中溫乳化腸中凝結(jié)芽孢桿菌芽孢萌發(fā)及熱致死規(guī)律

摘 要：從中溫乳化香腸中篩選出一株凝結(jié)芽孢桿菌芽孢，以20 種氨基酸、D-果糖、D-葡萄糖、氯化鉀為萌發(fā)劑，通過(guò)相差顯微鏡及生長(zhǎng)曲線測(cè)定儀測(cè)定600 nm波長(zhǎng)下光密度值，研究該芽孢萌發(fā)規(guī)律，同時(shí)研究7 種防腐劑對(duì)芽孢萌發(fā)效果影響及不同溫度熱脅迫處理后的芽孢致死率。結(jié)果表明：葡萄糖可以促進(jìn)凝結(jié)芽孢桿菌芽孢萌發(fā)，增大其濃度對(duì)芽孢萌發(fā)率無(wú)影響；繪制了芽孢萌發(fā)率標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)為0.977 8；亞硝酸鈉、山梨酸鉀、乳酸鏈球菌素（nisin）和脫氫乙酸鈉對(duì)芽孢萌發(fā)無(wú)影響，乳酸鈉、葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯和雙乙酸鈉可以抑制芽孢萌發(fā)；采用90 ℃及95 ℃對(duì)芽孢熱脅迫致死效果較差，100 ℃熱處理最高致死率可達(dá)92.09%，105～120 ℃熱脅迫處理對(duì)該芽孢致死率在15 min內(nèi)可以接近100%。

關(guān)鍵詞：凝結(jié)芽孢桿菌芽孢；芽孢萌發(fā)；生長(zhǎng)規(guī)律；熱脅迫；致死率；防腐劑

Abstract： The spore germination of a Bacillus coagulans stain isolated from medium-temperature sterilized emulsified sausage was investigated using 20 amino acids， D-fructose， D-glucose and potassium chloride as germination inducers by phase contrast microscopic morphology observation and measurement of optical density （OD） values at 600 nm with a Bioscreen growth analyzer. Also， we examined the effect of seven preservatives on spore germination and we evaluated spore inactivation after heat treatment at different temperatures. Results showed that glucose could promote the germination of Bacillus coagulans spore， and the spore germination percentage did not changed with increasing glucose concentration. A standard curve with a correlation coefficient of 0.977 8 was established to determine the spore germination percentage. Sodium nitrite， potassium sorbate， nisin and dehydrogenation sodium acetate had no effects on spore germination， whereas sodium lactate， glucose acid-δ-lactone and sodium acetate could inhibit spore germination. When treated at 100 ℃， the inactivation percentage was up to 92.09%， and at 105–120 ℃， the value was almost 100% within 15 min； however， the spores were not effectively inactivated at 90 and 95 ℃.

Key words： Bacillus coagulans spore； spore germination； growth pattern； heat stress； inactivation percentage； preservative

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201704003

中圖分類號(hào)：TS251.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2017）04-0010-07

引文格式：

李素， 張順亮， 潘曉倩， 等. 中溫乳化腸中凝結(jié)芽孢桿菌芽孢萌發(fā)及熱致死規(guī)律[J]. 肉類研究， 2017， 31（4）： 10-16. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201704003. http：//www.rlyj.pub

LI Su， ZHANG Shunliang， PAN Xiaoqian， et al. Spore germination and thermal inactivation of a Bacillus coagulans strain isolated from medium-temperature sterilized emulsified sausage[J]. Meat Research， 2017， 31（4）： 10-16. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201704003. http：//www.rlyj.pub

凝結(jié)芽孢桿菌是一種可以產(chǎn)生乳酸的芽孢桿菌，它同時(shí)具有芽孢桿菌及乳酸菌的特性，還具有調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道健康、提高免疫力等特點(diǎn)，因此凝結(jié)芽孢桿菌在飼料中的應(yīng)用研究逐漸增加[1]。但是，在肉制品加工與保藏過(guò)程中凝結(jié)芽孢桿菌的大量繁殖則會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品腐敗變質(zhì)。隨著人們對(duì)肉制品食用品質(zhì)需求的提高，中溫肉制品逐漸成為肉制品市場(chǎng)的焦點(diǎn)，中溫肉制品是指在一定壓力下，經(jīng)過(guò)90～110 ℃殺菌，結(jié)合綜合抑菌和品質(zhì)控制技術(shù)生產(chǎn)的肉制品[2]。中溫殺菌過(guò)程中大部分微生物會(huì)被殺死，但細(xì)菌的芽孢及部分耐熱菌等仍能存活下來(lái)，逐漸生長(zhǎng)為中溫肉制品的腐敗菌[3]。系列研究發(fā)現(xiàn)，眾多真空包裝低溫肉制品中主要腐敗菌為乳酸菌，包括乳桿菌屬（Lactobacillus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）等[4-8]。

