miR-34a通過Notch信號通路影響乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為

王雷

(河南大學(xué)附屬淮河醫(yī)院甲狀腺乳腺外科，河南 開封 475001)

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研究報告

miR-34a通過Notch信號通路影響乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為

王雷

(河南大學(xué)附屬淮河醫(yī)院甲狀腺乳腺外科，河南 開封 475001)

目的探討miR-34a通過Notch信號通路影響乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。方法乳腺癌細(xì)胞MCF-7分為miR-34a及Control組，分別利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染miR-34a mimics及miR-34a NC，RT-PCR法檢測細(xì)胞中miR-34a表達(dá)，MTT、Hoechst染色及transwell法分別檢測細(xì)胞活力、凋亡及侵襲情況；western blot檢測細(xì)胞中Notch1，Notch2，Dll1及Jagged-1蛋白表達(dá)情況。結(jié)果與Control組比較，miR-34 mimics組中miR-34a表達(dá)量上調(diào)，細(xì)胞皺縮，變圓變亮，細(xì)胞活力降低(P<0.01)，細(xì)胞凋亡率顯著提高(P<0.01)，細(xì)胞侵襲數(shù)目減少(P<0.01)，Notch1，Notch2，Dll1及Jagged-1蛋白表達(dá)量都顯著降低(P<0.01)。結(jié)論miR-34a mimics通過抑制Notch信號通路進(jìn)而誘導(dǎo)MCF-7乳腺癌細(xì)胞凋亡并抑制其侵襲。

miR-34a；Notch信號通路；乳腺癌細(xì)胞MCF-7；apoptosis；侵襲

乳腺癌是常見的女性惡性腫瘤之一，其死亡率均女性惡性腫瘤第二位，且死亡率在全國甚至全世界范圍均呈上升趨勢[1-2]。近年來隨著化療，放療及生物技術(shù)手段的普及，乳腺癌患者的預(yù)后得到很大改善，但其發(fā)病率及難治率還是居高不下，因此尋找有效的診斷及治療方法一直是乳腺癌等腫瘤研究的重點[3-4]。Notch是美國著名遺傳學(xué)家Thomas于1917年在果蠅的研究中發(fā)現(xiàn)并命名的，并于1980年克隆成功。Notch信號通路包括Notch受體(Notch1，Notch2，Notch3，Notch4)，Dell-like配體(Dell1，3,4)及Jagged配體(Jagged-1，Jagged-2)。研究已經(jīng)表明Notch信號通路的異常表達(dá)與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，同時針對Notch信號通路的抑制劑或單克隆抗體已逐漸應(yīng)用于乳腺癌的治療中[5-7]。

miRNA是一類內(nèi)源性非編碼的RNA分子，長度約為19-23 nt，能與下游靶基因mRNA的3’端非編碼區(qū)結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄，最終影響細(xì)胞的生物學(xué)行為。研究已經(jīng)表明Notch1是miR-34a的下游靶基因之一，miR-34a能通過負(fù)性調(diào)控Notch1表達(dá)進(jìn)而抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞，膀胱癌細(xì)胞T24細(xì)胞的增殖[8-9]。而miR-34a是否能夠通過負(fù)性調(diào)控Nothc1表達(dá)，同時調(diào)控Notch信號通路其它蛋白表達(dá)進(jìn)而影響乳腺癌MCF-7細(xì)胞生物學(xué)行為還尚未見報道，因此本研究將探討miR-34a對乳腺癌MCF-7細(xì)胞生物學(xué)行為及Notch信號通路的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株

人乳腺癌細(xì)胞MCF-7購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.1.2 試劑

兔抗Notch1，Notch2，Dll1及Jagged-1多克隆抗體(美國Abcam公司)；四甲基偶氮唑鹽(美國Gibco公司)；胎牛血清，transwell試劑盒(美國Hyclone公司)；小鼠抗GAPDH單克隆抗體，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)，BCA試劑盒，Hoechst 33258染色試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)；LipofectamineTM2000，trizol試劑盒，一步法RT-PCR試劑盒(大連寶生生物有限公司)；miR-34a mimics及miR-34a NC(廣州市銳博生物科技有限公司)。

