動物源性食品中喹諾酮類藥物殘留的檢測

摘 要：建立一種采用微生物顯色法對動物源性食品中抗生素殘留進(jìn)行初篩，之后再結(jié)合高效液相色譜-質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）法對陽性樣品進(jìn)行復(fù)測的分析檢驗(yàn)方法。利用大腸桿菌（E.coli）作為指示菌，制備96微孔板，選取pH 7.4磷酸鈉-乙腈緩沖液進(jìn)行提取，以反應(yīng)液150 μL、菌液50 μL（初始A600 nm0.4左右）、樣品提取液100 μL作為檢測體系，可同時檢測15 種喹諾酮類藥物。結(jié)果表明：所建立的微生物顯色法操作簡便、快捷、成本低，結(jié)果準(zhǔn)確且易判斷，對動物源性食品中喹諾酮類藥物檢出限為40～200 μg/kg，符合國內(nèi)外對抗生素殘留限量的要求。對50 份動物源性樣品進(jìn)行檢測，其結(jié)果與HPLC-MS復(fù)測結(jié)果一致，說明該微生物法穩(wěn)定性良好，可用于動物源性食品中喹諾酮類藥物殘留的初篩檢測。

關(guān)鍵詞：微生物顯色法；高效液相色譜-質(zhì)譜法；喹諾酮類藥物；動物源性食品

Abstract： A new microbial chromogenic assay was developed to analyze antibiotic residues in animal-derived food and after that， the positive samples were identified by a high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric （HPLC-MS） method. E.coli was used as the indicator strain to produce a 96-well microplate for detecting 15 kinds of quinolones. Muscle samples were extracted by pH 7.4 phosphate-acetonitrile buffer. This system of microbial chromogenic assay consisted of 150 μL the reaction solution， 50 μL of bacterial suspension （the initial A600 nm value was around 0.4）， and

100 μL of the extract solution. The assay proved to be simple and cheap and the results were accurate and easy to interpret. The detection limits for 15 kinds of quinolones drugs were 40?200 μg/kg， meeting the domestic and international requirements for the determination of antibiotic residue limits. Consistent results were obtained for 50 samples of animal-derived food by microbial chromogenic assay and HPLC-MS， indicating that the assay could be used to detect antibiotic residues in animal-derived food with good stability.

Key words： microbial chromogenic assay； high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （HPLC-MS）； quinolones； animal-derived food

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201704007

中國分類號：TS252.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2017）04-0036-07

引文格式：

范維， 高曉月， 陳超， 等. 動物源性食品中喹諾酮類藥物殘留的檢測[J]. 肉類研究， 2017， 31（4）： 36-42. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201704007. http：//www.rlyj.pub

FAN Wei， GAO Xiaoyue， CHEN Chao， et al. Screening and confirmation of quinolones residues in animal-derived food[J]. Meat Research， 2017， 31（4）： 36-42. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201704007. http：//www.rlyj.pub

喹諾酮類藥物（quinolones，QNs）是人工合成的具有1，4-二氫-4-氧代喹啉-3-羧酸結(jié)構(gòu)的一類藥物總稱[1]。該藥作為抗生素使用已有超過50 年的歷史，主要通過阻斷特異性拓?fù)涿?，抑制?xì)菌DNA復(fù)制從而發(fā)揮抗菌作用[2]，該藥具有價格低廉、抗菌譜廣、無交叉耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用在臨床及養(yǎng)殖領(lǐng)域。但喹諾酮類藥物常有不合理使用和濫用的情況發(fā)生，使其或其代謝產(chǎn)物殘留于動物的肌肉和臟器組織中，進(jìn)而通過食物鏈導(dǎo)致人體產(chǎn)生抗藥性，影響疾病治療與康復(fù)，引起嚴(yán)重的食品安全問題和出口貿(mào)易問題[3]。因此，喹諾酮類藥物殘留問題越來越引起人們的重視。

