UPLC-PDA法測(cè)定藏藥翼首草不同藥用部位中齊墩果酸和熊果酸的含量Δ

唐 策，蘇錦松，楊 娟，左 芳，孟憲麗，鄒忠梅，張 藝#（.成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院，成都637；.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 0093）

UPLC-PDA法測(cè)定藏藥翼首草不同藥用部位中齊墩果酸和熊果酸的含量Δ

唐 策1＊，蘇錦松1，楊 娟1，左 芳1，孟憲麗1，鄒忠梅2，張 藝1#（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院，成都611137；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193）

目的：建立測(cè)定藏藥翼首草不同藥用部位中齊墩果酸和熊果酸含量的方法，并比較其不同部位之間的含量差異。方法：采用超高效液相色譜-光電二極管陣列檢測(cè)器（UPLC-PDA）測(cè)定翼首草不同藥用部位（全草、地上部位和地下部位）齊墩果酸和熊果酸含量。色譜柱為Acquity UPLC HSS T3（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相為甲醇-0.1 mol/L乙酸銨溶液（88∶12，V/V），流速為0.2 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為5 μL。結(jié)果：齊墩果酸和熊果酸的檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為10.65～1 065 μg/mL（r＝0.999 6）、18.8～1 880 μg/mL（r＝0.999 4），平均加樣回收率分別為96.95%（RSD＝1.24%，n＝9）、98.12%（RSD＝2.13%，n＝9），精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均小于3%。不同藥用部位的齊墩果酸和熊果酸含量的高低整體趨勢(shì)為地上部位＞全草＞地下部位；翼首草全草中齊墩果酸和熊果酸平均總量為0.35%，地上部位中為0.56%，地下部位中為0.09%。結(jié)論：建立的方法快速、準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好，適合于藏藥翼首草不同藥用部位中齊墩果酸和熊果酸含量的測(cè)定。翼首草地上部位中齊墩果酸和熊果酸含量較全草、地下部位高，建議使用地上部位入藥。

藏藥；翼首草；超高效液相色譜；光電二極管陣列檢測(cè)器；藥用部位；齊墩果酸；熊果酸；含量測(cè)定

翼首草（藏語(yǔ)名為“榜孜毒烏”）[1]為川續(xù)斷科匙葉翼首草[Pterocephalus hookeri（C.B.Clarke）H?eck]的干燥全草，收載于2015年版《中國(guó)藥典》（一部）[2]及原衛(wèi)生部《藏藥部頒標(biāo)準(zhǔn)》[3]中，為常用藏藥。本課題組前期通過(guò)對(duì)藏藥古籍文獻(xiàn)、藏醫(yī)院及現(xiàn)代藥材標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行整理調(diào)查，發(fā)現(xiàn)翼首草藥用部位的規(guī)定不統(tǒng)一，其全草、地上部位、地下部位均可入藥[4-7]。2015年版《中國(guó)藥典》（一部）中翼首草含量測(cè)定項(xiàng)下，要求全草中齊墩果酸和熊果酸的總含量不得低于0.20%[2]。查閱文獻(xiàn)[8-12]發(fā)現(xiàn)，齊墩果酸和熊果酸主要來(lái)自于翼首草的哪個(gè)部位仍不清楚。因此，本研究采用超高效液相色譜-光電二極管陣列檢測(cè)器（UPLC-PDA）測(cè)定翼首草全草、地上部位和地下部位中齊墩果酸和熊果酸的含量，明確齊墩果酸和熊果酸的主要來(lái)源部位，以期優(yōu)化翼首草的用藥部位，并為翼首草質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)和資源的可持續(xù)利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Acquity UPLC儀，包括四元溶劑管理系統(tǒng)、樣品管理系統(tǒng)、光電二極管陣列檢測(cè)器、Empower色譜工作站（美國(guó)Waters公司）；BT125D十萬(wàn)分之一電子天平（德國(guó)Sartorius公司）。

1.2 藥品與試劑

齊墩果酸對(duì)照品（批號(hào)：110709-200505，純度：＞98%）、熊果酸對(duì)照品（批號(hào)：742-9204，純度：＞98%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇（美國(guó)J.T.Baker公司，色譜純）；水為屈臣氏蒸餾水；其余試劑均為分析純。