1.1.3 儀器

迷你雙垂直電泳儀，迷你轉(zhuǎn)印電泳儀(北京六一儀器廠)；ChemiDocTM XRS凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；TS100倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；SMA2000型微量紫外分光光度計(美國Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

當(dāng)MCF-7細(xì)胞匯合度達(dá)到50%左右時候，利用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒分別轉(zhuǎn)染miR34a NC(Control)、miR-34a mimics，6 h以后換成含10%血清的DMEM培養(yǎng)基；37℃，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。應(yīng)用RT-PCR檢測細(xì)胞中miR-34a的表達(dá)。

1.2.2 RT-PCR檢測細(xì)胞中miR-34a表達(dá)

參考trizol試劑盒使用說明書提取總RNA，并用微量紫外分光光度計檢測RNA的純度，通過一步法RT-PCR試劑盒將逆轉(zhuǎn)錄RNA，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后將擴(kuò)增產(chǎn)物用于2%的瓊脂糖膠電泳。引物分別加入25 μL PCR反應(yīng)體系中，反應(yīng)條件為94℃變性45 s，59℃復(fù)性45 s，72℃延伸60 s，共35個循環(huán)。

1.2.3 MTT法檢測細(xì)胞活力

將MCF-7細(xì)胞接種于96孔板，按“1.2.1”進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分別培養(yǎng)24、48、72、96 h后，于倒置顯微鏡下拍照，接著加入20 μL終濃度為5 mg/mL 的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，將上清液舍棄，并每孔加入150 μL的二甲基亞砜，震蕩使結(jié)晶物充分溶解，于酶標(biāo)儀560 nm處測OD值，OD值即代表細(xì)胞活力。

1.2.4 Hoechst染色檢測細(xì)胞凋亡

將MCF-7細(xì)胞接種于6孔板，按“1.2.1”進(jìn)行轉(zhuǎn)染。48 h后用不含EDTA的胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，后按照Hoechst 33258染色試劑盒說明書進(jìn)行操作，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌3次，加入Hoechst 33258染色液避光染色15 min，PBS洗滌3次，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 transwell法檢測細(xì)胞侵襲能力

將基質(zhì)膠均勻平鋪于Transwell小室的微膜(8 μm)上，制成凝膠備用。將MCF-7細(xì)胞接種于6孔板，按“1.2.1”進(jìn)行轉(zhuǎn)染。48 h后，將消化下來的細(xì)胞接種到Transwell上室，而下室加入含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取出Transwell小室，洗滌，下室用多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，倒置光學(xué)顯微鏡下計數(shù)5個視野穿膜細(xì)胞個數(shù)，計算平均每個視野的細(xì)胞數(shù)，即表示細(xì)胞的侵襲能力。每組實驗重復(fù)3次。

1.2.6 Western blot檢測細(xì)胞中Notch1蛋白表達(dá)

將MCF-7細(xì)胞接種于6孔板，按“1.2.1”進(jìn)行轉(zhuǎn)染，48 h收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，裂解30 min后，離心收集上清液，即可獲得總蛋白。采用BCA試劑盒測定蛋白濃度。蛋白變性，上樣，進(jìn)行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳1-2 h，后濕法轉(zhuǎn)膜30-50 min。將膜浸入一抗溶液(兔抗Notch1、Notch2，Dll1及Jagged-1多克隆抗體，小鼠抗GAPDH單克隆抗體，稀釋比例：1∶100)孵育，4℃過夜；次日二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)，稀釋比例：1∶200)室溫孵育1 h。并在膜上滴加化學(xué)曝光液，于凝膠成像系統(tǒng)中曝光。用“Quantity one”軟件分析各抗體條帶灰度值。

1.2.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-34a轉(zhuǎn)染效果的檢測

如圖1所示，與對照組比較，miR-34a mimics組中miR-34a表達(dá)量顯著提高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 miR-34a mimics對MCF-7細(xì)胞活力的影響

