檢測飼料中維生素B₁含量的色譜條件優(yōu)化

符金華， 姜文娟*， 楊琳芬， 邢 磊， 尹騰桂，王琤，金海虹， 樊 晶

（1.江西省獸藥飼料監(jiān)察所，江西南昌 330096；2.江西科技師范大學生命科學學院，江西南昌 330013）

檢測分析

檢測飼料中維生素B含量的色譜條件優(yōu)化

符金華1， 姜文娟1*， 楊琳芬1， 邢 磊1， 尹騰桂1，王琤韋華2，金海虹1， 樊 晶1

（1.江西省獸藥飼料監(jiān)察所，江西南昌 330096；2.江西科技師范大學生命科學學院，江西南昌 330013）

本實驗中檢測飼料維生素B1含量是采用高效液相色譜法，通過建立國標法和優(yōu)化法兩種色譜條件進行檢測，其中優(yōu)化法色譜條件為：色譜柱：ZORBAX SB-C184.6×150 nm 5-Micron；流動相配比：流動相水相：甲醇=85∶15；流動相流速：1 mL/min；柱溫：35℃；進樣體積：8 μL；檢測波長：249 nm。結(jié)果表明：優(yōu)化法保留時間為7.3 min，而國標法保留時間為20 min，另根據(jù)所測線性關(guān)系得R值為0.999，重復性與精密度均符合要求。因此，優(yōu)化法條件下對于維生素B1的測定具有快速高效，重復性好，靈敏度高，實用價值高等優(yōu)點。

維生素B1；色譜條件優(yōu)化；高效液相色譜法

目前檢測維生素B1含量的方法有分光光度法、電化學法、薄層色譜法等，但是這些方法只適用于簡單的如維生素片劑、谷物等樣品的檢測。若需檢測成分復雜的飼料樣品，上述方法均存在局限性。高效液相色譜法技術(shù)相對成熟，前處理步驟簡單，對于操作技術(shù)要求并不是太高，并且可以一次性大批量檢測。因此本實驗建立不同高效液相色譜條件，測定飼料中維生素B1含量，通過比較獲得更佳的檢測條件。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 試劑 硫胺素標準品—鹽酸硫胺素、庚烷磺酸鈉、甲醇、乙醇、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）、冰乙酸、三乙胺等試劑均為優(yōu)級純，含量不低于99.7%。

實驗中所有用水均為超純水，符合 GB/T 6682中1級用水規(guī)定。

1.1.2 儀器 不同規(guī)格棕色容量瓶若干；超聲波提取器：AUTOSCIENCE AS3120 Ultrasonic Cleaner廣州諾盾科學儀器有限公司；離心機：TGL—16G上海安亭科學儀器廠；濾膜：0.22/0.45 μm（水系有機PTFE）上海嘉措儀器設(shè)備有限公司；真空泵：鞏義市英峽予華儀器廠；電子天平：JA10003上海宏衡實業(yè)有限公司；高效液相色譜儀：Agilent Technologies 1260 Infinity（含紫外檢測器，美國）。

1.1.3 樣品 5%青年蛋雞復合預混合飼料（A樣）、10%后備母豬復合預混合飼料（B樣）。

1.2 實驗前處理

1.2.1 上機前處理 提取液：在1000 mL容量瓶中裝入約700 mL超純水，加入50 mg EDTA、25 mL乙酸、5 mL三乙胺，充分混勻后用超純水定容，即得提取液水相。按水相∶甲醇=86∶14或85∶15作為不同色譜條件下維生素B1提取液。

流動相：在1000 mL容量瓶中裝入約700 mL超純水，加入50 mg EDTA、1.1 g庚烷磺酸鈉（精確至0.001 g）、25 mL乙酸、5 mL三乙胺，充分混勻后用超純水定容。調(diào)節(jié) pH至 3.40±0.02，過0.45 μm濾膜超聲脫氣，即得流動相水相。

1.2.2 維生素B1標準溶液前處理 維生素B1標準貯備液：于100 mL棕色容量瓶中加入維生素B1標準品0.05 g與25%乙醇溶液，超聲15 min待全部溶解，用乙醇溶液定容。此溶液濃度為500 μg/mL，置冰箱中低溫保存。

維生素B1標準工作液：于50 mL棕色容量瓶中加入5 mL標準貯備液，用流動相定容。該標準工作液濃度為50 μg/mL，并以此梯度稀釋5個濃度：50、25、20、5、1 μg/mL。

1.2.3 樣品前處理 準確稱取A樣4.70 g、B樣4.73 g（兩種飼料分別稱取兩份平行樣），再分別加入到100 mL棕色容量瓶中，并做好標記，加入適量提取液超聲20 min，待冷卻至室溫后用提取液定容至刻度，12000 r/min離心12 min，轉(zhuǎn)移至進樣瓶中待上機。

