IgY在免疫檢測及治療中的應(yīng)用進(jìn)展

張 璐，劉珍珍，寧長申，菅復(fù)春

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南鄭州 450002)

IgY在免疫檢測及治療中的應(yīng)用進(jìn)展

張 璐，劉珍珍，寧長申，菅復(fù)春*

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南鄭州 450002)

卵黃抗體(IgY)是存在于卵黃中的免疫球蛋白，是鳥類、爬行動物和兩棲類動物體內(nèi)的主要抗體，具有強(qiáng)大的免疫功能。論文介紹了卵黃抗體的分子結(jié)構(gòu)和理化特性，綜述了IgY在寄生蟲(弓形蟲、血吸蟲、球蟲)、細(xì)菌(腸產(chǎn)毒素大腸埃希菌)、病毒(B型流感病毒、狂犬病病毒)等病原檢測、抗生素(卡那霉素、慶大霉素)殘留檢測及相關(guān)疾病如雛雞球蟲病、豬大腸桿菌病、鰻魚弧菌和利斯頓氏菌病、輪狀病毒病治療中的應(yīng)用，并指出目前IgY應(yīng)用中存在的諸如可能存在禽類未知病原、尚無生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程以及穩(wěn)定性不夠理想等問題。因卵黃抗體具有安全、高效、無公害的特點(diǎn)，其在疫病檢測和防治中具有廣闊的應(yīng)用前景。

卵黃抗體；免疫檢測；治療

卵黃抗體(immunoglobulin of egg yolk，IgY)是指經(jīng)特定抗原免疫的產(chǎn)蛋雞產(chǎn)生并濃集儲存于卵黃，提取后能夠預(yù)防和治療相應(yīng)疾病的來源方便、成本較低的多克隆抗體。1893年Klemperer首次證明特異性抗原免疫蛋雞后，抗體會轉(zhuǎn)移到卵黃中；1969年Leslie和ClemIgy提出以IgY表示卵黃中的抗體；20世紀(jì)80年代初，Polson A等[1]建立了制備卵黃抗體的有效方法，聚乙二醇提取法。自此以后，利用特異性卵黃抗體進(jìn)行免疫檢測和疾病治療均取得了頗好的效果。目前，卵黃抗體的應(yīng)用范圍已經(jīng)擴(kuò)展到醫(yī)藥衛(wèi)生、保健品及生物技術(shù)等相關(guān)領(lǐng)域，應(yīng)用前景良好。

1 IgY的分子結(jié)構(gòu)及理化特性

卵黃中水分約占48%，蛋白質(zhì)約占18%，脂類約占30%，其中大部分脂肪與蛋白質(zhì)以脂蛋白的形式存在。IgY的性質(zhì)與哺乳動物IgG相似。正常雞IgY的分子質(zhì)量約為180 ku，由2條輕鏈(2L)和2條重鏈(2H)組成。輕鏈有1個恒定區(qū)和1個可變區(qū)，重鏈有1個可變區(qū)和4個恒定區(qū)，重鏈和輕鏈的分子質(zhì)量分別為60 ku～70 ku和22 ku～30 ku，IgY的等電點(diǎn)約為5.2。IgY具有良好的穩(wěn)定性，耐酸、耐堿、耐熱，并具有一定抗酶解能力。IgY在pH 4.0～11.0時比較穩(wěn)定，pH 3.0～3.5時活性迅速下降，pH12時活性也有所下降。反復(fù)凍融對哺乳動物類抗體的抗原結(jié)合活性影響較大，但I(xiàn)gY經(jīng)1次～5次凍融后活性幾乎不受影響。IgY對胃蛋白酶有較高的抵抗力但對胰蛋白酶十分敏感。相關(guān)研究表明，在pH 1～5之間IgY對胃蛋白酶敏感性隨著pH的升高而減弱[2]。從生物學(xué)角度來講，人與雞的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，存在人和雞共患疾病的可能性與機(jī)率也較小，因此，與同種或相近動物的IgG相比，IgY有更好的特異性和敏感性。這些特性讓IgY比哺乳動物的抗體在相應(yīng)疾病的預(yù)防和治療方面有著先天的優(yōu)越性。

