高效液相色譜法測(cè)定柴胡配方顆粒中柴胡皂苷a含量

繆希紅，李曉燕，高君文，蘇平菊

（1．河北省承德市中心醫(yī)院，河北 承德 067000； 2．河北以嶺醫(yī)藥研究院，河北 石家莊 050035）

·檢驗(yàn)檢測(cè)·

高效液相色譜法測(cè)定柴胡配方顆粒中柴胡皂苷a含量

繆希紅1，李曉燕2，高君文2，蘇平菊2

（1．河北省承德市中心醫(yī)院，河北 承德 067000； 2．河北以嶺醫(yī)藥研究院，河北 石家莊 050035）

目的建立測(cè)定柴胡配方顆粒中柴胡皂苷a含量的高效液相色譜(HPLC)法。方法色譜柱采用Welch Ultimate XB-C18柱（250mm× 4．6mm，5 m），以乙腈-甲醇-0．1%磷酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。結(jié)果柴胡皂苷a進(jìn)樣量在0．660 4～6．604 0 g范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，回歸方程為 Y＝288．216X-6．057，r＝0．999 97，柴胡皂苷a的平均回收率為101．99%，RSD為1．91%（n＝9）。結(jié)論該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于柴胡配方顆粒的質(zhì)量控制。

高效液相色譜法；柴胡配方顆粒；柴胡皂苷a

柴胡配方顆粒是由中藥材柴胡經(jīng)提取、濃縮、分離、干燥、制粒及包裝等加工工藝制成的顆粒劑，具有疏散退熱、疏肝解郁、升舉陽(yáng)氣的功效[1]，用于和解退熱、疏肝解郁、升舉陽(yáng)氣、升散除濕等[2]。服用方便，劑量準(zhǔn)確，高效迅速，質(zhì)量穩(wěn)定，近年來(lái)，其銷量逐年上升，深得消費(fèi)者青睞[3]。柴胡配方顆粒中的主要藥味柴胡為歷版《中國(guó)藥典》收載藥材，應(yīng)用廣泛，其主要化學(xué)成分為三萜皂苷類成分，包括柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷b3、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d等[4-5]，均有很強(qiáng)的藥理活性，其中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d含量較高，是柴胡重要的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)[6-8]。為了更好地控制柴胡配方顆粒的質(zhì)量，本研究中采用高效液相色譜(HPLC)法對(duì)柴胡皂苷a進(jìn)行了含量測(cè)定，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

Agilent1100型高效液相色譜儀，包括VWD紫外檢測(cè)器（美國(guó)安捷倫公司）；KQ-250B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AT201型電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1．2 試藥

柴胡皂苷a對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為110777-200406）；柴胡配方顆粒（石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)為150101）；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件

色譜柱：WelchUltimateXB-C18柱(250mm×4．6mm，5μm)；流動(dòng)相：乙腈為流動(dòng)相 A，甲醇為流動(dòng)相 B，0．1%磷酸溶液為流動(dòng)相C，梯度洗脫，見(jiàn)表1；流速：1 mL／min；柱溫：26℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm。理論板數(shù)按柴胡皂苷a峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

2．2 溶液制備

對(duì)照品溶液：取柴胡皂苷a對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含柴胡皂苷a0．2mg的溶液，即得。

供試品溶液：取本品，研細(xì)，取1．0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25m L，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250W，頻率40 kHz）20min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

陰性對(duì)照品溶液：因本制劑為單味藥材且制劑時(shí)未添加輔料，取制備供試品溶液用的甲醇。

2．3 方法學(xué)考察

陰性干擾試驗(yàn)：取2．2項(xiàng)下3種溶液各10μL，分別注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液相應(yīng)位置上有相同保留時(shí)間色譜峰，陰性對(duì)照無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：精密吸取質(zhì)量濃度為 0．066 04，0．132 08，0．198 12，0．330 2，0．660 4 g／L的柴胡皂苷a對(duì)照品溶液各10μL，分別注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，以峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 Y＝288．216X-6．057，r＝0．999 97。結(jié)果表明，柴胡皂苷a進(jìn)樣量在0．660 4～6．604 0μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn)：精密吸取對(duì)照品溶液10μL，在擬訂色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積。結(jié)果對(duì)照品的平均峰面積為569．391，RSD為0．69%（n＝5），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取供試品溶液 10μL，分別于 0，2，4，6，8，10，12，24 h時(shí)進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。結(jié)果的 RSD為1．82%（n＝8），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品9份，分別取高、中、低3個(gè)劑量，依法制備供試品溶液，測(cè)定含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 柴胡皂苷a重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）

加樣回收試驗(yàn)：取同一批樣品9份，分為3組，分別精密加入25m L高、中、低3種質(zhì)量不同濃度的柴胡皂苷a對(duì)照品溶液，進(jìn)行超聲提取，測(cè)定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 柴胡皂苷a加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）

耐用性試驗(yàn)：取同一批樣品，分別在不同測(cè)定波長(zhǎng)、不同柱溫及不同色譜條件下檢測(cè)柴胡皂苷a的含量。結(jié)果在210，208，212 nm波長(zhǎng)下，柴胡皂苷 a的 RSD為1．70%(n＝3)；在24，26，28，30℃柱溫下，柴胡皂苷a的 RSD為1．54%(n＝4)；3種不同色譜柱對(duì)樣品的分離無(wú)影響，柴胡皂苷a的 RSD為1．68%(n＝3)?？梢?jiàn)，測(cè)定條件的微小變動(dòng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果無(wú)影響。