目前，畜禽肉中檢測抗生素殘留方法主要有微生物檢測法[4-5]、色譜法[6-7]和免疫分析法[8]等。其中色譜法較為常用，可以進(jìn)行定性定量檢測，結(jié)果靈敏準(zhǔn)確，但設(shè)備投入大，人員技能要求高，適合大型綜合性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行仲裁判定和確證[9-10]；免疫分析法雖靈敏度高，但是檢測成本昂貴，只能檢測單一抗生素[11]，不易于推廣；相較于前2 種方法，微生物法敏感性強(qiáng)、成本低廉、操作簡單，可作為一種抗生素初篩方法應(yīng)用在農(nóng)產(chǎn)品安全監(jiān)管環(huán)節(jié)，并可在中小型企業(yè)得到普及。因此，本研究建立了一種快速對動物源性食品中喹諾酮類藥物殘留進(jìn)行初篩的微生物顯色方法，并可根據(jù)具體需要進(jìn)行色譜法復(fù)測，使結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌（E.coli） 中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC1.1369）；禽畜肉購于超市，經(jīng)檢驗(yàn)不含喹諾酮類藥物殘留。

奧比沙星（orbifloxacin，ORB）、丹諾沙星（danofloxacin，DAN）、二氟沙星（difloxacin，DIF）、惡喹酸（oxolinic，OXO）、恩諾沙星（enrofloxacin，ENR）、氟甲喹（flumequine，F(xiàn)LU）、氟羅沙星（fleroxacin，F(xiàn)LE）、環(huán)丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、洛美沙星（lomefloxacin，LOM）、諾氟沙星（norfloxacin，NOR）、培氟沙星（pefloxacin，PEF）、沙拉沙星（sarafloxacin，SAR）、司帕沙星（sparfloxacin，SPA）、氧氟沙星（ofloxacin，OFL）、依諾沙星（enoxacin，ENO）標(biāo)

準(zhǔn)品 德國Dr.Ehrenstorfer公司；蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉、牛肉粉、葡萄糖、瓊脂、營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂、溴甲酚紫 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；甲醇、乙腈、甲酸為色譜純；其他試劑均為分析純。

培養(yǎng)基：1）固體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g、牛肉膏3.0 g、NaCl 5.0 g、瓊脂15.0 g溶于1 000 mL蒸餾水中，用NaOH溶液調(diào)pH值為7.3，121 ℃高壓滅菌15 min。2）液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g、葡萄糖2.0 g、牛心粉5.0 g、NaCl 5.0 g、蒸餾水1 000 mL，用Na2HPO4·12 H2O溶液調(diào)pH值為7.4，121 ℃高壓滅菌15 min。3）檢測液：蛋白胨10.0 g、牛肉浸膏3.0 g、葡萄糖10.0 g、NaCl 5.0 g、溴甲酚紫指示劑0.04 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH值調(diào)至7.0，121 ℃高壓滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

SYNERGY H4酶標(biāo)儀 美國伯騰儀器有限公司；DHP-9272恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；UltiMate3000-TSQ QUANTUM ULTRA液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有電噴霧離子源） 美國Thermo公司；SCR20BA離心機(jī) 日本日立儀器有限公司；PHS-3C pH計(jì)

上海雷韻儀器有限公司；ESJ120-4電子天平 龍騰儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

抗生素標(biāo)準(zhǔn)儲備液：將15 種喹諾酮標(biāo)準(zhǔn)品分別稱取0.010 0 g，置于10.0 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，

-20 ℃可保存3 個月。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：將以上各標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋，配成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，各組分質(zhì)量濃度為10 μg/mL，4 ℃條件下可保存3 個月。

不同pH值磷酸鈉緩沖溶液：A液：稱取72 g Na2HPO4·12H2O，用去離子水定容至1 000 mL。B液：稱取31 g NaH2PO4·2H2O，用去離子水定容至1 000 mL。pH 6.8：取A液49.5 mL和B液50.0 mL進(jìn)行混合；pH 7.0：取A液61.0 mL和B液39.0 mL進(jìn)行混合；pH 7.4：取A液81 mL和B液19 mL進(jìn)行混合；pH 8.0：取A液94.7 mL和B液5.3 mL進(jìn)行混合。

