生曬參、紅參中中性多糖的分級(jí)及體外抗氧化活性研究Δ

趙幻希，修 洋，焦麗麗，于珊珊，劉淑瑩，2#（.長春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院，長春 307；2.中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所，長春 30022）

·制劑與工藝·

生曬參、紅參中中性多糖的分級(jí)及體外抗氧化活性研究Δ

趙幻希1＊，修 洋1，焦麗麗1，于珊珊1，劉淑瑩1，2#（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院，長春 130117；2.中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所，長春 130022）

目的：研究生曬參和紅參中中性多糖及其分級(jí)組分的體外抗氧化活性。方法：用煎煮法分別從生曬參、100℃和120℃炮制的紅參3個(gè)樣品中提取粗多糖，粗多糖經(jīng)離子交換柱分離得到中性多糖，再用Sephadex G-75凝膠層析柱根據(jù)分子量大小對(duì)中性多糖進(jìn)行分級(jí)得到不同組分。通過1，1-二苯基-2-苦基肼基（DPPH）、OH自由基清除試驗(yàn)和還原能力試驗(yàn)（以FRAP值計(jì)）考察3個(gè)樣品的中性多糖及其組分共9個(gè)樣品的體外抗氧化活性，并以維生素C為陽性對(duì)照。結(jié)果：3種中性多糖分級(jí)后均得到Ⅰ和Ⅱ2種組分。中性多糖及其分級(jí)組分在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均有一定的體外抗氧化活性，且活性隨著質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)；其中120℃紅參的中性多糖及其組分Ⅱ的活性最強(qiáng)，其對(duì)DPPH的半數(shù)清除濃度（IC50）分別為0.258、0.253 g/L，對(duì)OH自由基的IC50分別為7.157、6.845 g/L，F(xiàn)RAP值分別為3.0、2.8 mmol/L（質(zhì)量濃度為1.2 g/L時(shí)）。結(jié)論：120℃紅參中中性多糖體外抗氧化活性強(qiáng)于100℃紅參和生曬參，其中組分Ⅱ發(fā)揮主要抗氧化作用。

生曬參；紅參；中性多糖；分級(jí)；體外抗氧化活性

紅參為五加科植物人參（Panax ginseng C.A.Meyer）的栽培品經(jīng)蒸制后的干燥根和根盞，具有大補(bǔ)元?dú)?、?fù)脈固脫、益氣攝血的作用[1]。紅參在炮制的過程中活性物質(zhì)會(huì)發(fā)生一系列變化，生成的紅參多糖具有顯著的抗氧化活性[2]。多糖也是紅參的主要有效成分之一，藥理研究表明多糖具有降血糖、抗病毒、抗炎、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤[3-7]等生物活性，且毒副作用小。多糖分為酸性多糖、中性多糖和蛋白多糖等，目前對(duì)經(jīng)分離純化后中性多糖的抗氧化活性研究還較少。本試驗(yàn)將對(duì)生曬參和紅參中中性多糖進(jìn)行系統(tǒng)的分級(jí)并對(duì)其體外抗氧化活性進(jìn)行比較，為人參中中性多糖的研究應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、FDU-1100冷凍干燥機(jī)（東京理化器械株式會(huì)社）；5804R冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；TU-1810紫外-可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）；DMG-9123A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；BSZ-100自動(dòng)部分收集器、HL-2恒流泵、TH-1000梯度混合器（上海青浦滬西儀器廠）。

