一種高選擇性的硫化氫比率探針

丁 靜, 葛海燕, 葛燕青, 王玉民, 李艷玲

(1. 泰山醫(yī)學院 化工學院, 泰安 271016; 2. 泰山醫(yī)學院 生命科學學院, 泰安 271016)

一種高選擇性的硫化氫比率探針

丁 靜1, 葛海燕1, 葛燕青1, 王玉民1, 李艷玲2

(1. 泰山醫(yī)學院 化工學院, 泰安 271016; 2. 泰山醫(yī)學院 生命科學學院, 泰安 271016)

近些年來的研究表明,硫化氫(H2S)作為繼一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后的第三種氣體信使分子[1-2],在生物體的各種生理、病理過程中都起著重要的作用,比如調(diào)控炎癥、控制血壓、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)等[3-4]。此外,細胞內(nèi)H2S含量的變化還會引起一些疾病,如阿爾茨海默癥、唐氏綜合癥、糖尿病和肝硬化[5-7]。因此,發(fā)展具有高選擇性和高靈敏度檢測H2S的方法具有重要意義,并能為學術(shù)研究和臨床應(yīng)用提供有用的信息。

目前,主要的檢測H2S方法有電化學分析法、分光光度法、化學發(fā)光法和氣相色譜法[8-12]等。分子探針由于具有選擇性高、靈敏度高、操作簡便和能實時原位檢測等優(yōu)勢[13-14],近年來受到人們的廣泛關(guān)注。而這些探針大多是以單波長熒光強度變化進行檢測,這種方法有著自身不可克服的缺點,即在定量分析時易受到多種因素的影響,如探針的穩(wěn)定性、濃度,待測試體系的酸度、溫度,檢測儀器的穩(wěn)定性等,致使分析結(jié)果的準確度下降。而比率探針在與目標分析物作用時自身能夠產(chǎn)生兩個不同波長的熒光,基于兩波長處熒光強度或吸收強度的比值隨目標分析物的濃度改變而變化來定量檢測目標分析物。由于兩波長處強度相對變化的自參比作用能夠有效地消除其他因素的干擾,比率探針定量檢測的準確度更高[15-16]。本工作基于H2S和C=C之間的親核加成反應(yīng)設(shè)計合成一種新的H2S比率探針,其合成及其與H2S作用機理見圖1。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

島津UV-2450型紫外-可見分光光度計;Bruker 400 MHz型核磁共振儀;島津LC-MS 2010A型液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀;pHS-25B型pH酸度計。

圖1 H2S探針的合成及作用機理Fig. 1 Synthesis and proposed mechanism of the probe for H2S

所用試劑均為分析純,試驗用水為超純水。

1.2 探針的合成

稱取碘化1,2-二甲基吡啶鹽0.235 g(1.0 mmol)和4-硝基苯甲醛0.31 g于50 mL圓底燒瓶中,加入正丁醇20 mL,加催化劑用量哌嗪,混合溶液加熱至回流,反應(yīng)40 min。將反應(yīng)溶液冷卻至室溫,待大量固體析出,減壓抽濾,用正丁醇重結(jié)晶,得0.230 g橘紅色固體,產(chǎn)率62.5%。核磁共振和質(zhì)譜表征表明產(chǎn)物為探針碘化1-甲基-2-(4-硝基)苯乙烯基吡啶鹽。

1.3 試驗方法

稱取探針0.003 7 g溶于二甲基甲酰胺中,轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中,用二甲基甲酰胺定容,配成1.0×10-4mol·L-1溶液。在若干10 mL比色管中加入探針溶液1.00 mL、pH 7.4的PBS緩沖溶液100 mL、不同體積(0～700 μL)的0.01 mol·L-1Na2S溶液,用水定容至10 mL。放置10 min,測定其紫外-可見吸收光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外光譜特性