2 IgY在免疫檢測中的應(yīng)用

2.1 IgY在寄生蟲感染檢測中的應(yīng)用

IgY抗體在弓形蟲、血吸蟲和球蟲等寄生蟲感染檢測方面已經(jīng)有了初步的研究和應(yīng)用。沈榮等[3]報(bào)道用白萊航雞制備并純化抗弓形蟲IgY抗體，以辣根過氧化物酶標(biāo)記后與抗人IgM單抗配伍建立了捕獲ELISA，檢測臨床病人血樣，發(fā)現(xiàn)使用IgY確能解決此類試驗(yàn)存在的非特異性反應(yīng)，并能提高試驗(yàn)的敏感性。Cakir-Koc R等[4]采用ELISA免疫印跡技術(shù)測定制備的抗乙型肝炎病毒表面抗原1(surface antigen 1，SAG1)的卵黃抗體活性，結(jié)果顯示，獲得了特異性的抗SAG1抗體。蔡玉春等[5]用日本血吸蟲可溶性抗原(soluble egg antigens，SEA)通過兩種不同方式免疫蛋雞獲得抗SEA的特異性IgY抗體，并對IgY抗體的產(chǎn)生規(guī)律和特性進(jìn)行了鑒定與分析。吳凱等[6]成功制備并純化抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原(soluble egg antigen，SEA)的IgY，并以其作為捕捉抗體，建立了雙抗體夾心ELISA檢測間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)(IHA)陽性者尿液中的血吸蟲循環(huán)可溶性蟲卵抗原(circulating soluble egg antigen，CSEA)的方法，這種方法作為一種便捷、無創(chuàng)傷的新方法可應(yīng)用于血吸蟲病的查病工作中。

2.2 IgY在細(xì)菌感染檢測中的應(yīng)用

產(chǎn)腸毒素性大腸埃希菌(enterotoxigenicE.coli，ETEC)是引起仔豬腹瀉的主要病原之一。仔豬腹瀉的發(fā)生與大腸埃希菌的不耐熱腸毒素(LT)和耐熱腸毒素(ST)有密切關(guān)系。趙姝靜[7]通過試驗(yàn)獲得重組蛋白LTB-ST1a，免疫產(chǎn)蛋雞制備的卵黃抗體對LT和ST具有中和作用，該研究為仔豬大腸埃希菌性腹瀉的防治提供了有效的特異性防治制劑，同時為大腸埃希菌腸毒素進(jìn)一步研究提供了檢測抗體。

2.3 IgY在病毒感染檢測中的應(yīng)用

流行性感冒是最常見的急性病毒性疾病之一，乙型流感病毒是引起季節(jié)性流感局部暴發(fā)的主要病原體之一。溫俊林等[8]以滅活乙型流感病毒免疫母雞，分離純化特異性IgY抗體，通過體內(nèi)外活性鑒定，獲得了高純度和特異性的抗乙型流感病毒的IgY抗體，該抗體在體內(nèi)外均有抗病毒活性，在免疫診斷檢測中有較高靈敏度，為IgY抗體作為抗流感藥物和診斷試劑的應(yīng)用開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。H7亞型禽流感病毒是禽流感病毒的一種，屬于一種高致病性禽流感病毒。IgY在H7亞型禽流感病毒免疫檢測中的應(yīng)用也有報(bào)道。徐茂文等[9]采用血凝抑制試驗(yàn)對采集的雞卵黃樣本進(jìn)行H7亞型禽流感病毒抗體檢測，在962份雞卵黃樣本中，有22份為H7亞型禽流感病毒抗體陽性。由此可見，檢測卵黃抗體來可作為監(jiān)測產(chǎn)蛋雞群免疫或感染狀態(tài)的一個重要指標(biāo)。 Bentes G A等[10]報(bào)道利用卵黃抗體通過間接免疫熒光法檢測到來自猴子的冷凍肝臟中的甲肝病毒并證實(shí)了研究的有效性。