如圖2所示，在作用24、48、72、96 h時，與對照組比較，miR-34a mimics組細(xì)胞活力顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。且在48、72、96 h時作用強度一致，因此選擇48 h作為后續(xù)研究作用時間。同時在48 h倒置顯微鏡下觀察到miR-34a mimics組較對照組細(xì)胞皺縮，變圓變亮(圖3)。

圖3 miR-34a mimics對MCF-7細(xì)胞形態(tài)的影響(×20)Fig.3 Effect of miR-34a mimics on MCF-7 cell morphology(×20)

2.3 miR-34a mimics對MCF-7細(xì)胞凋亡情況的影響

如圖4，Hoecsht染色結(jié)果所示，與對照組(3.73±0.37)比較，miR-34a mimics組(39.98±4.03)細(xì)胞凋亡率顯著提高，差異具統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖4 miR-34a mimics對MCF-7細(xì)胞凋亡情況的影響(×20)Fig.4 Effect of miR-34a mimics on MCF-7 cell apoptosis (×20)

2.4 miR-34a mimics對MCF-7細(xì)胞遷移侵襲能力的影響

如圖5，transwell染色結(jié)果所示，與對照組(128.42±10.35)比較，miR-34a mimics組(35.71±3.58)細(xì)胞凋亡率顯著提高，差異具統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖5 miR-34a mimics對MCF-7細(xì)胞遷移侵襲能力的影響(×20)Fig.5 Effect of miR-34a mimics on MCF-7 cell invasion viability (×20)

2.5 miR-34a mimics對MCF-7細(xì)胞中Notch信號通路的影響

如圖6所示，與對照組比較，miR-34a mimics組中Notch1、Notch2，Dll1及Jagged-1表達(dá)量顯著降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖6 miR-34a mimics對MCF-7細(xì)胞中Notch信號通路的影響，與對照組比較，**P<0.01。Fig.6 Effect of miR-34a mimics on Notch signal pathway in MCF-7 cell, compared with control group, **P<0.01.

3 討論

自1993年Ambros和Ruvkun在秀麗線蟲中第一次發(fā)現(xiàn)miRNA，即lin-4，科學(xué)家對于miRNA的研究已有二十幾年時間了，總共發(fā)現(xiàn)了6000多種的miRNA分子，在人類基因上就發(fā)現(xiàn)了600多種的miRNA。研究發(fā)現(xiàn)miRNA通過結(jié)合于其靶基因mRNA的3’-UTR區(qū)域，通過調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄，參與多種腫瘤細(xì)胞的生長，增殖，凋亡，分化，遷移，侵襲及血管生成等生物學(xué)行為[10-11]。miR-34a是其中一類被認(rèn)為具有抑癌基因作用的miRNA，廣泛存在于節(jié)肢動物及哺乳動物之中，包括三個同源基因，miR-34a，miR-34b，miR-34c。后兩種miRNA除了表達(dá)于肺組織外，其它正常組織中幾乎不表達(dá)，而miR-34a幾乎表達(dá)于所有正常組織中，所以常作為miR-34家族典型miRNA進(jìn)行研究探討[12]。研究表明miR-34a不僅僅在乳腺癌中低表達(dá)或缺失，在肺癌，肝癌，卵巢癌，膀胱癌，結(jié)腸癌等組織中表達(dá)量均處于下調(diào)狀態(tài)甚至缺失，所以miR-34a被認(rèn)為是乳腺癌，卵巢癌等多種腫瘤發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的有效檢測指標(biāo)[13-15]。

1917年美國著名遺傳學(xué)家Thomas在研究果蠅功能時發(fā)現(xiàn)果蠅部分功能缺失導(dǎo)致果蠅翅膀邊緣產(chǎn)生缺口，因此將造成此缺口的基因命名為Notch，并于1980克隆成功。此信號通路包括4種受體(Notch1，Notch2，Notch3，Notch4)，2類配體，分別為Delta-like樣配體(Dll1，Dll3及Dll4)及Serrate樣配體(Jagged-1，Jagged-2)。Notch信號通路通過其受體配體結(jié)合并擴(kuò)大信號傳遞，使相鄰細(xì)胞間分子之間產(chǎn)生差異，最終決定了乳腺癌、卵巢癌等多種腫瘤細(xì)胞的命運，在乳腺癌、卵巢癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。研究顯示在乳腺癌中Notch信號通路異常激活，而針對此信號通路的抑制劑如γ-分泌酶抑制劑或者單克隆抗體聯(lián)合化療已在逐步的用于乳腺癌的治療當(dāng)中[5-7]。

