蝸牛酶輔助提取馬勃多糖的工藝研究

王 華， 王 瑩，詹長娟，王 翼， 徐 偉

（1.南京理工大學(xué)泰州科技學(xué)院 環(huán)境與制藥工程學(xué)院，江蘇泰州 225300；2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院 動物藥學(xué)院，江蘇泰州225300）

蝸牛酶輔助提取馬勃多糖的工藝研究

王 華1*， 王 瑩2，詹長娟1，王 翼1， 徐 偉1

（1.南京理工大學(xué)泰州科技學(xué)院 環(huán)境與制藥工程學(xué)院，江蘇泰州 225300；2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院 動物藥學(xué)院，江蘇泰州225300）

本試驗以馬勃多糖得率為評價指標(biāo)，通過研究提取溫度、時間、酶用量、pH對多糖提取率的影響，以單因素試驗和正交試驗設(shè)計優(yōu)選最佳提取工藝條件。結(jié)果表明：蝸牛酶輔助提取馬勃多糖的最佳提取工藝條件為提取溫度35℃、提取時間120 min、酶用量5.0%、pH 6.0。在此條件下，馬勃多糖得率為0.908%。與傳統(tǒng)水提法相比，多糖得率提高了158.01%。由此可見，蝸牛酶輔助提取具有得率高、提取時間短、條件溫和等優(yōu)點。

馬勃；多糖；蝸牛酶；提取

馬勃，俗稱馬蹄包、馬糞包、藥包子等，是一種擔(dān)子菌門真菌類中草藥（郭晶，2013）。據(jù)中國藥典（2015年版）記載，馬勃具有清肺利咽、止血等功能。近年來，國內(nèi)外大量科技工作者對馬勃的化學(xué)成分進(jìn)行了深入研究，發(fā)現(xiàn)馬勃成分具有抑菌（郭晶，2013）、抗炎 （蘇方華等，2010；左文英等，2004）、抗腫瘤細(xì)胞（崔磊等，2006）等藥理作用，并從馬勃中分離鑒定出了氨基酸鹽類、三萜類、甾醇類化合物以及蛋白質(zhì)、多肽、多糖、微量元素等成分（郭晶，2013；王晨英等，2002）。姜明華等（2014）和趙友生等 （2012）在馬勃多糖抗腫瘤試驗中發(fā)現(xiàn)，多糖組分對宮頸癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞及小鼠艾氏腹水瘤等具有較好的抑制作用。

本研究在傳統(tǒng)水提法的基礎(chǔ)上 （黃凱等，2008），通過蝸牛酶輔助提取馬勃多糖 （馬麗雅，2010），以馬勃多糖得率為評價指標(biāo)，比較溫度、時間、酶用量、pH四個因素對提取情況的影響，再經(jīng)正交試驗優(yōu)化提取條件，以確定最佳的提取工藝參數(shù)。

1 試驗材料與方法

1.1 原料處理 將產(chǎn)自河北的馬勃，經(jīng)除雜，粉碎，烘干后，密封貯藏，備用。

1.2 試驗儀器與試劑 HK-02A多功能粉碎機(jī)，上海燁昌食品機(jī)械有限公司；AL104電子天平，梅特勒-托利多；SHA-B雙功能水浴恒溫振蕩器，金壇市杰瑞爾電器有限公司；UV754N紫外-可見分光光度計，上海精科儀器有限公司。

D-無水葡萄糖對照品 （110833-201506），中國食品藥品檢定研究院；蝸牛酶及生化試劑，上海金穗生物科技有限公司；其余試劑為市售分析純。

1.3 試驗方法與步驟

1.3.1 馬勃多糖的提取 稱取5.0 g馬勃粉及一定量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液加入到錐形瓶中，將錐形瓶置于水浴恒溫振蕩器中，待體系溫度穩(wěn)定后，加入蝸牛酶溶液，經(jīng)酶處理一段時間后，加入2 mL 30%三氯乙酸終止反應(yīng) （莫祺暉等，2015），抽濾，收集濾液，蒸發(fā)濃縮，冷卻。將量為濃縮液的1.5倍，無水乙醇慢慢加入到濃縮液中并不斷攪拌，靜置40 min，抽濾，所得濾餅即為馬勃粗多糖。將馬勃粗多糖用蒸餾水溶解并定容至250 mL，得馬勃粗多糖溶液。

1.3.2 馬勃多糖的測定 本文采用苯酚硫酸法測定多糖的含量。根據(jù)池源等（2014）的方法，以吸光度（A486）為縱坐標(biāo)，葡萄糖的濃度（C）為橫坐標(biāo)，繪制曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A=0.0055C+0.0045，R2=0.9996。結(jié)果表明，以該法測定葡萄糖的濃度，在60～140 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系（見圖1）。

