WX-02含pHY300PLK空質(zhì)粒菌株)；地衣芽胞桿菌WX-02與金黃色葡萄球菌由華中農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)微生物學國家重點實驗室惠贈。質(zhì)粒pHY300PLK，E.coli-B.licheniformis穿梭質(zhì)粒,Apr(E.coli),Tetr(E.coliandB.licheniformis)；pHY-degR，pHY300PLK含有B.subtilisP43啟動子、B.licheniformisWX-02 degR基因和amyL基因；Staphylococcusaureus為野生菌，表達質(zhì)粒pHY300PLK用于degR過表達。

1.1.2 實驗動物 昆明小鼠,40日齡，平均體重20 g±2 g，無病無傷，定期投喂飼料。

1.1.3 主要試劑及培養(yǎng)基 γ-PGA，長江大學濕地生態(tài)與利用教育部工程研究中心制備保存；蛋白定量試劑盒、DNA提取試劑盒、限制性內(nèi)切酶、T4連接酶等，天根生化科技有限公司產(chǎn)品。

大腸埃希菌和地衣芽胞桿菌于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)。地衣芽胞桿菌發(fā)酵γ-PGA的培養(yǎng)基參考Tian G等[12]配方。四環(huán)素濃度為20 μg/mL。

大豆肉湯培養(yǎng)基成份為胰蛋白胨 17 g/L，大豆蛋白胨3 g/L，葡萄糖 2.5 g/L，氯化鈉 10 g/L，K2HPO42.5 g/L。

1.2 方法

1.2.1 表達載體pHY-degR構建 根據(jù)地衣芽胞桿菌WX-02的degR基因序列設計引物degR-F，degR-R(表1)擴增degR基因基因大小為183 bp；以amyL-F，amyL-R為引物，擴增淀粉酶終止序列片段(501 bp)；以枯草芽胞桿菌168的總DNA為模板，以P43-F和P43-R為引物，擴增P43啟動子序列片段(388 bp)。 以上述3個片段為模板，以P43-F和amyL-R為引物，通過重疊延伸PCR(SOE-PCR)， 得到融合片段P43-degR-amyL。PCR產(chǎn)物純化后與pHY300PLK載體同時用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XbaⅠ進行酶切，回收后進一步用T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉化E.coliDH5α感受態(tài)細胞。挑取單菌落進行菌落PCR驗證，提取陽性菌落質(zhì)粒進行PCR和酶切驗證并測序，構建成功的重組表達質(zhì)粒命名為pHY-degR。

表1 引物

注：下劃線為限制性內(nèi)切酶酶切位點。

Note：Underline means restriction enzyme cleavage site.

1.2.2 degR強化表達菌株構建 將上述得到的重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒pHY300PLK電轉化地衣芽胞桿菌WX-02菌株。經(jīng)抗性篩選和菌落PCR驗證，得到陽性轉化子，提取重組菌中的pHY-degR質(zhì)粒，以質(zhì)粒作為模板，引物pHY300-YF/pHY300-YR進一步進行PCR驗證。過表達degR的菌株和轉化空質(zhì)粒菌株分別命名為WX-02/pHYdegR和WX-02/pHY300。

1.2.3 搖瓶發(fā)酵

1.2.3.1 菌種活化 從超低溫冰箱中取出保藏的菌種劃線LB平板培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)基12 h。

1.2.3.2 種子培養(yǎng) 以LB為種子培養(yǎng)基，250 mL三角瓶裝液量50 mL，37℃、180 r/min培養(yǎng)9 h。

1.2.3.3 γ-PGA發(fā)酵條件 接種量3%，250 mL三角瓶裝50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃、180 r/min培養(yǎng)36 h。

1.2.4 免疫原制備 無菌條件下，接種金黃色葡萄球菌至LB培養(yǎng)基，搖床振蕩培養(yǎng)16 h后收集菌體，加入終濃度為3.0 mL/L福爾馬林，恒溫滅活后提取蛋白，測定蛋白濃度，調(diào)整至0.2 mg/mL。