2.4 IgY在抗生素殘留檢測中的應(yīng)用

抗生素殘留是隨著農(nóng)牧業(yè)的發(fā)展，藥物使用不當(dāng)造成的不良后果。隨著人們對食品安全關(guān)注度的提高，藥物殘留檢測和監(jiān)管也成為目前公共衛(wèi)生和安監(jiān)部門的主要工作。因抗生素分子質(zhì)量小，抗原性差，采用合成人工抗原和借助免疫學(xué)方法是檢測抗生素殘留的常見策略。He J等[11]建立了基于IgY抗體的檢測食品中卡那霉素殘留的ic-ELISA(indirect competitive enzyme-linked immuno -sorbent assay)方法。試驗(yàn)結(jié)果顯示，針對卡那霉素的IgY抗體與其他藥物交叉反應(yīng)性較低(小于0.01%)，從牛奶、豬肉和雞粉樣品中的回收率在82.02%～98.20%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差低于5.13%。表明抗卡那霉素的IgY抗體可用于食品樣品中卡那霉素殘留的分析。He J等[12]報(bào)道已經(jīng)研發(fā)了高效價的抗慶大霉素的IgY抗體。通過ic-ELISA試驗(yàn)顯示，慶大霉素最低檢出量為0.01ng/mL，新鮮牛奶，豬肉和雞肉樣本中慶大霉素的回收率在69.82%～94.32%。表明抗慶大霉素的IgY抗體可用于食品樣品中的慶大霉素殘留的常規(guī)篩查分析。

3 IgY在疾病治療中的應(yīng)用

3.1 IgY在寄生蟲病治療中的應(yīng)用

卵黃抗體在治療動物寄生蟲病方面取得了一定的研究成果。Lee S H等[13]等發(fā)現(xiàn)，在日糧中添加10%或20%的抗3種球蟲(Eimeriatenella、E.acervulina和E.maxima)的IgY，對雛雞用E.acervulina進(jìn)行攻毒，能顯著減少試驗(yàn)雞糞便中的卵囊數(shù)量，且試驗(yàn)雞體重增加顯著。飼喂低濃度的IgY可使糞便中的卵囊數(shù)量明顯減少，但對體重增加無影響。馬超峰等[14]應(yīng)用特異性IgY治療自然感染安氏隱孢子蟲的犢牛，結(jié)果表明，與陰性卵黃抗體對照組相比，抗隱孢子蟲高免卵黃抗體治療組可以減少安氏隱孢子蟲卵囊的排出，降低排卵囊高峰期的OPG值(oocysts per gram feces)。這些研究結(jié)果說明用IgY抗體治療隱孢子蟲病是有效的，對于無特效藥物的隱孢子蟲病來說，用IgY抗體治療隱孢子蟲感染的病人意義重大。

3.2 IgY在細(xì)菌性疾病治療中的應(yīng)用

IgY作為化學(xué)藥物替代品用于胃腸道疾病防治，是目前卵黃抗體較為成功和普遍的應(yīng)用。產(chǎn)腸毒素性大腸埃希菌(EnterotoxigenicE.coli，ETEC)是引起仔豬腹瀉的主要病原之一。程福亮等[15]利用ETEC標(biāo)準(zhǔn)菌株K88、K99、987P和導(dǎo)致仔豬副傷寒的2株沙門菌，制備產(chǎn)腸毒素性大腸埃希菌-沙門菌二聯(lián)五價滅活疫苗，然后免疫接種待開產(chǎn)母雞，從而制備出效價較高的卵黃抗體，為預(yù)防和治療仔豬腹瀉提供了一條途徑。幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，Hp)是慢性胃炎和消化性潰瘍的主要病因，其感染呈世界性流行，嚴(yán)重影響人類健康。將Hp特異性致病因子作為免疫原制備Hp-IgY用于治療Hp感染，已成為國內(nèi)外幽門螺桿菌研究的主方向之一，同時也為Hp感染的治療開辟了一條新路徑[16]。