1.2 藥材、對(duì)照品與試劑

人參于2014年9月購自吉林省集安市，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)姜大成教授鑒定為五加科植物人參；D-無水葡萄糖（以下簡稱葡萄糖）對(duì)照品（天津一方科技有限公司，批號(hào)：10080681，純度：99.5%）；1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH，批號(hào)：W09A7E12633，純度：98%）、二乙氨乙基（DEAE）-纖維素（批號(hào)：H13J7S8882）均來源于上海源葉生物科技有限公司；D-半乳糖醛酸（以下簡稱糖醛酸，批號(hào)：103F-0061，純度：99%）、去氧核糖（批號(hào)：110M1179V，純度：98%）均來源于美國Sigma公司；三吡啶三吖嗪（TPTZ，東京化成工業(yè)株式會(huì)社）；維生素C（VC，北京化工廠，批號(hào)：20141108，純度：99%）；氨基磺酸、硫代巴比妥酸、間羥聯(lián)苯、無水硫酸鈉、苯酚、三氯乙酸、硫酸亞鐵、硫酸、鹽酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀、過氧化氫、乙醇（95%）等試劑均為分析純，水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 紅參的炮制

將鮮人參洗凈后用干凈紗布包裹，蘆頭向下擺放在高壓滅菌鍋內(nèi)，在60 min內(nèi)將鍋內(nèi)溫度由室溫（24℃）分別提升至100℃和120℃，并在該溫度下蒸制3 h，蒸制結(jié)束后自然降溫至70℃取出，放入50℃鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)烘干[8]。所得100℃炮制的紅參為紅棕色、半透明；120℃炮制的紅參為紅褐色、透明，且硬度較100℃炮制的紅參高。計(jì)算收率（m紅參/m鮮人參×100%，m紅參為炮制后紅參的質(zhì)量，m鮮人參為炮制前鮮參的質(zhì)量），結(jié)果分別為25.74%、21.54%。

2.2 多糖的提取

分別取干燥后的人參（生曬參）粗粉和紅參粗粉（過40目）50 g，加15倍量水浸泡過夜后，以微沸狀態(tài)回流提取3次，前2次每次2 h，第3次1 h。趁熱用絹布過濾，合并3次提取的濾液，離心（4 500 r/min，離心半徑為6.5 cm）10 min，棄去沉淀，將濾液濃縮凍干得粗多糖。對(duì)所得生曬參粗多糖（WGP）、100℃紅參粗多糖（RGP）和120℃紅參粗多糖（SGP）計(jì)算水提收率（m粗多糖/m粗粉× 100%），結(jié)果分別為64.33%、68.00%、65.67%。

2.3 多糖的分級(jí)

2.3.1 DEAE-纖維素離子交換柱分離粗多糖 分別稱取20 g WGP、RGP、SGP樣品，溶于100 mL排過氣泡的水中，完全溶解后將多糖溶液裝入平衡好的DEAE-纖維素離子交換層析柱（7.5 cm×18 cm，Cl-型），洗脫液為排過氣泡的水，流速為10 mL/min。收集洗脫液，采用苯酚-硫酸法（方法見“2.4.1”項(xiàng)下）測定洗脫液的吸光度（A），當(dāng)A＜0.05時(shí)停止洗脫。洗脫液濃縮后冷凍干燥分別得到生曬參、100℃紅參和120℃紅參的中性多糖，分別記為WGPN、RGPN、SGPN，計(jì)算收率（m中性多糖/m粗多糖× 100%），結(jié)果分別為63.20%、61.59%、62.73%。

2.3.2 Sephadex G-75分析型凝膠層析柱分離中性多糖組分 分別稱取5 mg WGPN、RGPN、SGPN樣品，溶于1 mL排過氣泡的水中，搖勻后離心（11 000 r/min，離心半徑為6.5 cm）5 min。取上清液裝入平衡好的Sephadex G-75分析型凝膠層析柱（90 cm×1.5 cm），洗脫液為排過氣泡的水，流速為2.2 mL/12 min。用試管在餾分收集器中收集，每12 min收集1管，每管2.2 mL，共收集50管。用苯酚-硫酸法測定每管洗脫液的A，以A為縱坐標(biāo)、洗脫液管數(shù)為橫坐繪制洗脫曲線，見圖1。