2．4 樣品含量測(cè)定

用所建立的含量測(cè)定方法，測(cè)定3批柴胡配方顆粒柴胡皂苷a的含量，結(jié)果批號(hào)為150101，150102，150103的3批樣品中柴胡皂苷a的含量分別為4．6641，3．7038，3．708 8mg／g。

3 討論

3．1 色譜條件選擇

柴胡中的主要成分柴胡皂苷a和柴胡皂苷d在紫外區(qū)僅有末端吸收，該區(qū)域成分較多，不易進(jìn)行定量測(cè)定，檢測(cè)時(shí)易受到試劑的干擾[9]。另外，皂苷類成分樣品處理較復(fù)雜，故對(duì)其定量測(cè)定不多。目前，柴胡制劑中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的測(cè)定方法主要為HPLC法，檢測(cè)器有ELSD檢測(cè)器和VWD紫外檢測(cè)器[10-14]，流動(dòng)相為甲醇-乙腈-水 (25∶45∶30)、乙腈-水(28∶72)及乙腈-水進(jìn)行梯度洗脫。本研究中曾采用2010年版《中國(guó)藥典（一部）》柴胡項(xiàng)下含量測(cè)定的流動(dòng)相[1]，對(duì)乙腈-水進(jìn)行梯度洗脫，但該流動(dòng)相柴胡皂苷a分離不好，且峰形不對(duì)稱，經(jīng)反復(fù)調(diào)整流動(dòng)相比例，并在流動(dòng)相中添加甲醇和磷酸，使柴胡皂苷a獲得良好分離，峰形對(duì)稱，基線平穩(wěn)，梯度洗脫可縮短分析時(shí)間，降低檢測(cè)成本。

3．2 樣品處理篩選

柴胡皂苷測(cè)定的樣品處理方法有采用甲醇超聲提取，大孔吸附樹(shù)脂除雜[10]，采用5%濃氨試液的甲醇溶液提取后用正丁醇萃取的方法[11-13]，以及采用甲醇提取、正丁醇萃取、堿洗的處理方法[13]等，但處理過(guò)程煩瑣，操作復(fù)雜，不利于大批量生產(chǎn)的產(chǎn)品控制。本研究中采用甲醇超聲提取，取續(xù)濾液即可，方法簡(jiǎn)單，易操作，特別適用于大批量生產(chǎn)的產(chǎn)品質(zhì)量控制。

3．3 提取溶劑選擇

本研究曾對(duì)70%甲醇、甲醇及含5%濃氨試液的甲醇溶液提取的樣品進(jìn)行柴胡皂苷a檢測(cè)，結(jié)果3種溶劑測(cè)定的柴胡皂苷a含量差異不明顯，色譜峰也無(wú)差異，為簡(jiǎn)化操作，選擇用甲醇做提取溶劑；為保證柴胡皂苷a提取充分，對(duì)提取溶劑用量及超聲處理時(shí)間進(jìn)行考察，結(jié)果提取溶劑選擇25m L與50m L時(shí)柴胡皂苷a含量無(wú)差異，超聲處理時(shí)間20～40 min對(duì)柴胡皂苷a含量影響不大。

3．4 不足

柴胡在煎煮過(guò)程中皂苷類成分存在結(jié)構(gòu)性轉(zhuǎn)變[15-16]，柴胡配方顆粒中柴胡在提取過(guò)程中成分發(fā)生變化，導(dǎo)致柴胡皂苷d的含量過(guò)低，無(wú)法進(jìn)行定量測(cè)定，因此本研究中僅對(duì)柴胡皂苷a進(jìn)行了含量測(cè)定。

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Content Determ ination of Saikosaponin A in Chaihu Dispensing G ranules by HPLC

Miao Xihong1,Li Xiaoyan2,Gao Junwen2,Su Pingju2
(1．Chengde Central Hospital,Chengde,Hebei,China 067000; 2．Hebei Yiling Medicine Institute,Shijiazhuang,Hebei,China 050035)

Ob jective To establish an HPLC method for the content determination of saikosaponin a in Chaihu Dispensing Granules．M ethods HPLC analysis was performed on an Welch Ultimate XB-C18column(250 mm×4．6 mm,5 μm)with acetonitrilemethanol-0．1% phosphoric acid solution as mobile phase for gradient elution．The detection wavelength was at 210 nm．Results The calibration curve of saikosaponin a showed a good linearity within the range of 0．660 4-6．604 0μg,and the regression equation was Y＝288．216 X-6．057(r＝0．999 97)．The average recovery was 101．99% and RSD was 1．91%(n＝9)．Conclusion The method is convenient,accurate and reproducible to operate and is suitable for the quality control of Chaihu Dispensing Granules．

HPLC;Chaihu Dispensing Granules;saikosaponin a

R284.1；R286.0

A

1006-4931(2017)03-0033-03

2016-06-22；

2016-10-20)

10．3969／j．issn．1006-4931．2017．03．011

繆希紅（1974-），女，滿族，副主任中醫(yī)師，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)臨床及制劑開(kāi)發(fā)，（電子信箱）944359932＠qq．com。

李曉燕（1974-），女，滿族，正高級(jí)工程師，研究方向?yàn)橹兴幮滤庨_(kāi)發(fā)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，（電話）0311-66703013（電子信箱）sjzyllxy＠163．com。