翼首草藥材來(lái)源于四川、云南，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院張藝研究員鑒定為川續(xù)斷科匙葉翼首草[Pterocephalus hookeri（C.B.Clarke）H?eck]的干燥全草。將2013年8月采集的16批次翼首草，將其分為地上部位和地下部位，晾干，粉碎，過(guò)三號(hào)篩。16批次翼首草樣品產(chǎn)地信息見(jiàn)表1。

表1 16批次翼首草樣品產(chǎn)地信息Tab 1 Production areas of 16 batches of P.hookeri

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Acquity UPLC HSS T3（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.1 mol/L乙酸銨溶液（88∶12，V/ V）；流速：0.2 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：5 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取齊墩果酸、熊果酸對(duì)照品適量，加入甲醇制備成每1 mL含齊墩果酸1.065 mg和熊果酸1.880 mg的混合對(duì)照品溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液 取翼首草粉末（過(guò)三號(hào)篩）約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率：250 W，頻率：40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，用少量甲醇洗滌濾渣及濾器，合并濾液，蒸干。殘?jiān)蛹状歼m量使溶解，將溶液轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，甲醇定容，搖勻，濾過(guò)。取續(xù)濾液過(guò)0.22 μm的微孔濾膜，即得[2]。

2.3 線性關(guān)系考察

吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按不同比例加入甲醇稀釋，制成一系列質(zhì)量濃度的樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜峰。超高效液相色譜圖見(jiàn)圖1。以樣品溶液質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別得到回歸方程：齊墩果酸為y＝1.03×107x－1.86×104（r＝0.999 6）、熊果酸為y＝8.83×106x+4.60×103（r＝0.999 4）。結(jié)果表明，齊墩果酸質(zhì)量濃度在10.65～1 065 μg/mL、熊果酸質(zhì)量濃度在18.8～1 880 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

圖1 超高效液相色譜圖Fig 1 UPLC chromatograms

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液5 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果，齊墩果酸和熊果酸峰面積的RSD值分別為0.17%、0.50%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批次（S12）供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。結(jié)果，齊墩果酸、熊果酸峰面積的RSD值分別為0.79%、0.87%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次（S12）藥材粉末6份，按“2.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，測(cè)定含量。結(jié)果，齊墩果酸、熊果酸含量的RSD值分別為2.11%、2.86%（n＝6），表明重復(fù)性良好。

2.4.4 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的翼首草藥材粉末9份，每份約1 g，分別加入適量的混合對(duì)照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果齊墩果酸、熊果酸的平均加樣回收率分別為96.95%（RSD＝1.24%，n＝9）、98.12%（RSD＝2.13%，n＝9），表明該方法準(zhǔn)確度較好。

2.5 樣品含量測(cè)定

分別取不同產(chǎn)地、不同部位的翼首草藥材粉末，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算齊墩果酸和熊果酸的含量。16批次翼首草樣品不同藥用部位中齊墩果酸和熊果酸的含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2；齊墩果酸和熊果酸分別在翼首草不同藥用部位中的含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2；翼首草不同藥用部位中齊墩果酸和熊果酸的含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖3。

表2 16批次翼首草樣品不同藥用部位中齊墩果酸和熊果酸的含量測(cè)定結(jié)果（n＝2）Tab 2 Contents of oleanolic acid and ursolic acid from different medical parts in 16 batches of P.hookeri（n＝2）

圖2 齊墩果酸和熊果酸分別在翼首草不同藥用部位中的含量測(cè)定結(jié)果（n＝16）Fig 2 Contents of oleanolic acid and ursolic acid from different medical parts in P.hookeri（n＝16）

3 討論

筆者前期考察了Acquity UPLC BEH C8（100 mm× 2.1 mm，1.7 μm）、Acquity UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）和Acquity UPLC HSS T3（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）等色譜柱對(duì)齊墩果酸和熊果酸的分離效果，結(jié)果Acquity UPLC HSS T3（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）色譜柱分離效果最佳。