在pH 7.4的PBS緩沖溶液中,10 μmol·L-1的探針及其與不同量的Na2S作用后的紫外-可見吸收光譜見圖2。

曲線1～11所對應(yīng)的Na2S的濃度分別為0,50,100,200,300,400,450,500,550,600,700 μmol·L-1圖2 探針(10 μmol·L-1)與不同量的Na2S作用后的紫外-可見吸收光譜Fig. 2 UV-vis absorption spectra of probe (10 μmol·L-1) reacting with different amount of Na2S

由圖2可知:沒有加入Na2S時探針在339 nm處有較強吸收,當加入不同量的Na2S時,探針在339 nm處的吸收帶逐漸降低,而在244 nm處出現(xiàn)一個新的吸收帶且逐漸增強。這一現(xiàn)象表明加入Na2S后,H2S與探針分子中的C=C發(fā)生了加成反應(yīng),導致整個探針分子的共軛程度降低使吸收峰發(fā)生藍移。

2.2 探針與硫化氫的反應(yīng)機制

為了理解探針和H2S的作用機理,在pH 7.4的PBS緩沖溶液中,將加入Na2S的探針溶液進行質(zhì)譜分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)化合物1的m/z=402。因此,最有可能的反應(yīng)機制見圖1中的加成反應(yīng)。

2.3 反應(yīng)時間的選擇

響應(yīng)時間是一個重要的因素,特別是在生物體系內(nèi)的快速代謝。探針在加入Na2S后吸收強度比(A244 nm/A339 nm)隨反應(yīng)時間的變化曲線見圖3。

圖3 探針(10 μmol·L-1)加入Na2S(400 μmol·L-1)后吸收強度比(A244 nm/A339 nm)隨時間的變化Fig. 3 Absorption intensity ratio (A244 nm/A339 nm) of probe (10 μmol·L-1) over time after the addition of Na2S (400 μmol·L-1)

由圖3可知:反應(yīng)剛開始時吸收強度比(A244 nm/A339 nm)迅速增加,在6 min之后吸收強度比變化很小,8 min后探針和Na2S的反應(yīng)已經(jīng)基本完成。試驗選擇探針與Na2S反應(yīng)10 min之后進行測定。

2.4 靈敏度測試

試驗考察了探針對不同濃度Na2S溶液作用后的吸收強度比,結(jié)果見圖4。

圖4 探針的吸收強度比(A244 nm/A339 nm)與Na2S濃度的關(guān)系Fig. 4 Relationship between absorption intensity ratio(A244 nm/A339 nm) of probe and Na2S concentration

由圖4可知:隨著Na2S的濃度從0增加至700 μmol·L-1,探針的吸收強度比(A244 nm/A339 nm)與Na2S濃度呈線性關(guān)系,線性回歸方程為A244 nm/A339 nm=0.001 2c+0.178 4,相關(guān)系數(shù)為0.993 5,檢出限為13 μmol·L-1。因此,探針可定量測定H2S。

2.5 選擇性試驗

選擇性是評價一個探針性能的重要參數(shù)。試驗考察了K+、Cl-、Mg2+、SO42-、NO2-、谷胱甘肽(GSH)、半胱氨酸(Cys)、亮氨酸(Glu)、脯氨酸(Pro)和谷氨酸(Leu)對檢測的影響,結(jié)果見圖5。

曲線1～10所對應(yīng)的分析物分別為K+、Cl-、Mg2+、SO42-、NO2-(1 200 μmol·L-1);GSH、Cys、Glu、Pro、Leu(800 μmol·L-1)圖5 在pH 7.4的PBS緩沖溶液中探針對不同分析物的紫外-可見吸收光譜Fig. 5 UV-vis absorption spectra of probe toward various analytes in PBS with pH 7.4

由圖5可知,探針對H2S具有很好的選擇性。半胱氨酸和谷胱甘肽作為還原性硫醇分子,可能對探針檢測H2S的選擇性造成較大影響,但是,結(jié)果顯示半胱氨酸和谷胱甘肽對探針幾乎沒有影響,這可能是因為半胱氨酸和谷胱甘肽比H2S有更大的空間位阻效應(yīng)。因此,探針可用于生理條件下的H2S檢測。