圖1 苯酚-硫酸法葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

取馬勃多糖樣品溶液1 mL于10 mL的具塞比色管中，加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，加入硫酸5 mL，加蒸餾水至10 mL，搖勻，放置10 min，置40℃水浴鍋中保溫18 min，取出后冷卻至室溫，以相應(yīng)的試劑為空白，在486 nm波長處測定其吸光度。

式中：C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到的多糖的濃度，μg/mL；V為馬勃多糖溶液的體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；m為馬勃粉質(zhì)量，g。

2 試驗結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 提取溫度對馬勃多糖得率的影響 稱取馬勃粉5.0 g，共5份，每份中加入pH 5.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液及1.5%酶液（共80 mL），分別在30、35、40、45、50℃下水浴提取60 min，結(jié)果見圖2。

從圖2中可看出，30～40℃，隨著提取溫度的不斷升高，馬勃多糖得率逐漸增大，35℃后尤為明顯，當(dāng)溫度達(dá)到40℃時，多糖得率達(dá)到最大值，40℃之后，多糖得率明顯降低，45℃后趨于平緩。溫度升高，有助于蝸牛酶酶解效率的提高，使得馬勃細(xì)胞壁的破壞速度加快，利于馬勃細(xì)胞內(nèi)多糖分子等擴(kuò)散，但是溫度過高，會使得大部分蝸牛酶結(jié)構(gòu)，發(fā)生不可逆變性（肖冬光，2004）；此外，較高的溫度亦會加快多糖糖苷鍵的裂解，從而降低馬勃多糖的得率。

圖2 提取溫度對馬勃多糖得率的影響

2.1.2 提取時間對馬勃多糖得率的影響 稱取馬勃粉5.0 g，共5份，每份中加入pH值為5.5緩沖液及1.5%酶液（共80 mL），在40℃下分別水浴提取60、75、90、105、120 min，結(jié)果見圖3。

圖3 提取時間對馬勃多糖得率的影響

從圖3中可看出，隨著提取時間的增加，多糖得率不斷提高，當(dāng)提取時間超過90 min后，多糖得率趨于穩(wěn)定。這是因為提取時間延長，馬勃細(xì)胞的破壞程度加劇，胞內(nèi)多糖能更多的擴(kuò)散至提取液中。

2.1.3 酶用量對馬勃多糖得率的影響 稱取馬勃粉5.0 g，共5份，每份中加入pH值為5.5緩沖液及分別加入 1.5%、3%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%、5.5%、6.0%酶液（共80 mL），在40℃下水浴提取60 min，結(jié)果見圖4。

從圖4中可看出，隨著酶用量的不斷增加，多糖得率也逐漸增大，當(dāng)酶用量為1.5%～4.5%時，多糖得率增大的速度較快；再增加酶用量多糖提取率趨于平緩。蝸牛酶是纖維素酶、甘露糖酶、半乳聚糖酶、蛋白水解酶、氨基酸轉(zhuǎn)移酶等混合酶（袁久剛，2014），可分解真菌細(xì)胞壁中的葡聚糖、甘露聚糖和蛋白質(zhì)等物質(zhì)。酶量增加，可迅速破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，有助于多糖的提取。

圖4 酶用量對馬勃多糖得率的影響

2.1.4 提取pH值對馬勃多糖得率的影響 稱取馬勃粉5.0 g，共5份，每份中分別加入pH值為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0的緩沖液以及1.5%酶液 （共80 mL），在40℃下水浴提取60 min，結(jié)果見圖5。

圖5 提取pH值對馬勃多糖得率的影響

從圖5中可看出，緩沖液pH值為5.5時，多糖得率較高，pH過高或過低，多糖得率都會下降，可能與蝸牛酶生物活性受到一定程度的影響有關(guān)。此外，pH過低會破壞多糖分子中的糖苷鍵（宋曉凱，2010），將多糖分子裂解為小分子寡糖甚至單糖，進(jìn)一步降低多糖的得率。

2.2 正交試驗優(yōu)化馬勃多糖的提取工藝 根據(jù)單因素試驗結(jié)果選定因素水平，以提取溫度（A）、時間（B）、酶用量（C）以及提取pH（D）作為研究對象，采用L9（34）表，設(shè)計正交提取試驗，通過對正交試驗結(jié)果進(jìn)行分析，優(yōu)化最佳提取工藝。

2.2.1 因素與水平 根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，設(shè)計正交試驗，四因素與水平見表1。

