寧夏葡萄酒中白藜蘆醇含量的高效液相色譜快速測(cè)定

馮愈欽，郭紅艷，劉貴珊，何建國(guó)，王松磊，賀曉光

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川750021）

寧夏葡萄酒中白藜蘆醇含量的高效液相色譜快速測(cè)定

馮愈欽，郭紅艷，劉貴珊*，何建國(guó)，王松磊，賀曉光

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川750021）

建立高效液相色譜法測(cè)定葡萄酒中白藜蘆醇的方法，考察直接進(jìn)樣法的檢測(cè)波長(zhǎng)、洗脫強(qiáng)度、流動(dòng)相pH值、柱溫、樣品pH值等因素對(duì)酒樣分離的影響，建立HPLC檢測(cè)葡萄酒中白藜蘆醇的方法，相關(guān)系數(shù)r為0.999 9，線性范圍為1mg/L～20mg/L，精密度、穩(wěn)定性、回收率試驗(yàn)的RSD分別為1.16%、2.9%和1.25%，酒樣檢測(cè)發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇的含量隨酒的年份和品種變化，品種間比較結(jié)果為：蛇龍珠最優(yōu)，梅鹿輒、赤霞珠、霞多麗次之，貴人香最低，其中蛇龍珠含量高達(dá)6mg/L。

白藜蘆醇；高效液相色譜；回收率；葡萄酒

世界釀酒葡萄種植的地帶是北緯30℃～50℃和南緯30℃～40℃之間[1-3]。我國(guó)的葡萄產(chǎn)區(qū)大部分在適宜葡萄生長(zhǎng)的北半球10℃～20℃等溫線之內(nèi)，寧夏賀蘭山東麓地區(qū)是釀酒葡萄適宜的生態(tài)區(qū)之一。種植面積已發(fā)展到5萬多畝，占全國(guó)總面積31萬畝的16%，在國(guó)內(nèi)九大葡萄基地中名列第四位[4-7]。葡萄酒產(chǎn)業(yè)已成為具有明顯地方特色的農(nóng)業(yè)支柱產(chǎn)業(yè)之一。

白藜蘆醇是葡萄酒中最主要的活性物質(zhì)，具有抗癌、抗突變、延長(zhǎng)壽命等作用，在葡萄酒中的含量在mg/L數(shù)量級(jí)，是衡量葡萄酒品質(zhì)的一個(gè)重要依據(jù)。高效液相色譜法具有靈敏高、選擇性強(qiáng)、快速分離等優(yōu)點(diǎn)，適用于分析成分復(fù)雜、干擾項(xiàng)較多的痕量檢測(cè)，是近年來研究的焦點(diǎn)[8-11]。

本研究將對(duì)西夏王葡萄酒品牌旗下的蛇龍珠、梅鹿輒、赤霞珠、貴人香、霞多麗5個(gè)品種采用直接進(jìn)樣法，尋找最適色譜條件，并對(duì)所建立的檢測(cè)方法進(jìn)行考察，用于不同品種、不同年份葡萄酒保藏過程中的白藜蘆醇變化規(guī)律的深入研究。為我國(guó)原產(chǎn)地域命名葡萄酒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系研究奠定基礎(chǔ)，這將對(duì)我國(guó)葡萄與葡萄酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

AGILENT1100高效液相色譜儀、AQ-C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）、一次性有機(jī)濾器（0.45μm×13mm）、濾膜（0.45μm×50 mm）：美國(guó)安捷倫科技公司；PHS-25 pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；ESJ-4A電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；BT600-1J循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

白藜蘆醇標(biāo)品（純度98%）：中國(guó)食品藥品檢定研究所；乙腈（色譜級(jí)）：美國(guó)CHROMADEX；2013、2014年份的西夏王干紅（赤霞珠、梅鹿輒、蛇龍珠）、西夏王干白（霞多麗、貴人香）：寧夏西夏王葡萄酒業(yè)有限公司；甲醇（色譜級(jí)）、磷酸、氨水、去離子水、超純水：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2樣品的配制

白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：稱取白藜蘆醇標(biāo)品5mg，溶解于甲醇中，在100mL容量瓶中定容，搖勻，配制成50mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。用甲醇配制成1、2、4、6、10、20mg/L系列濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。高效液相色譜分析前，用0.45μm的一次性有機(jī)濾器過濾。葡萄酒經(jīng)0.45μm一次性有機(jī)濾器過濾除去雜質(zhì)。