同時研究也顯示Notch信號通路的受體之一Notch1是miR-34a的靶基因之一，miR-34a過表達(dá)后能通過下調(diào)Notch1表達(dá)從而抑制膀胱癌細(xì)胞，結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖[8-9]。此外Li等[16]研究也表明miR-34a過表達(dá)不僅能下調(diào)Nothc1表達(dá)，也能下調(diào)Notch2表達(dá)，同時還能調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)，從而抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。Pang等[17-18]研究表明miR-34a mimics通過下調(diào)Notch1，Dll1及Jagged-1表達(dá)，進(jìn)而抑制絨毛膜癌細(xì)胞BeWo及JEG-3的增殖及侵襲，并利用siRNA Notch1及Dll1單克隆抗體進(jìn)一步驗證了miR-34a對細(xì)胞增殖侵襲的抑制作用，至少部分抑制作用是通過Notch1及Dll1實現(xiàn)的。所以本研究將在此基礎(chǔ)上探討miR-34a是否也能夠通過Notch信號通路影響乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖，凋亡與侵襲。首先本研究利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染miR-34a mimics及miR-34a NC，并采用RT-PCR證實了轉(zhuǎn)染的成功。接著MTT法檢測了miR-34a mimics在24、48、72、96 h對MCF-7細(xì)胞活力的影響，結(jié)果表明隨著作用時間的推移，miR-34a mimics能顯著的降低MCF-7細(xì)胞活力，不過在48、72、96 h時候抑制程度趨向一致，因此選為后續(xù)實驗時間。接著采用Hoechst染色進(jìn)一步驗證了miR-34a mimics對MCF-7細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用，與miR-34a mimics在其它腫瘤細(xì)胞中的作用效果一致[8, 9]。另外transwell結(jié)果也顯示miR-34a mimics能顯著的抑制MCF-7細(xì)胞的侵襲能力。最后通過western blot檢測miR-34a mimics對MCF-7細(xì)胞中Notch信號通路的影響，結(jié)果表明miR-34a mimics能顯著的下調(diào)Notch1，Notch2，Dll1及Jagged-1表達(dá)，與Pang等[17-18]研究結(jié)果一致，從而提示miR-34a mimics能通過抑制Notch信號通路從而誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡，并抑制細(xì)胞增殖及侵襲。

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Effect of miR-34a on the biological behavior of breast cancer cell by Notch signal pathway

WANG Lei

Thyroid and breast surgery, Huaihe Hospital Affiliated to Henan University,Kaifeng,Henan,475001 China

Objective To explore effect of miR-34a on the biological behavior of breast cancer cell MCF-7 by Notch signal pathway. Methods The MCF-7 cells were divided into miR-34a and Control groups. The miR-34a mimics and miR-34a NC were transfected by liposome. The expression of miR-34a in MCF-7 cell was examed by RT-PCR. The cell viability was detected by MTT. The cell apoptosis was examed by Hoechst staining. The cell invasion was detected by transwell method. The expression of Nothch1, Nothc2, Dll1 and Jagged-1 was detected by western blot. Results Compared with Control group, the expression of miR-34a was up-regulated (P<0.01), Cell shrinkage, rounded brighten，the cell viability was decreased (P<0.01), cell apoptotic rate was increased (P<0.01), cell invasion number was reduced (P<0.01), the expression of Notch1, Nothc2, Dll1 and Jagged-1 was down-regulated (P<0.01). Conclusion miR-34a mimics induced MCF-7 cell apoptosis and inhibited cell invasion via inhibition of Notch signal pathway.

miR-34a; Notch signal pathway; breast cancer cell MCF-7; apoptosis; invasion

王雷(1982-)，男，研究方向：甲狀腺乳腺外科，E-mail:54206653@qq.com。

R-332

A

1671-7856(2016)11-0061-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.11.011

2016-07-28