鋁膠鹽佐劑疫苗制備[17]：免疫原與實驗室制備的鋁膠鹽佐劑按5∶1(V/V)充分混勻，置4℃冰箱備用。

γ-PGA佐劑疫苗制備：取γ-PGA溶解于滅菌ddH2O，濃度為1 000 mg/mL，取免疫原與此濃度γ-PGA按體積比5∶1(V/V)混勻，置4℃冰箱備用。

1.2.5 動物免疫 取小鼠40只隨機分成6組，免疫Ⅰ組小鼠分別背部皮下注射鋁膠鹽佐劑疫苗, 免疫Ⅱ組、免疫Ⅲ組、免疫Ⅳ組分別注射分子質(zhì)量為2×102、2×103、6×103ku γ-PGA佐劑疫苗，免疫Ⅴ組注射不添加佐劑疫苗，對照組注射等量滅菌生理鹽水。

1.2.6 免疫保護試驗 免疫后7 d，6組小鼠分別腹腔注射0.5 mL金黃色葡萄球菌菌液，菌數(shù)為1×108CFU，觀察7 d，記錄小鼠死亡情況，計算相對免疫保護率。

1.2.7 分析方法

1.2.7.1 生物量和殘留葡萄糖含量測定 菌體生物量測定采用光密度法。取一定體積的發(fā)酵液稀釋適當倍數(shù)，調(diào)酸至pH2.5，離心去上清，用蒸餾水洗滌2次，稀釋合適范圍，分光光度計測定600 nm的吸光度值。發(fā)酵液中殘留葡萄糖利用生物傳感分析儀SBA-40E進行測定。

1.2.7.2 高效液相色譜法(HPLC)測定乙酸與聚γ谷氨酸濃度 發(fā)酵液預處理：利用去離子水將發(fā)酵液稀釋30倍，離心除菌體，經(jīng)0.22 μm水相濾膜過濾后進行HPLC-凝膠滲透色譜檢測。凝膠滲透色譜檢測條件為：采用TSK Gel G6000 PWXL凝膠滲透色譜柱，檢測波長220 nm，進樣量10 μL，流動相為25 mmol/L的無水硫酸鈉和乙腈的混合液，體積比8∶1，流速0.5 mL/min。

1.2.7.3 氣相色譜法檢測乙偶姻與 2, 3-丁二醇濃度 取1 mL發(fā)酵液，12 000 r/min，離心4 min，取上清經(jīng)乙酸乙酯萃取，以正丁醇為內(nèi)標，萃取后的2,3-丁二醇的含量由氣相色譜儀完成。氣相色譜參數(shù)如下：伽諾FFAP毛細管柱 (30 m×0.32 mm ID, 0.33 μm Film)，火焰離子化檢測器，載氣為N2，流量為1.0 mL/min，氫氣流量30 mL/min，空氣流量300 mL/min，不分流進樣，進樣量1 μL，進樣器溫度200℃，檢測器溫度280℃，柱溫箱升溫程序：40℃保持1 min，以6℃/min升溫至60℃保持1.5 min，以15℃/min升溫至160℃保持2.5 min。采用內(nèi)標法計算乙偶姻和2, 3-丁二醇的含量。

1.2.7.4 相對免疫保護率 相對免疫保護率依據(jù)下列公式進行計算：

相對免疫保護率=(1-免疫組死亡率/對照組死亡率)×100%。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 每組試驗設計3個重復，計算出數(shù)據(jù)的平均值和標準偏差；采用Origin 8.5進行數(shù)據(jù)處理分析；并采用SPSS18.0進行統(tǒng)計分析，在One way ANOVA下進行t檢驗分析，比較兩兩樣品之間的差別，(P<0.05)為差異顯著。

