自發(fā)性高血壓大鼠心肌組織microRNA-97a與TGF-β 1蛋白表達(dá)的改變及意義

鄭 婧

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴陽 550001)

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研究報(bào)告

自發(fā)性高血壓大鼠心肌組織microRNA-97a與TGF-β 1蛋白表達(dá)的改變及意義

鄭 婧

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴陽 550001)

目的觀察 Micro RNA-97a(miRNA-97a)與TGF-β 1蛋白在自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)心肌組織中的表達(dá)改變和關(guān)系。方法取8只8周齡雄性自發(fā)性高血壓大鼠為 SHR 組，8只8周齡雄性 Wistar大鼠為對(duì)照組，通過無創(chuàng)血壓測(cè)量分析系統(tǒng)測(cè)大鼠尾動(dòng)脈血壓，8 周后股動(dòng)脈放血處死大鼠，HE染色觀察大鼠心臟形態(tài)學(xué)改變,PCR法檢測(cè)大鼠心臟中miRNA-97a的表達(dá)，Western blot 檢測(cè)TGF-β1、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)蛋白和I 型膠原(Col-Ⅰ)和Ⅲ型膠原(Col-Ⅲ)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果SHR組的收縮壓和舒張壓明顯升高，心肌CVF 和 PVCA 明顯升高，TGF-β 1 蛋白，Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白的表達(dá)水平明顯升高，miRNA-97a表達(dá)水平明顯降低，與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 01)。PCR結(jié)果顯示，SHR 組心肌 miRNA-97a 表達(dá)水平為對(duì)照組的(24. 6 ±4. 7)%，SHR 組心肌組織miRNA-97a與TGF-β 1 蛋白表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0. 785，P<0. 01)。結(jié)論SHR心肌組織 miRNA-97a表達(dá)下調(diào)，伴隨 TGF-β 1 蛋白表達(dá)升高和膠原合成增加。miRNA-97a 與TGF-β 1 可能參與 SHR 大鼠的心肌纖維化。

Micro RNA-97a; 轉(zhuǎn)化生長因子β 1; 自發(fā)性高血壓大鼠; 心肌纖維化

高血壓，冠心病等疾病在心內(nèi)科最常見[1-2]。這兩年有報(bào)道，微小核糖核酸(microRNA)可以通過對(duì)基因轉(zhuǎn)錄后控制基因表達(dá)調(diào)控方式[3]。也有研究說明miRNA參與心肌纖維化和動(dòng)脈硬化等病理過程[4]。最近一段時(shí)間，有不少的醫(yī)務(wù)工作者稱microRNA的重要成員之一miRNA-97a與心肌重構(gòu)關(guān)系密切，很有可能成為高血壓、冠心病等疾病的一個(gè)新的治療靶點(diǎn)[5-6]。目前為止，我們對(duì)于miRNA-97a在心血管重構(gòu)中的作用及機(jī)制沒有完全清楚。本次研究探討了SHR大鼠心肌組織microRNA-97a與TGF-β1蛋白表達(dá)的改變及意義。

1 材料和方法

1.1 試劑及儀器

表1 試劑和儀器Tab.1 Reagent and instrument

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及血壓測(cè)定

8周齡雄性 SHR16 只和Wistar 大鼠8只，均購自中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心【SCXK(粵) 2011-0034】，體質(zhì)量230 ± 15 g，所有大鼠均在貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室【SYXK(黔) 2012-0001】的清潔環(huán)境下飼養(yǎng)觀察。將SHR大鼠隨機(jī)分為 SHR 卡托普利組(SHR 干預(yù)組，n=8)、SHR 對(duì)照組(n=8)，Wistar大鼠為正常對(duì)照組;分別給予SHR大鼠卡托普利(中美上海施貴寶制藥有限公司)10 mg/(kg·d)和蒸餾水灌服，共持續(xù)8周。成功制作SHR干預(yù)組和SHR對(duì)照組大鼠模型。

1.3 大鼠心肌組織 Masson 染色和SP法觀察TGF-β 1 蛋白表達(dá)

采用免疫組織化學(xué)SP法，取出蓋玻片上用于免疫組化的大鼠心肌組織，0.01molPL PBS 漂洗2 次,并予4% 甲醛溶液固定，石蠟包埋切片，并行脫蠟、水化, 對(duì)部分切片進(jìn)行PBS沖洗并加聚合物增強(qiáng)劑和大鼠抗人 TGF-β1多克隆抗體等試劑,在室溫下孵化,最后加入DAB顯色液, 用蘇木素復(fù)染色,并用中性樹脂封片。封片完畢后將切片放置顯微鏡下觀察 TGF-β1在兩組大鼠心肌細(xì)胞中的表達(dá)情況, 陽性顯色為棕黃色。另一部分石蠟切片常規(guī)脫蠟后行Masson 膠原染色。每張切片任選 3 支小動(dòng)脈，測(cè)量血管周圍膠原面積比率(PVCA )。