芽孢桿菌的芽孢可以長(zhǎng)時(shí)間保持休眠狀態(tài)，一旦遇到適宜的環(huán)境，芽孢即可迅速萌發(fā)成為具有代謝功能的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，從而降低對(duì)外界刺激的耐受力[9-10]。芽孢可以通過(guò)多種刺激因素誘導(dǎo)萌發(fā)，包括糖、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)刺激萌發(fā)，也可以通過(guò)物理刺激如加熱、高壓等刺激誘導(dǎo)部分芽孢萌發(fā)等[11-12]。防腐劑常用于肉制品加工中，具有顯著的抑菌保鮮作用，防腐劑對(duì)細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)體抑制作用研究較多，但其對(duì)芽孢萌發(fā)及生長(zhǎng)特性的研究較少，國(guó)外也僅有少數(shù)關(guān)于耐熱芽孢桿菌及梭狀芽胞桿菌等有限菌株的芽孢的報(bào)道[13-16]，而國(guó)內(nèi)相關(guān)研究更是空白，僅有少數(shù)學(xué)者研究抑菌劑對(duì)芽孢的耐熱性影響[17]。目前認(rèn)為，微生物會(huì)呈現(xiàn)死亡、受損和未受損3 種狀態(tài)，受損細(xì)胞通常又被稱為亞致死細(xì)胞，細(xì)胞受損后在適宜的環(huán)境下又可以恢復(fù)其活力，從而影響食品保藏品質(zhì)[18]。對(duì)于細(xì)菌亞致死損傷的研究多集中于大腸埃希氏菌、沙門(mén)氏菌、單增李斯特菌等食源性病菌[19-20]，對(duì)于芽孢桿菌的亞致死損傷鮮有報(bào)道。

凝結(jié)芽孢桿菌是一種特殊的乳酸菌，多數(shù)研究將其作為有益菌進(jìn)行研究[21-22]，而在中溫乳化香腸貯藏中則是主要腐敗菌，它形成的芽孢具有良好耐熱性，對(duì)于凝結(jié)芽孢桿菌芽孢營(yíng)養(yǎng)萌發(fā)特性還未見(jiàn)報(bào)道，國(guó)外也僅有少數(shù)關(guān)于溫度及高壓處理對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌芽孢滅活動(dòng)力學(xué)的研

究[23-26]。本實(shí)驗(yàn)以前期從中溫乳化香腸中篩選的凝結(jié)芽孢桿菌芽孢為研究對(duì)象，分析營(yíng)養(yǎng)劑和抑菌劑對(duì)其萌發(fā)特性的影響及熱脅迫下的致死率，結(jié)合促芽孢萌發(fā)技術(shù)及其熱脅迫下的生長(zhǎng)規(guī)律，研究該腐敗菌的快速萌發(fā)殺滅技術(shù)，以期為中溫肉制品生產(chǎn)提供有效的腐敗微生物控制技術(shù)，為中溫肉制品加工條件的控制和保鮮技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

凝結(jié)芽孢桿菌CMRC BC-1 由本實(shí)驗(yàn)室人員從中溫乳化香腸篩分后鑒定保藏[27]；D-葡萄糖（D-glucose）（記為G）、D-果糖（D-fructose）（記為F）、氯化鉀（KCl）（記為K）、MnSO4·H2O、氨基酸 北京化學(xué)試劑廠；營(yíng)養(yǎng)瓊脂（nutrient agar，NA）培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基、平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任

公司；乳酸鏈球菌素（nisin）、亞硝酸鈉、乳酸鈉

北京迪朗生化科技有限公司；山梨酸鉀、脫氫乙

酸鈉 南通奧凱生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯

安徽省興宙醫(yī)藥食品有限公司；雙乙酸鈉 連云港信仁食品添加劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Bioscreen全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀 上海謂載商貿(mào)發(fā)展有限公司；生物安全柜 新加坡Esco公司；Primo Star生物顯微鏡配備DDC數(shù)顯通道 德國(guó)蔡司公司；G154DWS濕熱滅菌鍋 日本三洋公司；KB720培養(yǎng)箱 德國(guó)Binder公司；DF-101S磁力攪拌恒溫油浴鍋 上海力辰科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 芽孢培養(yǎng)與制備收集