1.3方法

采用AQ-C18（4.6mm×250mm，5μm）色譜柱，二極管陣列檢測(cè)器（即DAD檢測(cè)器），進(jìn)樣量為10μL，流速為1.0mL/min，分別檢測(cè)波長(zhǎng)、洗脫強(qiáng)度、流動(dòng)相pH值，柱溫，樣品pH值等因素對(duì)樣品中白藜蘆醇分離效果的影響，確定最終色譜條件。通過對(duì)標(biāo)品溶液的進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，提取HPLC分析白藜蘆醇的最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。等度洗脫、梯度洗脫分離葡萄酒樣品，比較不同條件下的分離效果，同時(shí)分析相應(yīng)條件下的分離圖譜，調(diào)節(jié)梯度洗脫中的洗脫強(qiáng)度，調(diào)解流動(dòng)相pH值，尋找滿足要求的梯度程序。用5%的氨水調(diào)節(jié)酒樣pH值為4.0、5.0、6.0、7.0，按上述HPLC色譜條件測(cè)試，上樣前過0.45μm一次性有機(jī)濾器過濾。柱溫是HPLC分析中的重要分析參數(shù)，討論色譜柱溫度對(duì)分離酒樣中白藜蘆醇的影響，選取最適溫度。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線、精密度試驗(yàn)、穩(wěn)定性研究、回收率研究考察儀器和方法的精密性、準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性。

2結(jié)果與分析

2.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

在190 nm～800 nm范圍內(nèi)對(duì)制備的白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，測(cè)定其紫外吸收?qǐng)D譜，如圖1，考察白藜蘆醇的最大吸收波長(zhǎng)。

由圖1可知，溶劑甲醇的吸收峰在200 nm附近，而白藜蘆醇的最大吸收波長(zhǎng)位于310 nm附近。已報(bào)到研究中，如沈齊英[12]、高年法[13]、孫德鐵[14]等均設(shè)定白藜蘆醇的HPLC分析的最佳檢測(cè)波長(zhǎng)為306 nm，與本次試驗(yàn)結(jié)果基本一致，故確定306 nm為高效液相色譜分析白藜蘆醇的檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 白藜蘆醇的紫外掃描圖譜Fig.1 UV scanning spectra of resveratrol

2.2洗脫條件對(duì)樣品分離的影響

流動(dòng)相對(duì)樣品分離的選擇性取決于有機(jī)溶劑的種類，相應(yīng)的分離強(qiáng)度則主要取決于流動(dòng)相中有機(jī)溶劑所占的體積分?jǐn)?shù)[15-17]。采用等度洗脫，A∶B=75∶25（體積比），柱溫為30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)306 nm時(shí)，4mg/L白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品、2014年赤霞珠、2014年梅鹿輒酒樣圖譜。等壓洗脫色譜圖見圖2。

圖2 等壓洗脫色譜圖Fig.2 Isobaric elution chromatogram

由如圖2可知，白藜蘆醇標(biāo)品的保留時(shí)間為15.13min，對(duì)稱因子1.007，峰形較好，赤霞珠酒樣保留時(shí)間為15.22min，分離效果較好，梅鹿輒在15.20min附近有重疊峰，沒有得到理想的分離效果。

梯度程序1：磷酸調(diào)解水的pH=2.4，起始A∶B= 85∶15（體積比）；0～6min內(nèi)，15%～20%B；6min～10min內(nèi)，20%～28%B；10 min～20 min內(nèi)，28%～35%B；20min～30min內(nèi)，35%～50%B。該條件下，梅鹿輒酒樣中白藜蘆醇的分離效果較好，白藜蘆醇的保留時(shí)間為16.41min，蛇龍珠酒樣分離效果不夠理想，酒樣的色譜圖如圖3。進(jìn)一步根據(jù)樣品的色譜峰圖分析，需增加流動(dòng)相B的濃度，加大洗脫強(qiáng)度。