1. 4 Western Blot 檢測(cè) TGF-β1、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ 蛋白表達(dá)水平

提取大鼠心臟組織的總蛋白，在100℃加熱 10 min 以使蛋白質(zhì)變性。電泳，蛋白轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜，5% 的脫脂奶粉封閉 2 h，加入TGF-β1、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ等一抗，4℃孵育過夜，選擇TGF-β1、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ等酶標(biāo)二抗和稀釋濃度，孵育 1 h，洗膜后化學(xué)發(fā)光，拍照，分析顯影條帶。

1.5 Real-time PCR 檢測(cè)miRNA-97a表達(dá)水平

根據(jù)其mRNA 序列,設(shè)計(jì)引物。miRNA-97a引物:上游:5′ -TAC CCT ACT ACC AAT ATT-3′;下游:5′ -CCT TTC CAT CTT CCT TCG ATT-3′;產(chǎn)物長度:327 bp。AngⅡ引物:上游:5′ -ATCGGGACC AAT CAC ACT ACA -3′; 下游:5′ -CGT CTC TTCCGG CTG CTT CAA-3′;產(chǎn)物長度: 216 bp。擴(kuò)增產(chǎn)物2% , 瓊脂糖凝膠電泳, 凝膠分析系統(tǒng)測(cè)定各條帶積分光密度值。采用2-ΔΔCt 方法對(duì)實(shí)時(shí)定量 PCR 結(jié)果進(jìn)行分析,顯示miRNA-137、AngⅡRNA 的表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠血壓和心肌膠原含量的變化

與對(duì)照組比較，SHR組大鼠的收縮壓和舒張壓明顯升高，TGF-β 1 蛋白，Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白的表達(dá)水平明顯升高，miRNA-97a表達(dá)水平明顯降低(P<0. 01)(表2)。

表2 兩組大鼠的資料與心肌膠原含量的變化(mean ± SD. n=10)Tab.2 Information and myocardial collagen changes of two groups

2.2 兩組大鼠心肌組織 Masson 染色結(jié)果

SHR 組大鼠心肌細(xì)胞間可見大量藍(lán)色膠原纖維沉積，細(xì)胞數(shù)量減少，體積增大，細(xì)胞排列紊亂，對(duì)照組大鼠可見紅色心肌細(xì)胞間隙散在少量藍(lán)色膠原纖維，細(xì)胞排列整齊緊密，數(shù)量，體積大致正常(圖1)。

注：A:對(duì)照組;B :SHR組。

2.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大鼠心肌組織 TGF-β 1 蛋白表達(dá)

TGF-β 1主要在成纖維細(xì)胞表達(dá)，分布在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞間隙，SHR 組心肌可見 TGF-β 1 大量表達(dá)，對(duì)照組心肌有僅有少量TGF-β 1 表達(dá)(圖 2)。SHR組心肌TGF-β 1 蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(1. 29±0.22vs 0. 70±0. 11，P<0. 01)。

2.4 Real-time PCR檢測(cè)大鼠心肌組織 miRNA-97a 表達(dá)

SSHR組心肌 miRNA-97a 表達(dá)水平為對(duì)照組的 (24. 6 ±4. 7)%，其 miRNA-97a 表達(dá)水平較對(duì)照組明顯降低(P<0. 01)，

2.5 組間 TGF-β1，Smad3 蛋白和Col-Ⅰ/ Col-Ⅲ蛋白表達(dá)比較

SHR對(duì)照組大鼠心臟表達(dá)TGF-β1/Smad3蛋白和Col-Ⅰ/ Col-Ⅲ蛋白均較正常對(duì)照組明顯升高(P<0. 01)(圖4)。

注：A:對(duì)照組;B :SHR 組。

圖3 大鼠心肌組織 TGF-β1 蛋白表達(dá)改變Fig.3 TGF-β1 expression changes of myocardium

注： 1.正常對(duì)照組，2.SHR 對(duì)照組，3.SHR 干預(yù)組，SHR對(duì)照組組與正常對(duì)照組比較P<0. 05。

2.6 大鼠心肌組織 miRNA-97a 與 TGF-β 1 蛋白表達(dá)

水平相關(guān)性分析Pearson 直線相關(guān)分析顯示，SHR 組心肌組織miRNA-97a 表達(dá)水平與 TGF-β1蛋白表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0. 785，P<0. 01)。

3 討論

高血壓是冠心病的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素[7],冠心病癥狀為胸腔中央發(fā)出疼痛，而且可蔓延到手臂、頷、頸、后背及胃部。冠心病發(fā)作的其他癥狀有氣促、眩暈、寒顫、出汗、惡心及昏厥。嚴(yán)重的一些患者會(huì)因?yàn)樾牧λソ叨鴮?dǎo)致死亡[8-9]。