2.6 合成樣品分析

在試驗條件下對含干擾物質(zhì)的H2S合成樣品進行測定,結(jié)果見表1。結(jié)果表明,本方法適用于H2S的檢測。

本工作基于H2S和C=C之間的親核加成反應(yīng)設(shè)計并合成了一種H2S比率探針。探針與H2S的響應(yīng)速率較快(8 min內(nèi)完成)且對H2S具有很高的選擇性,不易受常見離子和還原性硫醇的影響,具有較高的靈敏度。

表1 H2S合成試樣測定結(jié)果(n=3)Tab. 1 Determination results of synthetic H2S samples

[1] LI L, ROSE P, MOORE P K. Hydrogen sulfide and cell signaling[J]. Annu Rev Pharmacol, 2011,51(1):169-187.

[2] KABIL O, BANERJEE R. Redox biochemistry of hydrogen sulfide[J]. J Biol Chem, 2010,285(29):21903-21907.

[3] NICHOLSON C K, CAIVERT J W. Hydrogen sulfide and ischemia-reperfusion injury[J]. Pharmacol Res, 2010,62(4):289-297.

[4] ABE K, KIMURA H. The possible role of hydrogen sulfide as an endogenous neuromodulator[J]. J Neurosci, 1996,16(3):1066-1071.

[5] YANG W, YANG G D, JIA X M, et al. Activation of KATP channels by H2S in rat insulin-secreting cells and the underlying mechanisms[J]. J Physiol, 2005,569(2):519-531.

[6] ETO K, ASADA T, ARIMA K, et al. Brain hydrogen sulfide is severely decreased in Alzheimer's disease[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2002,293(5):1485-1488.

[7] DING J, GE Y Q, ZHU B C. A highly selective fluorescent probe for quantitative detection of hydrogen sulfide[J]. Analytical Sciences, 2013,29(12):1171-1175.

[8] LAWRENCE N S, DEO R P, WANG J. Electrochemical determination of hydrogen sulfide at carbon nanotube modified electrodes[J]. Anal Chim Acta, 2004,517(1/2):131-137.

[9] DOELLER J E, ISBELL T S, BENAVIDES G, et al. Polarographic measurement of hydrogen sulfide production and consumption by mammalian tissu[J]. Analytical Biochemistry, 2005,341(1):40-51.

[10] 鄭揚,廖鋒,杜軍保,等.改良亞甲基藍法測定血漿硫化氫[J].生理學報, 2012,64(6):681-686.

[11] ZHAO Y Z, ZHU X H, KAN H, et al. A highly selective colorimetric chemodosimeter for fast and quantitative detection of hydrogen sulfide[J]. Analyst, 2012,137(10),5576-5580.

[12] 劉春霞,馬興,魏國華,等.一種基于熒光素的高選擇性硫化氫熒光探針[J].環(huán)境化學, 2014,33(10):1762-1767.

[13] VALEUR B. Molecular fluorescence: principles and applieations [M]. Weinheim: Wiley-VCH Verlag GmbH, 2001:273-350.

[14] CALLAN J F, DE SILVA A P, MAGRI D C. Lumineseent sensors and switehes in the early 21st century[J]. Tetrahedron, 2005,61(36):8551-8588.

[15] XUE L, LIU Q, JIANG H. Ratiometric Zn2+fluorescent sensor and new approach for sensing Cd2+by ratiometric displacement[J]. Organic Letters, 2009,11(15):3454-3457.

[16] XU Z C, YOON J, SPRING D R. A selective and ratiometric Cu2+fluorescent probe based on naphthalimide excimer-monomer switching[J]. Chemical Communication, 2010,46(15):2563-2565.

10.11973/lhjy-hx201703020

2016-03-27

國家自然科學基金資助項目(81403036,31370575- 1);山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計劃項目(2013ws0318)

O657.3

B

1001-4020(2017)03-0342-04