圖3 梯度程序1洗脫色譜圖Fig.3 Gradientelution chromatography 1

梯度程序2：磷酸調(diào)節(jié)A的pH=2.4，起始時(shí)A∶B= 65∶35（體積比），0～10min，保持35%B；10min～20min內(nèi)，35%～100%B；20min～30min，保持100%B；30min～35min內(nèi)，100%～35%B；35min～40min，保持35%B。酒樣洗脫色譜圖如圖4。

由圖4可知，改進(jìn)的色譜條件下，白藜蘆醇的保留時(shí)間為7.47min，標(biāo)品中22min處為甲醇的吸收峰，蛇龍珠樣品得到了良好的分離效果，且在白藜蘆醇含量較少的干白中也取得了不錯(cuò)的分離效果。所以，最終被確定梯度程序2為最佳色譜條件。

2.3色譜條件的確定

2.1～2.2確定反相高效液相色譜法分析葡萄酒中白藜蘆醇的色譜條件為，進(jìn)樣量為10μL，流速為1.0 mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)306 nm，梯度洗脫：A為去離子水（pH=2.4），B為純乙腈，起始時(shí)A∶B=65∶35（體積比），0～10min，保持35%B；10min～20min內(nèi)，35%～100%B；20 min～30 min，保持100%B；30min～35min內(nèi)，100%～35%B；35min～40min，保持35%B。

2.4酒樣pH值對(duì)樣品分離的影響

葡萄酒中的酸類物質(zhì)主要來源于兩方面，即葡萄組織自身所含的酸和發(fā)酵過程產(chǎn)生的酸，一般葡萄酒的pH值在2.7～3.8范圍內(nèi)。按梯度程序2測(cè)試，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇的峰面積變化甚微，說明進(jìn)樣量很少，樣品的pH值對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響很小。

2.5柱溫的選擇

圖4 梯度程序2洗脫色譜圖Fig.4 Gradientelution chromatography 2

柱溫對(duì)HPLC分析物質(zhì)的保留行為、峰形和分離選擇性均存在影響。過低的柱溫會(huì)降低待分離物質(zhì)的擴(kuò)散速度，致使分離效能降低，峰形變寬，保留時(shí)間變長(zhǎng)；相反，過高的柱溫會(huì)使樣品中各個(gè)組分在固液兩相中的擴(kuò)散速度加快，同時(shí)揮發(fā)靠攏，不利于組分的分離[18-20]；如果柱溫高于60℃，尤其在水相pH＜3或pH＞8的條件下，色譜柱的硅烷鍵合固定相很可能會(huì)發(fā)生水解。白藜蘆醇在高溫下不穩(wěn)定，容易氧化，所以研究選擇柱溫為30℃。

2.6線性關(guān)系

按照濃度從小到大的順序，依次準(zhǔn)確吸取1、2、4、6、10、20mg/L系列濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在2.3色譜條件下進(jìn)樣檢測(cè)，得到相應(yīng)峰面積。白藜蘆醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖5。

由圖5得，白藜蘆醇的線性回歸方程為：y= 81.474x+5.321 9，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9，線性范圍為1mg/L～20mg/L，該研究范圍內(nèi)白藜蘆醇的質(zhì)量濃度和峰面積的線性關(guān)系良好，可以滿足定量分析的要求。

圖5 白藜蘆醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Thestandard curveof resveratrol

2.7精密度研究

取2014年份赤霞珠干紅葡萄酒，在2.3色譜條件下，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣5次，進(jìn)行精密度研究，記錄峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD），研究結(jié)果見表1。

表1 酒樣的精密度研究結(jié)果Table1 Resu ltsof research on the precision ofwinesam ples

表明樣品的峰面積基本穩(wěn)定，計(jì)算得5次分析的RSD=1.16%，表明該方法下精密度良好。

2.8穩(wěn)定性研究

取4mg/L白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，按確定的色譜條件分別在0、2、4、6、16、24 h進(jìn)樣檢測(cè)。

表2 標(biāo)樣的穩(wěn)定性研究結(jié)果Table2 Resultsof stability studies

由表2可知，隨著時(shí)間的增加，標(biāo)樣檢測(cè)的峰面積逐漸增大，白藜蘆醇濃度的檢測(cè)結(jié)果逐漸偏大，分析原因可能是研究室溫度偏高，自動(dòng)進(jìn)樣瓶中的甲醇隨時(shí)間揮發(fā)。計(jì)算穩(wěn)定性試驗(yàn)的峰面積的RSD為2.9%，表明檢測(cè)條件下白藜蘆醇的穩(wěn)定性較好。