磷酸鈉-乙腈緩沖液：將不同pH值的磷酸鈉緩沖溶液和乙腈等體積混合。

磷酸鈉-丙酮緩沖液：將不同pH值的磷酸鈉緩沖溶液和丙酮等體積混合。

1.3.2 樣品預(yù)處理

1.3.2.1 微生物顯色法

稱取8 份均質(zhì)好的10 g鮮肉樣品（精確到0.1 g）于50 mL離心管中，分別向其中4 份加入10 mL pH值為6.8、7.0、7.4、8.0的磷酸鈉-乙腈緩沖溶液，其余4 份各加入10 mL不同pH值的磷酸鈉-丙酮緩沖溶液，漩渦振蕩3 min，開蓋置于70 ℃水浴中加熱10 min，5 000 r/min離心3 min，取上清液用于微生物檢測。

1.3.2.2 高效液相色譜-質(zhì)譜（high performance liquid chroma-mass spectrography，HPLC-MS）法

樣品參照GB/T 21312—2007[12]進(jìn)行前處理。

1.3.3 微生物顯色法檢測

1.3.3.1 微生物初始濃度及檢測體系組成比例的確定

無菌狀態(tài)下，從固體培養(yǎng)基上挑取已培養(yǎng)24 h的嗜熱脂肪芽孢桿菌菌落，接入液體培養(yǎng)基中，分別配成吸光度（A600 nm）為0.1、0.4、0.6、0.8、1.0的菌懸液。取96孔板，將各菌懸液分別加入到以下3 組體系中，A組為檢測液180 μL、菌懸液20 μL、生理鹽水100 μL；B組為檢測液150 μL、菌懸液50 μL、生理鹽水100 μL、C組為檢測液100 μL、菌懸液100 μL、生理鹽水100 μL。于36 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，確定各組變色（反應(yīng)液由紫變黃）時間。將變色時間較短的組合中生理鹽水換成0.1 μg/mL恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行抗生素敏感度實(shí)驗(yàn)，于36 ℃條件下恒溫培養(yǎng)，觀察變色情況，選出結(jié)果呈陽性組（檢測液紫色為陽性，黃色為陰性），最終優(yōu)化出最適的微生物初始濃度和檢測體系組成比例。

1.3.3.2 微生物顯色法檢測程序

取96孔板，按1.3.3.1節(jié)優(yōu)化的比例，在第1列只加入檢測液，在第2～12列加入檢測液和菌懸液，之后在第2列加入無抗生素的鮮肉提取液，在第3～12列加入不同抗生素標(biāo)準(zhǔn)液或樣品提取液，于36 ℃條件下恒溫培養(yǎng)至第2列變成黃色，觀察其他列顏色變化。

1.3.3.3 微生物顯色法檢出限的確定

用去離子水將15 種抗生素標(biāo)準(zhǔn)儲備液分別稀釋成0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20 μg/mL共10 個梯度，以注射的方式加入到無抗生素鮮肉中，靜置使其充分吸收。按上述微生物法進(jìn)行檢測，確定各種抗生素檢出限。

1.3.3.4 指示菌傳代穩(wěn)定性的確定

將大腸桿菌連續(xù)傳代至第5代，用各代菌對恩諾沙星、沙拉沙星、氟甲喹和二氟沙星的檢出限進(jìn)行測定，并確定反應(yīng)時間，以此判斷指示菌的傳代穩(wěn)定性。

1.3.4 HPLC-MS法檢測

1.3.4.1 檢測條件

樣品參照GB/T 21312—2007《動物源性食品中14 種喹諾酮藥物殘留檢測方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》[12]，運(yùn)用UltiMate 3000-TSQ QUANTUM ULTRA液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行檢測。