圖1 中性多糖洗脫曲線Fig 1 Elution curves of neutral polysaccharides

如圖1所示，經(jīng)G-75分析型凝膠層析柱分離后，3種中性多糖樣品隨洗脫管數(shù)的遞增均呈現(xiàn)出2個(gè)吸收峰，提示3種中性多糖樣品經(jīng)層析柱分離后均得到2種組分。由于G-75是根據(jù)組分分子量不同進(jìn)行分離的，分子量大的先被洗脫出來，分子量小的后被洗脫出來，故將先洗脫的峰命名為組分Ⅰ，后洗脫的峰命名為組分Ⅱ。2.3.3 Sephadex G-75制備型凝膠層析柱制備中性多糖組分 分別稱取1 g WGPN、RGPN、SGPN樣品，溶于10 mL排過氣泡的水中，搖勻后離心（11 000 r/min，離心半徑為6.5 cm）5 min。取上清液裝入G-75制備型凝膠層析柱（90 cm×3.0 cm），洗脫液為排過氣泡的水，流速為10 mL/12 min。用試管在流分收集器中收集，每12 min收集1管，每管10 mL。用苯酚-硫酸法測定每管洗脫液的A，當(dāng)A＜0.05時(shí)停止收集。以A為縱坐標(biāo)、洗脫液管數(shù)為橫坐繪制洗脫曲線，合并每個(gè)吸收峰最高（Amax）和|A－Amax|≤0.1的試管中的洗脫液，濃縮、冷凍、干燥，分別得到生曬參中性多糖2種組分WGPN-Ⅰ和WGPN-Ⅱ，100℃紅參中性多糖2種組分RGPN-Ⅰ和RGPN-Ⅱ，120℃紅參中性多糖2種組分SGPN-Ⅰ和SGPN-Ⅱ，計(jì)算收率（m中性多糖分級(jí)組分/m中性多糖×100%），結(jié)果依次為17.70%、15.33%，19.52%、18.33%，24.31%、20.77%。

2.4 多糖含量測定

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 采用苯酚-硫酸法[9]測定多糖含量。準(zhǔn)確稱取葡萄糖對(duì)照品10 mg，用水制備成0.1 g/L的溶液。分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL置于具塞試管中，不足2 mL用水補(bǔ)足，然后加入6%苯酚試劑1 mL，再用移液管緩慢加入濃硫酸5 mL，振蕩均勻，沸水浴10 min，冷卻至室溫。以水代替葡萄糖溶液為空白對(duì)照，用紫外-可見分光光度計(jì)在490 nm波長處測定A。以A為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝11.96x+0.003 8（R2＝0.998 0），葡萄糖檢測質(zhì)量濃度線性范圍為0.01～0.1 g/L。

2.4.2 精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn) 精密量取0.05 g/L的葡萄糖對(duì)照品溶液1.0 mL，置于具塞試管中，按“2.4.1”項(xiàng)下方法重復(fù)測定A 6次，計(jì)算得RSD為1.06%。精密量取已知多糖含量的0.1 g/L的WGPN溶液0.5 mL，置于具塞試管中，平行9份，分別加入0.02、0.04、0.06 g/L葡萄糖對(duì)照品溶液0.5 mL，每個(gè)水平平行3次，按“2.4.1”項(xiàng)下方法測定A，計(jì)算回收率。結(jié)果分別為99.11%、99.77%、100.28%（RSD分別為0.36%、0.22%、0.16%，n＝3）。

2.4.3 樣品中多糖含量的測定 分別準(zhǔn)確稱取WGPN、RGPN、SGPN、WGPN-Ⅰ、WGPN-Ⅱ、RGPN-Ⅰ、RGPN-Ⅱ、SGPN-Ⅰ、SGPN-Ⅱ9個(gè)樣品10 mg，用水制備成0.1 g/L的樣品溶液，每個(gè)樣品平行取3份，按“2.4.1”項(xiàng)下方法測定A。經(jīng)計(jì)算，9個(gè)樣品中多糖含量分別為（32.75± 0.21）%、（38.14±0.37）%、（30.28±0.16）%、（50.47± 0.71）%、（30.00±0.46）%、（49.05±0.26）%、（29.32± 0.21）%、（51.10±0.31）%、（37.22±0.27）%。