參考文獻(xiàn)[28]中方法并進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。將保藏的凝結(jié)芽孢桿菌經(jīng)液體培養(yǎng)基活化后接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中加入0.05 mol/L的MnSO4·H2O以促進(jìn)芽孢生成。將接菌的平板于40 ℃條件下培養(yǎng)至有90%以上芽孢釋放后收集，一般為4～6 d。用無(wú)菌水將形成的芽孢菌體收集后在80 ℃條件下加熱30 min以殺滅營(yíng)養(yǎng)體，將收集的菌懸液用無(wú)菌水在6 000×g、4 ℃條件下離心4～8 次，每次15 min，以洗去大部分營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞，離心完成后用少量無(wú)菌水重新制成芽孢懸液，使用相差顯微鏡觀察細(xì)菌芽孢、營(yíng)養(yǎng)體及其碎片。調(diào)整芽孢懸液濃度至1010 CFU/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 芽孢營(yíng)養(yǎng)萌發(fā)處理及萌發(fā)率測(cè)定

取制備好的芽孢懸液適當(dāng)稀釋，充分振蕩后等量分裝于離心管中，6 000×g離心3 min，去掉上清液，然后分別加入等體積的50 mmol/L的G、F、K及20 種氨基酸的營(yíng)養(yǎng)液，營(yíng)養(yǎng)液采用無(wú)菌水配制，使用前經(jīng)0.45 μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾，對(duì)照組加入滅菌水，充分振蕩。將新制的芽孢懸液分為2 份，1份在40 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，并在相差顯微鏡下觀察其萌發(fā)情況，每20 min鏡檢1 次，確定其萌發(fā)情況，鏡檢時(shí)每個(gè)條件制取3 個(gè)玻片進(jìn)行觀測(cè)，每個(gè)玻片上取四角及中心5 個(gè)點(diǎn)；另1份同時(shí)采用生長(zhǎng)曲線測(cè)定儀在40 ℃條件下監(jiān)測(cè)其在600 nm波長(zhǎng)處的光密度（optical delnsity，OD）值變化，OD值每5 min測(cè)定1 次，每個(gè)點(diǎn)取5 個(gè)平行，各數(shù)值取平均值，根據(jù)鏡檢結(jié)果計(jì)數(shù)萌發(fā)率并通過(guò)與OD值的降低比率的關(guān)系繪制芽孢萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)曲線。芽孢鏡檢萌發(fā)率計(jì)算見(jiàn)式（1），OD值降低比率計(jì)算見(jiàn)式（2）。

1.3.3 防腐劑對(duì)芽孢抑制作用的處理方法

根據(jù)國(guó)標(biāo)GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[30]中防腐劑的使用限量規(guī)定，實(shí)驗(yàn)采用肉制品中使用的最高添加質(zhì)量濃度，測(cè)定不同防腐劑對(duì)芽孢萌發(fā)情況的影響，將稀釋到適宜濃度的芽孢懸液等體積分裝于不同管中，實(shí)驗(yàn)組分別加入相同量的萌發(fā)劑與1 種防腐劑混合液，對(duì)照組只添加萌發(fā)劑，每管溶劑總添加量相同，通過(guò)在40 ℃條件下培養(yǎng)觀察OD值變化確定其對(duì)芽孢萌發(fā)效果影響。防腐劑配制：稱取相應(yīng)質(zhì)量的7 種防腐劑（精確到0.001），使用無(wú)菌水溶解配制，使用前經(jīng)0.45 μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾。防腐劑使用質(zhì)量濃度見(jiàn)表1。

1.3.4 芽孢生長(zhǎng)曲線的繪制

采用MRS肉湯培養(yǎng)基為基質(zhì)，使用全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀通過(guò)測(cè)定600 nm波長(zhǎng)下OD值的變化，繪制芽孢生長(zhǎng)曲線，研究其生長(zhǎng)規(guī)律。