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜條件的選擇

1.3.1.1 國標法 GB/T14701-2002標注的色譜柱為NoVa-pak C18（3.9×150 nm，4-Microm）；實驗用色譜柱為ZORBAX SB-C18（4.6×150 nm，5-Microm）；流動相配比為流動相水相∶甲醇=86∶14；流動相流速為0.80 mL/min；柱溫為28℃；進樣體積為10 μL；檢測波長為246 nm。

1.3.1.2 優(yōu)化法 色譜柱為 ZORBAX SB-C184.6×150 mm 5-Micron；流動相配比為流動相水相∶甲醇=85∶15；流動相流速為1 mL/min；柱溫為35℃；進樣體積為8 μL；檢測波長為249 nm；選用20 μg/mL維生素B1標準工作液分別在國標法和優(yōu)化法的色譜條件下上機測定，比較相同濃度標準工作液在不同色譜條件下的測定結(jié)果，選出最適合的色譜條件。

1.3.2 線性測定 將1.2.2所得各種濃度的標準品溶液分別取20 μL注入液相色譜儀中操作，記錄結(jié)果。

1.3.3 重復性測定 分別取1.2.3中所得同一種飼料樣品的兩份平行樣溶液20 μL注入液相色譜儀中操作，記錄其色譜圖及所得數(shù)據(jù)。

1.3.4 精密度測定 連續(xù)取6份1.2.3中所得同種飼料中同一份平行樣品溶液20 μL注入液相色譜儀中操作，記錄其色譜圖及所得數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的確立 選用20 μg/mL維生素B1標準工作液分別在國標法和優(yōu)化法的色譜條件下上機測定，根據(jù)兩種條件下所得圖譜可知：在優(yōu)化法的色譜條件下峰成正態(tài)分布，峰形穩(wěn)定，吸收最強，且干擾較少，保留時間短 （結(jié)果見圖 1，為7.3 min）；而在國標法的色譜條件下，機械平衡十分不穩(wěn)定，干擾非常大，峰形不明顯，且保留時間較長（結(jié)果見圖2，為20 min）。故本實驗選擇優(yōu)化法色譜條件來測定維生素B1的含量。

圖1 20 μg/mL維生素B1標準工作液色譜圖（優(yōu)化法）

圖2 20 μg/mL維生素B1標準工作液色譜圖（國標法）

2.2 線性范圍 將1.2.2所得各種濃度的標準品溶液分別取20 μL注入液相色譜儀中分析，記錄色譜圖，以溶液濃度對峰面積進行線性回歸分析，結(jié)果見表1，線性回歸方程為y=20.20x+4.15，相關(guān)系數(shù)R=0.999。結(jié)果表明，維生素B1在1～50 μg/mL時，溶液濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3 樣品的測定 取樣品按照1.2.3中的方法對樣品進行處理，按照1.3.1.2中的色譜條件進樣測定，計算飼料中維生素B1的平均含量，測定結(jié)果見表2。

分析數(shù)據(jù)可知，對同一樣品同時測定兩次，由于實驗中所測兩種飼料樣品中維生素B1的含量均小于5.00×102mg/kg，其中B樣10%后備母豬復合預混合飼料兩次所測的實際相對偏差為0.13%（見表2），遠小于理論上所得結(jié)果的相對偏差±10.0%，表明該方法的重復性良好。

表1 不同濃度維生素B1標準工作液對應峰面積及其線性關(guān)系表

表2 飼料樣品中維生素B1的測定結(jié)果

2.4 精密度實驗 對該儀器進行精密度分析，取其中一種樣品分析如B樣10%后備母豬復合預混合飼料，結(jié)果顯示其相對標準偏差 （RSD）為1.18%（n=6），表明儀器的精密度良好。

表3 飼料樣品中維生素B1的精密度測定結(jié)果

3 討論

3.1 實驗前處理

3.1.1 提取液的選擇 梁琳等（2016）研究表明，以水—甲醇—乙酸（RSD=0.33%）作為提取液比以流動相（RSD=0.55%）或水相（RSD=1.19%）作為提取液時，實驗儀器精密度更高，因此本實驗在飼料中提取維生素B1時，選用水—甲醇—乙酸作為提取液。

3.1.2 流動相的選擇 參考李勝祥等（2009）和黃榕珍（2005）研究，若在試驗中選擇己烷磺酸鈉代替庚烷磺酸鈉作為流動相組成成分，發(fā)現(xiàn)所得色譜峰拖尾嚴重，峰形不佳，結(jié)果表明，選用己烷磺酸鈉代替庚烷磺酸鈉效果并不理想；另外，結(jié)合國家藥品標準中有關(guān)維生素B1片物質(zhì)檢查流動相的選擇與梁琳等（2016）的研究，發(fā)現(xiàn)流動相選擇添加甲醇、乙酸、三乙胺與庚烷磺酸鈉，并調(diào)節(jié)其pH為3.4左右時，經(jīng)試驗驗證，用此流動相色譜峰峰形良好，保留時間縮短，即在很大程度上提高效率。