2.5 糖醛酸含量測定

2.5.1 糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 用間羥聯(lián)苯法測定糖醛酸含量。準(zhǔn)確稱取糖醛酸對(duì)照品10 mg，用水制備成0.1 g/L的溶液。分別吸取50、100、150、200、300、400 μL，置于具塞試管中，不足400 μL用水補(bǔ)足；然后加入氨基磺酸40 μL，搖勻，再用移液管緩慢加入濃硫酸2.5 mL，振蕩均勻，沸水浴20 min，冷卻至室溫后加入40 μL間羥聯(lián)苯，搖勻，室溫放置15 min。以水代替糖醛酸溶液為空白對(duì)照，用紫外-可見分光光度計(jì)在525 nm波長處測定A。以A為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，得糖醛酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝5.784x－0.003（R2＝0.997 0），其檢測質(zhì)量濃度線性范圍為0.012 5～0.1 g/L。

2.5.2 精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn) 精密量取0.1 g/L的糖醛酸對(duì)照品溶液0.4 mL，置于具塞試管中，按“2.5.1”項(xiàng)下方法重復(fù)測定A 6次，計(jì)算得RSD為1.83%。精密量取已知糖醛酸含量的1.0 g/L的WGPN溶液0.2 mL，置于具塞試管中，平行9份，分別加入0.01、0.02、0.04 g/L糖醛酸對(duì)照品溶液0.2 mL，每個(gè)水平平行3次，測定A，計(jì)算回收率。結(jié)果分別為101.13%、100.46%、100.18%（RSD分別為0.26%、0.22%、0.25%，n＝3）。

2.5.3 樣品中糖醛酸含量測定 分別取“2.4.3”項(xiàng)下9個(gè)樣品，每個(gè)樣品平行取3份，按“2.5.1”項(xiàng)下方法測定A。經(jīng)計(jì)算，9個(gè)中性多糖樣品中糖醛酸含量分別為（0.838± 0.018）%、（0.432±0.009）%、（0.398±0.010）%、（0.631± 0.006）%、（0.354±0.008）%、（0.545±0.015）%、（0.533± 0.011）%、（0.251±0.007）%、（0.372±0.009）%。

2.6 抗氧化活性測定

2.6.1 DPPH自由基清除能力的測定 參考文獻(xiàn)[10]方法進(jìn)行測定。將DPPH溶于95%乙醇中制備成0.1 mmol/L的DPPH溶液。分別取“2.4.3”項(xiàng)下9個(gè)樣品適量，用水制備成質(zhì)量濃度均為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L的樣品溶液，以VC為陽性對(duì)照。吸取3.0 mL待測樣品溶液置于20 mL試管中，加入0.1 mmol/L的DPPH溶液1.0 mL振蕩混勻，室溫避光反應(yīng)30 min；以水代替樣品溶液為空白。517 nm波長處測定A，計(jì)算各樣品DPPH自由基清除率[（1－A樣品/A空白）×100%]，結(jié)果見圖2A。

圖2 不同樣品的體外抗氧化作用Fig 2 Antioxidant activity in vitro of different samples

由圖2A可見，不同質(zhì)量濃度的9個(gè)樣品對(duì)DPPH自由基均有一定的清除作用，在0.1～1.0 g/L內(nèi)，清除能力隨質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。其中SGPN、WGPN-Ⅱ、RGPN-Ⅱ、SGPN-Ⅱ?qū)PPH自由基的清除率較高。計(jì)算VC和上述4個(gè)樣品的半數(shù)清除濃度（IC50），結(jié)果分別為0.151、0.258、0.451、0.393、0.253 g/L。