2 結果

2.1 表達載體pHY-degR的構建

將陽性轉化子質(zhì)粒包含的1 062 bp融合片段P43-degR-TamyL進行雙酶切驗證，酶切電泳結果如圖1所示，片段大小與預期相符，將構建好的表達質(zhì)粒測序，結果顯示，插入片段區(qū)域未發(fā)生突變，表明degR表達質(zhì)粒構建成功，命名為pHY-degR。

M.DNA 標準DL 5 000;1、2.重組質(zhì)粒pHY-degR經(jīng)EcoRⅠ 和 Xba Ⅰ雙酶切產(chǎn)物

2.2 重組地衣芽胞桿菌菌株構建

提取陽性轉化子粒DNA為模板，進行PCR鑒定，如圖2所示，PCR結果大小與預期相符，成功獲得了degR強化表達菌株和轉化空質(zhì)粒菌株，分別命名為WX-02/pHYdegR和WX-02/pHY300。

2.3 溢代謝產(chǎn)物乙偶姻，2, 3-丁二醇和乙酸檢測

發(fā)酵終點重組菌株和對照菌株主要溢流代謝物乙偶姻，2, 3-丁二醇和乙酸的含量如表2所示，過表達degR后，重組菌中溢流代謝物乙偶姻，2, 3-丁二醇和乙酸含量分別為8.3、11.55、3.35 g/L。分別比對照菌株降低了20.9%、10%和20%。

M.DNA 標準DL 5 000;1.degR過表達質(zhì)粒;2.空質(zhì)粒

表2 degR強化表達對乙偶姻和2,3-丁二醇，乙酸濃度的影響

2.4 發(fā)酵過程生物量及γ-PGA產(chǎn)量檢測

對重組菌株WX-02/pHYdegR和對照菌株WX-02/pHY300進行搖瓶發(fā)酵，檢測發(fā)酵過程中殘留葡萄糖、生物量以及γ-PGA產(chǎn)量。結果如圖3所示，在發(fā)酵前20 h，重組菌株WX-02/pHYdegR生物量與對照菌株相當，20 h之后到發(fā)酵終點，重組菌株生物量略低于對照菌株；重組菌株葡萄糖消耗與生物量的趨勢一致。重組菌株WX-02/pHYdegR發(fā)酵前20 h，γ-PGA產(chǎn)量與對照菌株差別不大，發(fā)酵后期，其γ-PGA產(chǎn)量比對照菌株要高，發(fā)酵結束后，γ-PGA產(chǎn)量顯著高于對照菌株。過表達degR基因重組菌株γ-PGA的產(chǎn)量達到28.5 g/L，相比對照菌株WX-02/pHY300提高了22.6%。

2.5 相對免疫保護率

攻毒7 d后，免疫Ⅰ、Ⅱ組和免疫對照組均表現(xiàn)出明顯的相對保護率，免疫I組相對保護率為52.6%，免疫Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組相對保護率分別為68.4%、78.9%和63.1%，免疫Ⅴ組相對保護率為42.1%(表3)。對攻毒感染試驗死亡小鼠進行剖檢，分離培養(yǎng)細菌進行鑒定，確定試驗死亡原因為感染金黃色葡萄球菌致死。

圖3 重組菌株WX-02/pHYdegR和對照菌株WX-02/pHY300發(fā)酵過程曲線

表3 活菌攻毒后小鼠死亡率和相對免疫保護率

3 討論

疫苗佐劑是動物疫苗中重要的組成部分，可作為輔助物質(zhì)增強疫苗免疫作用，增強機體對抗原的特異性應答，被廣泛應用于疫苗制備。合適的疫苗佐劑對于提高疫苗效果有著重要的意義[18-19]。