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)?；l(fā)展和抗生素的濫用，導(dǎo)致魚類病原菌逐漸產(chǎn)生耐藥性，水體污染也隨之加重，這已經(jīng)間接地危害到人類健康，尋找安全可靠的替代品成為目前畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖疫病防治的明智選擇。Li C等[17]通過試驗(yàn)證明，抗鰻弧菌特異性卵黃抗體對香魚有良好的被動免疫作用，使用后可有效降低香魚血液、肝臟和脾臟的病原菌數(shù)量。觀賞鯉魚的潰瘍病是由非典型殺鮭氣單胞菌引起的，它誘發(fā)皮膚潰瘍，導(dǎo)致觀賞魚毀容進(jìn)而造成經(jīng)濟(jì)損失。Gan H等[18]研制了能預(yù)防潰瘍的IgY，連續(xù)將魚浸入含有IgY的飼養(yǎng)水中可以完全阻止由于群體同居交叉感染導(dǎo)致的潰瘍性疾病，表明使用這種IgY可有效防止這種接觸性感染。近年來，由鰻利斯頓氏菌引起的香魚病害問題越來越嚴(yán)重。程娜[19]研究表明，灌服特異性卵黃抗體對感染鰻利斯頓氏菌的香魚能夠發(fā)揮有效的治療和預(yù)防作用。

3.3 IgY在病毒性疾病治療中的應(yīng)用

輪狀病毒(Rotavirus，RV)是引起嬰幼兒腹瀉的重要病原體，采用抗輪狀病毒IgY對輪狀病毒性腸炎患者進(jìn)行治療發(fā)現(xiàn)，特異性IgY用于治療小兒輪狀病毒性腸炎具有良好的效果。高運(yùn)金等[20]報(bào)道，將108例輪狀病毒檢測為陽性的患兒隨機(jī)均分2組，發(fā)現(xiàn)使用抗輪狀病毒IgY對對輪狀病毒性腸炎總治愈率達(dá)89.83%，療效顯著。豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)是引起初生仔豬腹瀉的腸道病毒性病原體，口服或在飼料中添加抗PEDV的IgY后，仔豬的病死率顯著降低[21]。

3.4 IgY在其他疾病治療中的應(yīng)用

特異性IgY對嬰幼兒、老年人或由于化療的腫瘤患者等特殊人群具有重要意義。特定基因型的IgY抗體能夠應(yīng)用于發(fā)現(xiàn)及檢測生物芯片中的藥物靶點(diǎn)，并可應(yīng)用于消化系統(tǒng)腫瘤的靶向治療[22]。

IgY在治療蛇毒中的應(yīng)用也多有報(bào)道。地球上現(xiàn)有2 000余種蛇，其中420余種為有毒的蛇，蛇毒中毒是一個重大的公共安全問題，也是容易被忽視的主要熱帶疾病之一，每年都有人被毒蛇侵害的病例。傳統(tǒng)的抗蛇毒血清具有生產(chǎn)成本高、產(chǎn)率低、副作用多等缺點(diǎn)。IgY具有生產(chǎn)成本低、產(chǎn)量大、純度高、副作用少等優(yōu)點(diǎn)，可替代傳統(tǒng)血清用于治療蛇毒中毒。因此，IgY是一種極富前景的蛇毒解毒劑資源[23]。

IgY能有效抑制兒童乳牙齲的發(fā)生，對齲病有預(yù)防作用?？过xIgY牙膏的應(yīng)用能降低乳牙齲病的發(fā)病率，具有一定的防齲效果，有很好的應(yīng)用前景。陳洪等將變形鏈球菌用不同濃度的抗齲齒IgY和添加IgY的牙膏培養(yǎng)，結(jié)果顯示，抗齲齒IgY和IgY牙膏均能在體外抑制變形鏈球菌的生長和黏附作用[24]。

IgY甚至還具有治療肥胖病的潛力。Hirose M等[25]研究了抗脂肪酶IgY對脂肪酶體外活性的抑制作用，發(fā)現(xiàn)抗脂肪酶IgY抗體在飲食誘導(dǎo)肥胖的鼠科動物模型上有抗肥胖性能。姜錦鵬等[26]利用豬脂肪組織細(xì)胞膜蛋白制備卵黃抗體，并通過不同的試驗(yàn)證實(shí)了脂肪組織細(xì)胞膜蛋白卵黃抗體可抑制前脂肪細(xì)胞增殖、影響脂肪細(xì)胞脂肪的合成、誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞凋亡，為IgY抗體用于肥胖病的治療提供了依據(jù)。