2.6.2 OH自由基清除能力的測定 參考文獻(xiàn)[11]方法進(jìn)行測定。反應(yīng)體系為0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH＝7.4），其中包括2.67 mmol/L的去氧核糖和0.13 mmol/L的乙二胺四乙酸。分別稱取“2.4.3”項(xiàng)下9個(gè)樣品適量，用水制備成質(zhì)量濃度分別為1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、16.0 g/L的樣品溶液，以VC為陽性對(duì)照。取0.1 mL樣品溶液加至0.6 mL緩沖液中，再加入0.4 mmol/L硫酸亞鐵溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配）200 μL、2 mmol/L VC溶液50 μL和20 mmol/L過氧化氫溶液50 μL，37℃水浴15 min，然后加入1%硫代巴比妥酸溶液和2.0%的三氯乙酸溶液各1 mL，沸水浴15 min，冷卻至室溫；以水代替樣品溶液為空白。于532 nm波長處測定A，計(jì)算各樣品的OH自由基清除率[（1－A樣品/A空白）×100%]，結(jié)果見圖2B。

由圖2B可見，不同質(zhì)量濃度的9個(gè)樣品清除OH自由基的作用趨勢與清除DPPH自由基相似，但清除能力更弱，其中SGPN、SGPN-Ⅱ的清除率高于其他樣品。經(jīng)計(jì)算VC、SGPN、SGPN-Ⅱ的IC50分別為0.639、7.157、6.845 g/L。

2.6.3 還原能力的測定 采用FRAP法[12]進(jìn)行測定。將醋酸鈉溶于冰醋酸中制備成pH 3.6的緩沖體系；取10 mmol/LTPTZ溶液溶于40 mmol/L鹽酸中；取20 mmol/L三氯化鐵溶液。將這3種溶液以10∶1∶1比例混合配成FRAP試劑（現(xiàn)用現(xiàn)配）。制備硫酸亞鐵不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在593 nm波長處測定A。以A為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度x為橫坐標(biāo)，得其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A＝0.113x－0.006（R2＝0.999 0），其檢測質(zhì)量濃度線性范圍為0.8～7.2 mmol/L。

分別稱取“2.4.3”項(xiàng)下9個(gè)樣品適量，用水制備成質(zhì)量濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 g/L的樣品溶液，以VC為陽性對(duì)照。取0.3 mL樣品溶液，加入2.7 mL已預(yù)熱至37℃的FRAP試劑，搖勻后放置10 min，以水代替樣品溶液為空白，593 nm波長處測定A，根據(jù)反應(yīng)后吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算得相應(yīng)硫酸亞鐵的濃度（mmol/L），定義為FRAP值，F(xiàn)RAP值越大，還原能力越強(qiáng)，結(jié)果見圖2C。

由圖2C可見，當(dāng)樣品的質(zhì)量濃度在0.2～1.2 g/L內(nèi)，相應(yīng)的FRAP值呈現(xiàn)遞增趨勢，其中SGPN、SGPN-Ⅱ升高趨勢明顯，且與VC值相近；當(dāng)質(zhì)量濃度為1.2 g/L時(shí)，VC、SGPN、SGPN-Ⅱ的FRAP值分別為3.1、3.0、2.8 mmol/L。