1.3.5 不同溫度熱脅迫處理芽孢

取適當(dāng)稀釋的芽孢懸液，充分振蕩后等體積分裝于含10 mL液體培養(yǎng)基的試管中，研究已萌發(fā)芽孢耐熱性規(guī)律，分別于90、95、100、105、110、115、120 ℃油浴下加熱0、10、15、20、25、30、35、40 min，之后放入冰水浴迅速冷卻，對(duì)照組在相同加熱條件冷卻后接入相同量芽孢，通過(guò)平板計(jì)數(shù)法測(cè)定芽孢菌落總數(shù)[29]，計(jì)算芽孢熱致死率，并采用全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀測(cè)定其生長(zhǎng)曲線，研究不同溫度及不同熱脅迫時(shí)間對(duì)芽孢致死規(guī)律影響，重復(fù)3 次取平均值。芽孢致死率計(jì)算如式（3）所示。

由表2可知，該凝結(jié)芽孢桿菌芽孢僅有葡萄糖可以促進(jìn)其萌發(fā)。芽孢萌發(fā)過(guò)程需要芽孢內(nèi)膜上的受體蛋白作用，一般稱之為萌發(fā)受體（germinant receptor，GR）。通過(guò)受體蛋白與萌發(fā)劑的特異性結(jié)合從而誘發(fā)芽孢萌發(fā)過(guò)程。有學(xué)者對(duì)枯草芽孢桿菌等菌株的芽孢萌發(fā)特性研究中發(fā)現(xiàn)，L-丙氨酸是促進(jìn)芽孢萌發(fā)的必要營(yíng)養(yǎng)劑，主要由于其內(nèi)膜含有GerA、GerB和GerK三類萌發(fā)受體，其中GerA可以與L-丙氨酸結(jié)合誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)，可見(jiàn)，不同菌種間芽孢萌發(fā)特性不同[31]。

2.2 葡萄糖誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)特性及標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2為芽孢懸液中加入萌發(fā)劑后在40 ℃條件下測(cè)定其萌發(fā)期間OD值變化，未萌發(fā)的芽孢不具透光性，隨著芽孢萌發(fā)為營(yíng)養(yǎng)體其折光性消失從而透光性增強(qiáng)，吸光度也逐漸降低。未加萌發(fā)劑的芽孢懸液其OD值基本保持不變，加入萌發(fā)劑后在20 min開(kāi)始出現(xiàn)OD值降低，結(jié)合鏡檢發(fā)現(xiàn)此時(shí)有少數(shù)芽孢開(kāi)始萌發(fā)，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)180 min時(shí)OD值基本穩(wěn)定不變，說(shuō)明芽孢基本萌發(fā)完全，通過(guò)鏡檢驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)芽孢萌發(fā)率在95%以上，最高達(dá)到98.86%。萌發(fā)率未達(dá)到100%可能是由于極少數(shù)芽孢具有較強(qiáng)抗性，很難萌發(fā)，通常稱其為“超級(jí)芽孢”。超級(jí)芽孢形成的確切原因還未確定，但部分研究表明，可能是由于部分芽孢個(gè)體缺少特定數(shù)量萌發(fā)受體，或受體蛋白表達(dá)過(guò)程中出現(xiàn)個(gè)別變異情況導(dǎo)致萌發(fā)受體種類及數(shù)量缺失，從而使得超級(jí)芽孢萌發(fā)過(guò)程會(huì)長(zhǎng)時(shí)間滯后甚至永久不萌發(fā)[32]。

以50 mmol/L的葡萄糖溶液作為芽孢促萌發(fā)營(yíng)養(yǎng)劑，將稀釋到適宜濃度的芽孢懸液分別在40 ℃條件下培養(yǎng)測(cè)定OD值并鏡檢觀察其萌發(fā)率，以鏡檢萌發(fā)率為橫坐標(biāo)，以O(shè)D值降低率為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.633x-14.454，相關(guān)系數(shù)為0.977 8，說(shuō)明可以使用芽孢液OD值的降低率來(lái)代替鏡檢測(cè)定芽孢萌發(fā)率，從而降低通過(guò)鏡檢計(jì)數(shù)萌發(fā)率的繁瑣度。研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)OD值降低45%時(shí)芽孢萌發(fā)率可達(dá)到95%，當(dāng)OD值降低50%時(shí)可以認(rèn)為芽孢萌發(fā)率接近100%。