據(jù)報(bào)道結(jié)果[11-13]表明，miRNA-9和miRNA-97a能影響心肌細(xì)胞的增殖與分化并且可以通過TLX和周期蛋白D1調(diào)控心肌細(xì)胞分化。這次實(shí)驗(yàn)是為了研究miRNA-97a在心肌重構(gòu)中的影響，讓miRNA-97a成為高血壓、冠心病等疾病的一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠心肌組織 miRNA-97a 表達(dá)：Real-time qPCR 結(jié)果顯示,SHR 組心肌 miRNA-97a 表達(dá)水平較對(duì)照組明顯降低(P < 0. 01),SHR組心肌 miRNA-97a 表達(dá)水平為對(duì)照組的 (24. 6 ±4. 7)%。大鼠心肌組織 miRNA-97a 與 TGF-β 1 蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0. 785,P<0. 01)。

同時(shí)，在本研究中，兩組大鼠心肌組織Masson染色結(jié)果顯示：SHR 組大鼠心肌細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞排列紊亂，體積增大，可見大量藍(lán)色膠原纖維。SHR組大鼠收縮壓和舒張壓顯著升高，細(xì)胞肥大，體積增大，心肌細(xì)胞數(shù)量減少，排列紊亂，胞核變圓畸形。同時(shí)，SHR對(duì)照組表達(dá)TGF-β1蛋白表達(dá)均上調(diào)，表明TGF-β1在 Col-Ⅰ和Col-Ⅲ表達(dá)中有了正性的調(diào)節(jié)作用。本研究?jī)山M大鼠血壓和心肌膠原含量的變化顯示，和正常組相比，SHR組的收縮壓和舒張壓明顯升高，TGF-β 1 蛋白，Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白的表達(dá)水平明顯升高，miRNA-97a表達(dá)水平明顯降低。

TGF-β 1是公認(rèn)的促纖維化細(xì)胞因子,能促進(jìn)心肌纖維化[14]，本研究顯示，特異低表達(dá)心臟 miRNA-97a 可促進(jìn)TGF-β 1 蛋白合成，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì) Col-Ⅰ和 Col-Ⅲ大量增生和過度積聚，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大，纖維化，出現(xiàn)心肌病理性重構(gòu)[17]。由于在心肌重構(gòu)過程中參與調(diào)控TGF-β 1、AngII表達(dá)的機(jī)制非常復(fù)雜, miRNA-97a具體通過下調(diào)哪一種信號(hào)通路來抑制細(xì)胞的增殖, 還需要我們進(jìn)一步研究。

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Expression of microRNA-97a and TGF-β1 protein in myocardium of spontaneously hypertensive rats and its significance

ZHENG Jing

(Affiliated hospital of Guizhou medical university, Guiyang 550001, China)

ObjectiveTo observe the changes of microRNA-97a and transforming growth factor β 1 (TGF-β1) protein in the myocardium of spontaneously hypertensive rats (SHR). Methods 8 male spontaneously hypertensive(SHR)rats as SHR group, 8 male Wistar rats for control group, Arterial blood pressure was detected by a noninvasive blood pressure measurement and analysis system. 8 weeks after femoral artery，HE staining was used to observe the changes of morphology of the rat heart, the expression of miRNA-97a was checked by Real-time PCR method for detection of rat heart. Western blot was used to detect the TGF-β 1, angiotensin II (Ang II) protein and type I collagen (Col I) and type III collagen (Col III) protein expression level.ResultsIn SHR group, systolic blood pressure and diastolic blood pressure increased significantly, TGF -β1 protein and Col I and Col III protein expression levels increased significantly, miRNA-97a expression levels were significantly lower than that of control group (P< 0. 01). Real-time PCR results showed that the level of miRNA-97a expression in SHR group was (24.6 + 4.7)% in control group, the expression level of miRNA-97a in SHR group was negatively correlated with the expression of TGF-β1 (r=0.785,P< 0.01) in group. Conclusion The level of miRNA-97a is down-regulated along with the up-regulation of TGF-β 1 protein expression and collagen synthesis in the myocardial tissues of SHR. miRNA-97a and TGF-β 1 may be involved in myocardial fibrosis in SHR.

MicroRNA-97a; Transforming growth factor β 1(TGF -β1); Spontaneously hypertensive rats; Myocardial fibrosis

貴州省科技合作計(jì)劃項(xiàng)目支助(黔科合LH字(2015)7423)。

鄭婧，博士，講師，E-mail：843165396@qq.com。

鄭婧。

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 A 【文章編號(hào)】1671-7856(2016) 11-0072-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.11.013

2016-07-20