筆者參照2015年版《中國(guó)藥典》（一部）[2]的含量測(cè)定方法，并通過(guò)優(yōu)化，建立了測(cè)定藏藥翼首草不同藥用部位齊墩果酸、熊果酸含量的UPLC-PDA法。該法快速、準(zhǔn)確可靠、重現(xiàn)性好，適合于翼首草藥材中三萜類成分含量的測(cè)定。

圖3 翼首草不同藥用部位中齊墩果酸和熊果酸的含量測(cè)定結(jié)果（n＝16）Fig 3 Contents of oleanolic acid and ursolic acid from different medical parts in P.hookeri（n＝16）

2015年版《中國(guó)藥典》（一部）規(guī)定，翼首草藥材中含齊墩果酸和熊果酸的總量不得少于0.20%[2]。從表2可以看出，齊墩果酸和熊果酸的總量在翼首草全草和地上部位中均達(dá)到要求，分別為0.35%、0.56%，然而地下部位中為0.09%，未能達(dá)到2015年版《中國(guó)藥典》（一部）[2]要求。

本文研究了同一產(chǎn)地不同批次的翼首草藥材中不同藥用部位中齊墩果酸和熊果酸含量的高低，由圖2可知，地上部位的齊墩果酸和熊果酸含量均高于地下部位，分別是地下部位的1.6、19.62倍。由圖2和圖3可知，地上部位中熊果酸的含量多于齊墩果酸，高出近4倍；而地下部位中齊墩果酸的含量較熊果酸含量多，高出近3倍。

翼首草為多年生草本植物，主產(chǎn)于海拔3 200～5 700 m的山坡、草地、草甸、林間等[7]，因連根采挖，在2000年就已被列為一級(jí)瀕危藏藥物種[13]。如何合理利用翼首草資源，防止其野生資源瀕臨枯竭，是必須進(jìn)行的重要課題。本課題組前期對(duì)翼首草不同藥用部位總皂苷的含量測(cè)定發(fā)現(xiàn)，翼首草地上部位總皂苷平均含量為5%[14]；也對(duì)翼首草不同藥用部位中馬錢苷進(jìn)行含量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)地上部位馬錢苷較地下部位含量高[15]；同時(shí)對(duì)不同地區(qū)不同藥用部位翼首草指紋圖譜比較發(fā)現(xiàn)，地上部位指紋圖譜較地下部位更全面[16]。從資源化學(xué)的角度考慮，筆者建議翼首草的藥用部位為地上部位，做到資源保護(hù)與合理開(kāi)發(fā)利用并舉。同時(shí)，應(yīng)加強(qiáng)翼首草人工栽培研究，促使翼首草逐步發(fā)展到滿足藏藥臨床用藥及規(guī)?；a(chǎn)需要。因此，本文首次對(duì)同一產(chǎn)地不同批次翼首草不同部位中齊墩果酸和熊果酸含量進(jìn)行測(cè)定，為進(jìn)一步完善其質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)提供了重要的依據(jù)。

[1] 張雪梅，楊豐慶，夏之寧.藏藥翼首草的藥理作用及其質(zhì)量評(píng)價(jià)研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥房，2012，23（35）：3356-3358.

[2] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S].2015年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：381.

[3] 衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)：藏藥：第1冊(cè)[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，1995：138.

[4] 張雨欣，李聰穎，劉川，等.基于DNA條形碼及UFLC技術(shù)的藏藥翼首草相關(guān)性的品質(zhì)評(píng)價(jià)研究[J].中國(guó)中藥雜志，2016，41（4）：572-577.

[5]李聰穎.基于DNA條形碼及UFLC技術(shù)的藏藥翼首草遺傳-化學(xué)相關(guān)性研究[D].成都：成都中醫(yī)藥大學(xué)，2015：25-28.

[6] 帝瑪爾·丹增彭措.晶珠本草[M].毛繼祖，羅達(dá)尚，王振華，等，譯.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1986：137.

[7] 中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所.藏藥志[M].西寧：青海人民出版社，1991：191-193.

[8] 張小梅，梁旭明，孫冠蕓，等.HPLC測(cè)定不同批次、不同產(chǎn)地翼首草中齊墩果酸和熊果酸的含量[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2011，28（12）：1125-1128.