γ-PGA是一類由微生物產(chǎn)生的天然高分子聚合物，具有無毒、可降解等特性，逐漸為人們認可并重視，應用前景廣闊。隨著對γ-PGA的研究的深入，其生物合成產(chǎn)量成為限制其在疫苗佐劑中應用的重要障礙。地衣芽胞桿菌是重要的γ-PGA生產(chǎn)菌株，研究表明，DegR能夠促進DegU磷酸化，從而提高磷酸化的DegU濃度，進而激發(fā)受高濃度磷酸化DegU調(diào)控的基因的表達[20]。 高磷酸化程度DegU亦可激活聚γ-PGA合成酶的編碼基因轉錄，從而提高γ-PGA產(chǎn)量[21]。本試驗結果顯示，在γ-PGA生產(chǎn)菌株地衣芽胞桿菌中加強degR基因轉錄水平可降低乙偶姻、2, 3-丁二醇和乙酸等溢流代謝產(chǎn)物產(chǎn)量，最終導致γ-PGA產(chǎn)量顯著提高，該結果與Ohsawa T等[21]與Stanley N R等[22]的研究結果一致。動物免疫保護結果表明，相比傳統(tǒng)鋁佐劑，γ-PGA作為疫苗佐劑具有進一步增強小鼠機體抵抗金黃色葡萄球菌感染的能力，可產(chǎn)生較強的免疫應答，其中以分子質(zhì)量為2×103ku γ-PGA佐劑相對免疫效果最佳。該結果與Kim E H等[6]和Okamoto S等[7]研究發(fā)現(xiàn)的γ-PGA可增強小鼠體內(nèi)免疫能力結果一致。本研究以DegU磷酸化正調(diào)節(jié)因子degR基因為研究對象，發(fā)現(xiàn)過表達degR基因可以降低溢流代謝產(chǎn)物生成，最終提高γ-PGA生物合成量。同傳統(tǒng)鋁佐劑相比，γ-PGA能刺激機體產(chǎn)生更好的免疫效果，本試驗進一步證實γ-PGA能增強小鼠機體免疫力，為γ-PGA在細菌疫苗佐劑在疫苗研制中的應用提供了理論基礎。

綜上所述，本研究提供了一種有效的增強γ-PGA生物合成的方法，該方法在γ-PGA生產(chǎn)中具有重要的應用價值，同時為擴大具有生物降解等優(yōu)良特性的γ-PGA在動物疫苗中應用提供了寶貴依據(jù)。

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Study on Poly-γ-glutamic Acid Biosynthesis with degR Overexpression and Poly-γ-glutamic Acid Adjuvant Effect

TIAN Guang-ming1,YOU Lei2

(1.CollegeofAnimalScience，YangtzeUniversity,Jingzhou,Hubei,434023,China; 2.SchoolofUrbanConstruction,YangtzeUniversity,Jingzhou,Hubei,434023,China)

To investigate the effect of the overexpression of degR gene on the yield of poly-γ-glutamic acid and the immune effect of γ-PGA adjuvant,an engineered strain ofB.licheniformis(WX-02/pHYdegR) was developed.Transformation ofB.licheniformisWX-02 with a shuttle plasmid pHY-degR builded by strong promoter P43 was performed via electroporation.Meanwhile,formalin-killedStaphylococcusaureusproteins were used as immunogen with different adjuvants (alum adjuvant and γ-PGA adjuvant) to immunize healthy mice.The relative immune protection rate was measured after 7 days according to the mouse mortality after injecting viableStaphylococcusaureus.The results showed that the yield of γ-PGA reached 28.5 g/L,increased by 22.6% in comparison with that of the control (23.25 g/L) by enhancing expression of degR geneinvivo.In the immune-protective experiment,the immunogen mixed with γ-PGA adjuvant (2×103ku) had the best immune effect (78.9%) compared with alum adjuvant (52.6%) and pure immunogen (42.1%).Therefore,γ-PGA adjuvant can be used as an ideal adjuvant in veterinary field.

Bacilluslicheniformis;poly-γ-glutamic acid; degR;adjuvant;immune effect

2016-11-11

湖北省教育廳青年人才基金項目(q20151306);濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心基金項目(KF201509)

田光明(1979-)，男，江蘇鹽城人，博士研究生，主要從事動物醫(yī)學微生物研究。*通訊作者

S852.4

A

1007-5038(2017)04-0046-06