1.3.4.2 HPLC-MS法標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限確定

將混合標(biāo)準(zhǔn)工作液配制成0.005、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 μg/mL共6 個梯度，用上述色譜條件進(jìn)行測定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。并以3 倍信噪比（RS/N=3）確定其方法檢出限，10 倍信噪比（RS/N=10）確定其定量限。

1.3.5 樣品測定

將無喹諾酮類藥物殘留的鮮肉樣品（豬肉20 份、牛肉10 份、羊肉10 份、禽肉10 份），分別用序號1～50標(biāo)識。隨機(jī)從中抽取15 個樣品，每個樣品注射1 種一定濃度（該種抗生素國家規(guī)定的最大殘留限量值）的喹諾酮類藥物，用微生物法和HPLC-MS法同時對50 個樣品中喹諾酮類藥物殘留進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物法提取緩沖液的確定

本實(shí)驗(yàn)所用指示劑為溴甲酚紫，其變色范圍是pH值6.8（紫色）～5.6（黃色），而市售鮮肉的pH值一般在6.6～5.8之間，肉汁本身酸堿性對檢測液變色效果影響較大[13-14]。實(shí)驗(yàn)選取不同pH值的磷酸鹽緩沖溶液和有機(jī)試劑進(jìn)行組合，對樣品進(jìn)行前處理，結(jié)果見表1。

由表1可知，當(dāng)提取液pH值小于7.4時，鮮肉提取液加入到檢測體系中，會使檢測液瞬間變黃；當(dāng)提取液pH值較高時，則會延長反應(yīng)時間。選用乙腈作為蛋白沉淀劑效果較好且反應(yīng)時間較丙酮短，可能由于乙腈對大腸桿菌活性影響較小[15-17]。因此，選取pH值為7.4的磷酸鈉-乙腈緩沖溶液對樣品中的喹諾酮藥物進(jìn)行提取。

2.2 微生物初始濃度及檢測體系的確定

用生理鹽水作為樣品提取液按比例加入到檢測體系中，確定菌懸液濃度和檢測體系組成比例對反應(yīng)時間的影響，結(jié)果見表2。

由表2可知，當(dāng)菌懸液初始吸光度A600 nm≥0.4時，B、C兩組反應(yīng)時間較短，均能在4 h內(nèi)變色，因此用這2 組進(jìn)行抗生素敏感度實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表3。

由表3可知，菌懸液初始吸光度較高或加入菌懸液體積較大時，抗生素對菌的抑制效果不明顯，反應(yīng)液變?yōu)辄S色，達(dá)不到檢測目的，因此選擇A600 nm為0.4作為菌懸液初始吸光度，反應(yīng)液150 μL、菌懸液50 μL、樣品提取液100 μL作為檢測體系。該法比傳統(tǒng)平板法省時省力，采用指示劑顯色作為判別標(biāo)準(zhǔn)也比抑菌圈更易于觀察，滿足快速檢測的要求。

2.3 微生物顯色法的檢出限

按1.3.3.3節(jié)方法進(jìn)行檢測，以顏色未發(fā)生變化的標(biāo)準(zhǔn)液濃度為該抗生素的最小檢測濃度，結(jié)果見表4。

由表4可知，本方法各類抗生素檢出限均小于我國農(nóng)業(yè)部規(guī)定的動物性食品中獸藥最高殘留限量[18]，雖然檢出的陰性樣品中可能含有抗生素，但其含量低于最高殘留限量，依然是合格產(chǎn)品，因此該法可以滿足初篩檢測的要求。其中對恩諾沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星較為敏感，檢出限為60 μg/kg，這與沈翠香[19]的研究結(jié)果相似。本研究選用的指示劑溴甲酚紫，顏色變化明顯，易用肉眼區(qū)分。當(dāng)樣品中沒有抗生素殘留或是抗生素殘留低于檢出值時，大腸桿菌在36 ℃條件下快速生長產(chǎn)酸，使檢測體系pH值下降，導(dǎo)致指示劑由紫色變成黃色；反之，若抗生素殘留濃度高于檢出值，則會抑制檢測菌的生長，使得檢測體系的pH值基本保持不變，指示劑不會變色[20-22]。本研究所采用的96微孔板，除去空白對照列，還有80多個孔可以用于樣品檢測，即便采用4 次重復(fù)，仍然可以同時對20 個樣品進(jìn)行檢測，并且可以對多種抗生素成分進(jìn)行篩檢，是一種高通量的微生物檢測方法。