3.1.3 維生素B1標準溶液的保存 由于硫胺的不穩(wěn)定性，遇熱、紫外線、氧氣都易分解或變質(zhì)，而其在酸性溶液中很穩(wěn)定（常溫下pH一般為3.5）。因此本實驗選擇鹽酸硫胺素作為維生素B1標準品。在配制過程中，必須使用棕色容量瓶且在避光環(huán)境下操作，否則會改變其性質(zhì)，從而對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響。另外介于硫胺素的不穩(wěn)定性，此次實驗中所有標準液都必須現(xiàn)用現(xiàn)配，使用完畢后必須置于低溫避光環(huán)境中保存，以便重復利用，但是必須保證不得超過三個月期限。

3.1.4 樣品前處理 由于飼料中成分較為復雜，雜質(zhì)色譜峰易形成干擾，因此在上機前必須對樣品進行前處理，有利于分離目標物質(zhì)，同時盡量減少對色譜柱的損害。另外在樣品的提取過程中，采用超聲波提取法而不是高溫水浴提取法，這是由于在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，在超聲波提取器中超聲20 min，可以保證維生素B1充分溶解，說明該方法能夠方便快捷的提取飼料中的維生素B1，提取效果好，并且可以減少人力物力，提高效率。

3.2 色譜條件選擇

3.2.1 色譜柱的選擇 一般對水溶性維生素進行分析時，采用C18色譜柱，其保留性強，分離效果好，本實驗所使用的色譜柱同樣為C18色譜柱，長150 mm，內(nèi)徑4.6 mm，粒度5 μm，比國標法標注的色譜柱內(nèi)徑和粒度都略大，可以承受更大的壓力和流速，提高分析效率。實驗證明，優(yōu)化法條件下的色譜峰正態(tài)分布較好，柱效較高。

3.2.2 流動相配比的選擇 當甲醇體積分數(shù)為20%時，保留時間長。呂慧卿（2008）比較流動相中水相與甲醇的配比，以保留時間和峰面積作為檢測指標，研究發(fā)現(xiàn)，增加甲醇比例可以減少出峰時間，但是色譜峰分離度較差。綜合考慮本實驗中選用的甲醇體積分數(shù)為15%左右。

3.2.3 檢測波長的選擇 張權(quán)等 （2012）和梁琳（2016）研究表明，維生素B1在246 nm處有最大吸收波長，但其受雜質(zhì)影響較大，而在250 nm處同樣有較大吸收波長。因此本次實驗中，優(yōu)化法綜合考慮選擇249 nm為檢測波長。

4 結(jié)論

本實驗結(jié)果表明，對于大批量測定不同飼料中維生素B1含量時，采用優(yōu)化法色譜條件進行檢測，所耗時間更少，所得峰形更穩(wěn)定，能準確的測定飼料中維生素B1的含量。為我們在使用不同型號的儀器設(shè)備時，優(yōu)化色譜條件提供一定的參考。

[1]國家藥典委員會.中中華人民共和國藥典[S].二部，北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：176.

[2]黃榕珍.高效液相色譜法測定甲硫氨酸維生素B1注射液中甲硫氨酸和維生素B1的含量[J].海峽藥學，2005，17（5）：42～45.

[3]李勝祥，闞家義.復合維生素B注射液中4種維生素含量測定[J].安徽醫(yī)藥，2009，13（7）：755～757.

[4]梁琳，王英.HPLC法同步測定維生素預混合飼料中5種B族維生素[J].中國飼料，2016，1：21～23.

[5]呂惠卿.高效液相色譜-熒光檢測法測定復合維B片中維生素B1含量[J].中國藥業(yè)，2008，17（15）：24~25.

[6]張權(quán)，陳文生，洪亮.高效液相色譜法測定貴州不同產(chǎn)地大米中維生素B1含量[J].糧食與飼料工業(yè)，2013，12：56～58.

[7]趙艷，揚發(fā)樹，劉耀敏，等.反相高效液相色譜法測定預混料中3種水溶性維生素[J].飼料研究，2015，1：55～57.■

This experiment established the high performance liquid chromatography（HPLC）method to detect the content of vitamin B1in feed.Two methods of national standard method and the optimization method are adopted.The optimization method of chromatographic conditions were：chromatographic column of ZORBAX SB-C184.6×150 nm 5-Micron，water phase flow of matched：mobile phase：pure methanol=85∶15，mobile phase flow rate of 1 mL/min，column temperature of 35℃，sample size of 8 μL，detection wavelength of 249 nm.The results showed that the retention time of optimization method for 7.3 min，and national standard method of retention time is about 21 min，the linear correlation coefficient R value is 0.999，repeatability and precision meet the requirements.It was concluded that the optimization method for the determination of vitamin B1was more practical，more fast and efficient，and had good repeatability，high sensitivity，etc.

vitamin B1；chromatographic conditions optimization；high performance liquid chromatography

S816.17

A

1004-3314（2017）05-0031-03

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20170507

*通訊作者