表1 正交試驗因素與水平

2.2.2 試驗結(jié)果的分析與討論 正交試驗結(jié)果與分析見表2。

表2 正交試驗設(shè)計及結(jié)果

由表2中各因素極差可知，四個因素對于試驗結(jié)果的影響強弱依次為：D＞B＞A＞C（pH＞時間＞溫度＞酶用量）；最佳提取工藝條件為：提取溫度35℃、提取時間120 min、酶用量5.0%、pH 6.0（A2B3C1D3）。

2.2.3 最佳提取工藝條件的驗證 由表3可知，在優(yōu)化工藝條件下，馬勃多糖的平均得率達(dá)到0.908%，試驗結(jié)果進(jìn)一步說明該提取工藝條件能夠達(dá)到預(yù)期目的。

2.3 最佳工藝不加酶對照試驗 按最佳工藝條件，即提取溫度35℃、提取時間120 min、pH 6.0，在此條件下，直接進(jìn)行馬勃多糖的提?。ㄎ伵Ｃ柑砑恿繛?），馬勃多糖得率為0.352%。

表3 驗證試驗結(jié)果

3 結(jié)論

本文研究了蝸牛酶輔助提取馬勃多糖的最佳提取工藝。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，應(yīng)用正交試驗優(yōu)化了蝸牛酶輔助提取馬勃多糖的提取條件，最終確定最佳的提取工藝條件為：提取溫度35℃、提取時間120 min、酶用量5.0%、pH 6.0，在此條件下馬勃多糖的得率為0.908%；最佳工藝不加酶的對照試驗中多糖得率僅為0.352%，多糖得率提高了158.01%。試驗結(jié)果表明，蝸牛酶破壁能力很強，能夠有效地提高馬勃真菌類多糖的提取效率，縮短提取時間，并且提取條件溫和，能耗低，故此法可為馬勃的綜合利用提供參考。

[1]崔磊，宋淑亮，孫隆儒.脫皮馬勃化學(xué)成分研究及抗腫瘤活性的初篩[J].中藥材，2006，29（7）：703～705.

[2]池源，王麗波.苯酚 ～硫酸法測定南瓜籽多糖含量的條件優(yōu)化[J].食品與機(jī)械，2014，1：89～92.

[3]郭晶.馬勃化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展 [J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2013，29（3）：386～389.

[4]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2015年版.一部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：50.

[5]黃凱，李志孝，鄧永康，等.藥用真菌馬勃多糖的分離純化及結(jié)構(gòu)分析[J].華西藥學(xué)雜志，2008，23（5）：516～518.

[6]姜明華，田易玲，徐凌川.馬勃多糖對荷瘤模型小鼠抑瘤作用及生命延長率的影響[J].山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2014，2：157～158.

[7]馬麗雅.生物酶法制備真菌菌絲體多糖的工藝優(yōu)化及生物活性研究：[碩士學(xué)位論文][D].哈爾濱：哈爾濱工業(yè)大學(xué)，2010.

[8]莫祺暉，韋星明，李槐，等.三氯乙酸終止液對木瓜蛋白酶酶活測定的影響研究[J].飲料工業(yè)，2015，1：23～25.

[9]蘇方華，潘日興.馬勃的抗炎鎮(zhèn)痛實驗研究[J].齊魯藥事，2010，29（10）：586～588.

[10]宋曉凱.天然藥物化學(xué)（第二版）[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010.47.

[11]王晨英，高錦明，楊雪，等.黃硬皮馬勃的化學(xué)成分[J].中草藥，2002，33（9）：778～780.

[12]肖冬光，劉青，李靜，等.釀酒酵母單倍體制備方法的優(yōu)化[J].釀酒科技，2004，4：21～22.

[13]袁久剛，王強，范雪榮，等.一種利用蝸牛酶對棉機(jī)織物進(jìn)行生物前處理的方法[P].中國，發(fā)明專利，103669006.2014-03-26.

[14]左文英，尚孟坤，揣辛桂.脫皮馬勃的抗炎、止咳作用觀察[J].河南大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)科學(xué)版，2004，23（3）：65～65.

[15]趙友生，王進(jìn)平，宋愛榮，等.馬勃多糖提取及體外抗腫瘤研究[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2012，7：574～578.■

To optimize the snailase-assisted extraction process of polysaccharides from puffball，the optimum extraction conditions were established by single-factor experiment and orthogonal analysis with polysaccharides yield as an index.The optimum extraction conditions were as follows，snailase addition was 5.0%，and pH 5.0 for 120 min extraction at 35℃，the average yield of polysaccharides was 0.908%.The yeild of polysaccharides was 158.01%higher than water extraction method.The snailase-assisted extraction method has the advantages of high yield，short extraction time and mild condition.

puffball；polysaccharide；snailase；extraction

S816.11

A

1004-3314（2017）05-0024-03

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20170505

*通訊作者