3 討論

本試驗(yàn)用DEAE-纖維素離子交換柱和Sephadex G-75凝膠層析柱分離粗多糖，得到9個(gè)中性多糖分級(jí)組分。用間羥聯(lián)苯法對(duì)這9個(gè)組分的糖醛酸含量進(jìn)行測定，結(jié)果表明各組分的糖醛酸含量均小于1%，提示DEAE-纖維素離子交換柱可以有效分離粗多糖中的酸性多糖和中性多糖[13]。對(duì)這9個(gè)組分的體外抗氧化活性進(jìn)行比較，結(jié)果表明，各組分均具有很好的還原能力，且與陽性對(duì)照相近，對(duì)DPPH自由基也具有一定的清除能力，而對(duì)OH自由基的清除能力較弱；各樣品質(zhì)量濃度與清除率、還原能力在一定的范圍內(nèi)呈正相關(guān)關(guān)系，但抗氧化活性均弱于陽性對(duì)照。綜合3個(gè)抗氧化活性指標(biāo)結(jié)果分析，120℃紅參中性多糖及其分級(jí)組分的抗氧化活性要強(qiáng)于100℃紅參和生曬參。通過比較未分級(jí)中性多糖和經(jīng)Sephadex G-75凝膠層析柱分離得到的2個(gè)組分的體外抗氧化活性發(fā)現(xiàn)，未分級(jí)中性多糖的抗氧化活性與中性多糖組分Ⅱ相似，且遠(yuǎn)強(qiáng)于組分Ⅰ，由此推測在中性多糖中發(fā)揮抗氧化作用的主要是組分Ⅱ。

本試驗(yàn)對(duì)生曬參和紅參中中性多糖不同分級(jí)組分的體外抗氧化活性進(jìn)行了較系統(tǒng)的考察，并分離出具有良好抗氧化活性的組分。本文可為人參中性多糖的生物活性研究提供一定的參考。

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Study on the Grading and Antioxidant Activity in vitro of Neutral Polysaccharides from White Ginseng and Red Ginseng

ZHAO Huanxi1，XIU Yang1，JIAO Lili1，YU Shanshan1，LIU Shuying1，2（1.Jilin Ginseng Academy，Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130117，China；2.Changchun Institute of Applied Chemistry，Chinese Academy of Sciences，Changchun 130022，China）

OBJECTIVE：To study the antioxidant activity in vitro of neutral polysaccharides and its graded component from 3 samples of white ginseng and red ginseng.METHODS：The decoction method was used to extract the crude polysaccharides from white ginseng，100℃ and 120℃ processed red ginseng；the crude polysaccharides were further separated through ion exchange column to extract neutral polysaccharides；Sephadex G-75 gels filter column was used to grade the neutral polysaccharides according to the molecular weight，antioxidant activity in vitro of 9 samples in 3 neutral polysaccharides and were detected by DPPH and OH free radical scavenging test and reduction capacity test（FRAP value），and vitamin C was used as positive control.RESULTS：The 3 neutral polysaccharides all obtained componentⅠ and componentⅡ after grading.Neutral polysaccharides and its graded component showed certain antioxidant activity in vitro in a certain concentration range，and increased by concentration increasing. The activity of neutral polysaccharides and componentⅡfrom 120℃ processed red ginseng was the strongest，of which 50%inhibitory concentration（IC50）on DPPH free radical was 0.258 g/L and 0.253 g/L，on OH free radical was 7.157 g/L and 6.845 g/L，F(xiàn)RAP values were 2.8 and 3.0 mmol/L（when concentration was 1.2 g/L），respectively.CONCLUSIONS：The antioxidant activity in vitro from 120℃processed red ginseng is higher than that of 100℃ processed red ginseng and white ginseng，in which componentⅡmakes important contribution to the antioxidant activity.

White ginseng；Red ginseng；Neutral polysaccharides；Grade；Antioxidant activity in vitro

R284.2；R285.5

A

1001-0408（2017）07-0943-05

2016-07-08

2016-09-05）

（編輯：劉 萍）

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（No.21475012）；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（No.31400682）；吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（No.20160520123JH）

＊研究實(shí)習(xí)員，碩士。研究方向：中藥有效物質(zhì)的分析。電話：0431-86763993。E-mail：phoenix8713@sina.com

#通信作者：研究員，博士生導(dǎo)師，博士。研究方向：中藥化學(xué)。電話：0431-86763978。E-mail：syliu@ciac.ac.cn

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.07.23