[9] 馮瑜娟，張藝.HPLC-ELSD法測(cè)定藏藥翼首草中齊墩果酸和熊果酸的含量[J].成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，30（3）：54-56.

[10] 劉小蘭，周劍波，陶燕鐸，等.高效液相色譜法測(cè)定翼首草中齊墩果酸和熊果酸的含量[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2008，28（7）：546-548.

[11] 張小梅，梁旭明，勵(lì)娜，等.高效液相色譜法測(cè)定翼首草不同藥用部位齊墩果酸和熊果酸的含量[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2012，32（2）：155-156.

[12] 權(quán)紅，甄梓娟，李連強(qiáng)，等.藏藥匙葉翼首草中齊墩果酸及熊果酸的含量測(cè)定[J].中國(guó)現(xiàn)代中藥，2016，18（6）：762-765.

[13] 李隆云，占堆，衛(wèi)瑩芳，等.瀕危藏藥資源的保護(hù)[J].中國(guó)中藥雜志，2002，27（8）：561-564.

[14] 林升得，江道峰，張藝，等.分光光度法測(cè)定藏藥翼首草不同藥用部位總皂苷的含量[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（5）：101-104.

[15] 譚德，古銳，張藝，等.HPLC測(cè)定藏藥翼首草中馬錢苷的含量[J].中國(guó)中藥雜志，2011，36（24）：3472-3474.

[16] 李聰穎，范剛，張藝，等.藏族藥翼首草不同藥用部位UFLC指紋圖譜比較[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2015，21（9）：42-45.

Content Determination of Oleanolic Acid and Ursolic Acid from Different Medicinal Parts in Tibetan Medicine Pterocephalus hookeri by UPLC-PDA

TANG Ce1，SU Jinsong1，YANG Juan1，ZUO Fang1，MENG Xianli1，ZOU Zhongmei2，ZHANG Yi1（1.College of Ethnic Medicine，Chengdu University of TCM，Chengdu 611137，China；2.Peking Union Medical College/Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100193，China）

OBJECTIVE：To establish the method for the determination of oleanolic acid and ursolic acid in different medicinal parts of Tibetan medicine Pteocephalus hookeri，and compare the differences among the different parts.METHODS：The contents of oleanolic acid and ursolic acid from different medicinal parts（whole plant，aerial part，underground part）of P.hookeri were determined by UPLC-PDA.The separation was performed on Acquity UPLC HSS T3 column（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）with mobile phase consisted of methanol-0.1 mol/L ammonium acetate（88∶12，V/V）at the flow rate of 0.2 mL/min.The detection wavelength was set at 210 nm，and column temperature was 30℃.The sample size was 5 μL.RESULTS：The linear ranges of oleanolic acid and ursolic acid were 10.65-1 065 μg/mL（r＝0.999 6）and 18.8-1 880 μg/mL（r＝0.999 4），separately.The recoveries were 96.95%（RSD＝1.24%，n＝9）and 98.12%（RSD＝2.13%，n＝9），separately.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all less than 3%.The contents of oleanolic acid and ursolic acid from different medicinal parts in P.hookeri were in descending order of aerial part＞whole plant＞underground part；the average total content of oleanolic acid and ursolic acid from whole plants was 0.35%，the aerial part reached 0.56%and underground part was 0.09%.CONCLUSIONS：The method is rapid，accurate and reproducible，and it is suitable for the content determination of oleanolic acid and ursolic acid in different medicinal parts of Tibetan medicine P.hookeri.The contents of oleanolic acid and ursolic acid from aerial part of P.hookeri are higher than whole plant and underground part.It is suggested to use aerial parts of medicine.

Tibetan medicine；Pteocephalus hookeri；UPLC；PDA；Medicinal parts；Oleanolic acid；Ursolic acid；Content determination

R927.2

A

1001-0408（2017）07-0929-04

2016-08-10

2016-10-15）

（編輯：余慶華）

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（No.81274193）；四川省教育廳省屬高校科研創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)計(jì)劃項(xiàng)目（No.11TD004）

＊博士研究生。研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化。電話：028-61800274。E-mail：409014182@qq.com

#通信作者：研究員，博士生導(dǎo)師。研究方向：民族藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。電話：028-61800274。E-mail：9006zmy@sina.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.07.19