4 IgY診斷試劑和治療制劑的研發(fā)

隨著對IgY研究與應(yīng)用的進(jìn)行，關(guān)于IgY的專利和制劑也逐漸增多。Skriner K[27]申請了IgY應(yīng)用于腹腔疾病治療的專利。張龍現(xiàn)等[28]申請了一種防治貝氏隱孢子蟲引起的原發(fā)病的卵黃免疫球蛋白生物制劑和增強(qiáng)免疫功能的卵黃免疫球蛋白保健品的專利，制備的抗貝氏隱孢子蟲病的特異性IgY可直接作用于貝氏隱孢子蟲，發(fā)揮特異性抑制作用。索勛等[29]申請了一種IgY相關(guān)發(fā)明專利，此發(fā)明構(gòu)建了禽流感病毒H9N2亞型的HA1基因片段和雞IgY分子Fc基因片段的融合基因，并將融合基因轉(zhuǎn)染到艾美耳球蟲中得到轉(zhuǎn)基因球蟲，通過口服方式接種轉(zhuǎn)基因球蟲來提高雞群針對禽流感特異性抗原的免疫反應(yīng)。徐永平等[30]申請了抗黃海希瓦氏菌卵黃抗體及其制備方法方面的專利，該專利主要是獲得了特異性好、效價高的用于防治黃海希瓦氏菌引起的疾病和免疫學(xué)檢測的抗黃海希瓦氏菌卵黃抗體。

5 結(jié)語

目前的研究顯示了IgY在寄生蟲、細(xì)菌和病毒等病原感染和相應(yīng)免疫檢測及治療應(yīng)用的良好前景。鑒于卵黃抗體是一種廉價、安全有效、易獲得的抗體，不存在殘留和耐藥問題，且在治療相應(yīng)疾病方面具有安全、高效無公害的優(yōu)點(diǎn)。因此，在IgY相關(guān)制劑的開發(fā)和疾病防治方面的應(yīng)用前景將會越來越廣闊，極有可能成為一類普遍應(yīng)用的生物制劑。當(dāng)然，這一領(lǐng)域也存在一些問題。首先，卵黃抗體可能帶有未知病原，對養(yǎng)禽業(yè)存在潛在的威脅，用于禽類疾病治療時尤其需要注意；其次，卵黃抗體的穩(wěn)定性也有待加強(qiáng)，這就需要對制劑的劑型進(jìn)一步研究，開發(fā)出性質(zhì)穩(wěn)定、效果可靠的不同類型制劑來滿足檢測或治療的需求；再者，卵黃抗體生產(chǎn)還未形成標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)程，尤其是應(yīng)用于治療的IgY制品，應(yīng)當(dāng)制定嚴(yán)格的產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，防止通過IgY制劑造成的潛在疾病感染和傳播。隨著IgY研究與應(yīng)用的發(fā)展，相信未來會有更多更好的IgY產(chǎn)品或制劑應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)和人類的衛(wèi)生保健中。

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Advance in IgY Application on Immunodetection and Disease Treatment

ZHANG Lu,LIU Zhen-zhen,NING Chang-shen,JIAN Fu-chun

(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou,Henan,450002,China)

Immunoglobulin of egg yolk is the major antibody existed in the egg yolk in birds,reptiles,amphibia with a strong immune function.The molecular structure and physicochemical property of IgY are reviewed briefly,an overview on IgY application in immune detection such as parasites(Toxoplasma,schistosome and coccidia),bacteria(enterotoxigenicE.coli),virus(influenza virus B and rabies virus),residual antibiotics(kanamycin and gentamicin) and related disease treatment were presented (such as chicken coccidiosis,colibacillosis in piglets,eels vibrio and Liston's disease,rotavirus diseases).Some problems existed in application were also indicated in this paper,such as unknown possible pathogens in egg yolk,no correspondent production standard and IgY stability can not satisfied the requirement in store and use,and so on.With characteristics of safe,efficient,pollution-free,IgY could be widely and effectively used in disease detection and prevention.

immunoglobulin of egg yolk; immunoassay; treatment

2016-07-04

國家現(xiàn)代肉羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(nycytx-39)；國家自然科學(xué)基項(xiàng)目(31172311)

張 璐(1991-)，女，河南開封人，碩士研究生，主要從事原蟲病分子及免疫診斷研究。*通訊作者

S852.43

A

1007-5038(2017)01-0078-04