2.9加標(biāo)回收率研究

回收率是指在既定的色譜條件下，在含有已知量白藜蘆醇的樣品中加入一定量的白藜蘆醇標(biāo)品，在相同檢測(cè)條件下得到的分析結(jié)果添加量占實(shí)際添加量的百分比，計(jì)算公式[21-23]見（1）：

向已知濃度的2014年份赤霞珠樣品中分別添加1、2、4mg/L的白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，在選定色譜條件下檢測(cè)，計(jì)算。酒樣的回收率研究結(jié)果見表3。

表3 酒樣的回收率研究結(jié)果Table3 Resultsof recovery ofwine samp les

由表3可知，赤霞珠酒樣的平均回收率為97.12%，RSD為1.25%。結(jié)果表明樣品回收率良好，方法的準(zhǔn)確性較高。

2.10實(shí)際樣品的測(cè)定與含量比較

西夏王葡萄酒中白藜蘆醇的含量隨葡萄品種和年份的不同而變化，結(jié)果見表4。

表4 不同品種、年份葡萄酒中白藜蘆醇含量Table4 Resveratrol content in grapew ine from different varieties and years

由表4表明：同一品種葡萄，年份不同，白藜蘆醇含量也不同。紅葡萄酒（蛇龍珠、梅鹿輒、赤霞珠）中白藜蘆醇含量普遍較高，而白葡萄酒（貴人香、霞多麗）中白藜蘆醇的含量則較低，其中蛇龍珠干紅的白藜蘆醇的含量最高，2014年份含量為6mg/L，2013年份含量為5.52mg/L；比較發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇含量在葡萄酒中的含量變化為：蛇龍珠最優(yōu)，梅鹿輒、赤霞珠、霞多麗次之，貴人香最低。

3結(jié)論

研究分別討論并考察溶劑、檢測(cè)波長(zhǎng)、洗脫強(qiáng)度、梯度洗脫、流動(dòng)相pH值，柱溫，樣品pH值等因素對(duì)樣品中白藜蘆醇分離效果的影響，建立了HPLC檢測(cè)葡萄酒中白藜蘆醇的方法、線性關(guān)系研究及精密度研究、穩(wěn)定性研究、回收率研究。表明該方法的精密度、穩(wěn)定性、加標(biāo)回收率較好，適用于一般葡萄酒樣品中白藜蘆醇的的定量分析檢測(cè)。樣品檢測(cè)發(fā)現(xiàn)紅葡萄酒中白藜蘆醇含量普遍較高，而白葡萄酒中白藜蘆醇的含量則較低。該研究為白藜蘆醇成分與特征研究提供理論依據(jù)，對(duì)葡萄酒中白藜蘆醇的檢測(cè)提供重要參考。

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Rapid Determ ination of Resveratrol in Ningxia W ine by High Performance Liquid Chromatography

FENGYu-qin，GUOHong-yan，LIUGui-shan*，HE Jian-guo，WANGSong-lei，HEXiao-guang
（AgriculturalCollege，Ningxia University，Yinchuan 750021，Ningxia，China）

The effectsof detection wavelength，solventstrength，mobile phase pH，column temperature，sample pH and other factorson the separation ofwineswere examined.A direct injection HPLCmethod for determination of resveratrol inwinewasestablished.The correlation coefficient rwas0.999 9，linear rangewas1mg/L-20mg/L，RSD ofprecision experiment，stability experimentand recovery experimentwere 1.16%，2.9%and 1.25%respectively.Itwas found that resveratrol contentofwines varied with years and varieties，its changing law was：CabernetGernischtwas the best chioce，Merlotand Cabernet Sauvignon and Chardonnay took second，the lastwasRiesling.Resveratrolcontent in CabernetGernischtwasup to6mg/L.

resveratrol；HPLC；rateof recovery；wine

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.05.033

2016-05-18

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31401480）

馮愈欽（1992—），男（漢），碩士研究生，研究方向：食品加工與安全。

*通信作者：劉貴珊（1979—），男，副教授，博士，研究方向：功能性食品營(yíng)養(yǎng)與評(píng)價(jià)。