2.4 指示菌傳代穩(wěn)定性

由表5可知，對于同一種抗生素，各代菌測定的檢出限相同，說明前5 代菌對抗生素的敏感程度一致。從反應(yīng)時間來看，第1代菌所需反應(yīng)時間略長，后幾代菌的反應(yīng)時間趨于穩(wěn)定，5 代菌均能在3～4 h內(nèi)使指示劑變色。因此，前5 代菌具有較好的穩(wěn)定性，均可以用于微生物顯色法檢測。

2.5 HPLC-MS法檢出限

將不同質(zhì)量濃度的抗生素標(biāo)準(zhǔn)溶液分別在上述色譜條件下進(jìn)行測定，15 種抗生素的質(zhì)量濃度在0.005～0.1 μg/mL范圍內(nèi)，與其峰面積呈良好線性關(guān)系（R2>0.991），滿足定量要求，其標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖1，

圖1A～O分別為15 種喹諾酮類藥物的多反應(yīng)檢測（multiple reaction monitoring，MRM）色譜圖，檢出限結(jié)果如表4所示。色譜法靈敏度較高，其檢出限遠(yuǎn)小于國家規(guī)定的獸藥最大殘留限量，這就導(dǎo)致一些含有極少抗生素的合格樣品被檢測出來，造成時間和成本的浪費(fèi)。相較于色譜法，微生物顯色法的檢出限更接近最大殘留限量，因此用微生物法初篩呈陽性的樣品更有可能是不合格樣品，之后將這些陽性樣品用色譜法進(jìn)行復(fù)測，可以節(jié)約時間和成本。

由表6可知，微生物法檢測共有18 個樣品呈陽性，經(jīng)HPLC-MS復(fù)測，其中15 個陽性樣品含有喹諾酮類藥物，其余3個為假陽性樣品，據(jù)研究[23-26]大腸桿菌除對喹諾酮藥物敏感外，對慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素及青霉素類藥物也有較高的敏感性，因此3 個假陽性樣品存在含有其他抗生素殘留的可能。而微生物法檢測呈陰性的32 個樣品，經(jīng)HPLC-MS法驗(yàn)證，沒有測出喹諾酮類藥物殘留，說明該微生物顯色法結(jié)果較可靠，雖存在一定的假陽性結(jié)果，但只要抗生素殘留量超過其方法檢出限，無假陰性結(jié)果存在。

3 結(jié) 論

本研究選用的大腸桿菌對喹諾酮類藥物具有較高敏感性，且產(chǎn)酸迅速，是一種理想的抗生素快速檢測菌，按本研究優(yōu)化的菌懸液初始濃度及檢測體系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，可在3～4 h內(nèi)使指示劑變色，比傳統(tǒng)平板法省時省力[27]。

該方法采用96孔板，可以在一個板上同時對幾十個樣品進(jìn)行篩選，用指示劑顯色作為判別標(biāo)準(zhǔn)也比傳統(tǒng)抑菌圈便于觀察[28-30]。該微生物顯色法檢測成本較低，檢測一個樣品成本不到1 元，是一種快捷、簡單、低成本的檢測方法。用HPLC-MS法對微生物法篩檢出的32 個陰性樣品進(jìn)行檢測，15 種抗生素均未被檢出，說明本研究建立的微生物顯色法結(jié)果可靠，沒有假陰性。因此可以采用該微生物顯色法對樣品中喹諾酮類藥物進(jìn)行初篩，再以色譜法對呈陽性的樣品進(jìn)行檢測，以便減少工作量和提高檢測效率，這將在普通的檢測實(shí)驗(yàn)室具有良好的應(yīng)用前景。

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