由圖3可知，對(duì)照組OD值基本不變，說(shuō)明芽孢沒(méi)有萌發(fā)，而添加葡萄糖后芽孢在180 min左右OD值基本不變說(shuō)明芽孢基本萌發(fā)完全。使用較低濃度葡萄糖時(shí)OD值到終點(diǎn)時(shí)降低率略低于中、高濃度葡萄糖溶液，可能是由于其含量過(guò)低，致使少量芽孢未能萌發(fā)。從萌發(fā)時(shí)間上看，使用高濃度的葡萄糖溶液誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)時(shí)間僅略微提前幾分鐘，說(shuō)明芽孢萌發(fā)過(guò)程需要特定時(shí)間，增加萌發(fā)劑的濃度并不能明顯加速萌發(fā)過(guò)程，可能與芽孢萌發(fā)需要膜中蛋白受體作用，而作用時(shí)間是固定的相關(guān)。

2.3 防腐劑對(duì)芽孢萌發(fā)效果影響

由圖4可知，使用乳酸鈉、葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯和雙乙酸鈉分別單獨(dú)加入到芽孢萌發(fā)體系中時(shí)，初始OD值明顯低于其他組，這是由于這3 種防腐劑的加入致使芽孢出現(xiàn)抱團(tuán)現(xiàn)象，從而不能均勻地分散到液體中導(dǎo)致OD值偏低，在培養(yǎng)過(guò)程中OD值也沒(méi)有明顯降低現(xiàn)象，說(shuō)明芽孢沒(méi)有萌發(fā)，通過(guò)鏡檢驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)芽孢確實(shí)沒(méi)有萌發(fā)；含雙乙酸鈉的萌發(fā)體系中在50 min時(shí)OD值有小幅降低，說(shuō)明部分芽孢萌發(fā)；分別含亞硝酸鈉、山梨酸鉀、乳酸鏈球菌素和脫氫乙酸鈉的萌發(fā)體系中芽孢正常萌發(fā)，加入山梨酸鉀在培養(yǎng)50 min時(shí)可以一定程度上加速芽孢的萌發(fā)，其機(jī)理還有待驗(yàn)證。國(guó)外一些學(xué)者研究中發(fā)現(xiàn)乳酸鏈球菌素[33-35]不能抑制芽孢的萌發(fā)，但可以抑制已萌發(fā)芽孢的生長(zhǎng)，而山梨酸鉀[14]對(duì)芽孢萌發(fā)及生長(zhǎng)均有抑制作用，這與本研究結(jié)果有一定差異，可能是由于不同菌種芽孢差異性所致。

2.4 凝結(jié)芽孢桿菌芽孢生長(zhǎng)規(guī)律

圖5為采用MRS肉湯培養(yǎng)基為基質(zhì)測(cè)定的芽孢生長(zhǎng)曲線圖，在40 ℃培養(yǎng)條件下芽孢在0～5 h內(nèi)為生長(zhǎng)延滯期，5～14 h內(nèi)為生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，OD值從0.245升至0.996，14 h之后進(jìn)入穩(wěn)定期。前期研究[27]表明，篩選出的該凝結(jié)芽孢桿菌營(yíng)養(yǎng)菌體在培養(yǎng)2 h后進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，并持續(xù)到12 h，而本研究中對(duì)其芽孢生長(zhǎng)曲線研究發(fā)現(xiàn)進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的時(shí)間延后約3 h，因?yàn)檠挎咴谝后w培養(yǎng)基中培養(yǎng)期間需要先完成萌發(fā)過(guò)程變?yōu)闋I(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞，然后才開(kāi)始正常的細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程。

2.5 不同熱脅迫溫度對(duì)芽孢致死規(guī)律影響

細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞在70～80 ℃時(shí)10 min就死亡，而芽孢形成后由于有致密的芽孢壁，內(nèi)部含有豐富的2，6-吡啶二羧酸及耐熱小分子酶類，因此具有較高的耐熱性，芽孢萌發(fā)形成營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞時(shí)2，6-吡啶二羧酸釋放到體外，孢子壁也變?yōu)榧?xì)胞壁從而喪失耐熱性。

由圖6可知，采用90 ℃和95 ℃處理的芽孢隨加熱時(shí)間延長(zhǎng)對(duì)芽孢致死效果緩慢提高，加熱到40 min時(shí)致死率分別為47.55%、54.18%，說(shuō)明即便是已經(jīng)萌發(fā)的芽孢液在其成長(zhǎng)為完全的營(yíng)養(yǎng)體前也具有較高耐熱性，在90 ℃和95 ℃熱脅迫下短時(shí)間內(nèi)殺滅效果不理想。當(dāng)熱脅迫溫度為100℃時(shí)，處理時(shí)間低于15 min對(duì)其芽孢致死率也比較低，當(dāng)時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)到25 min時(shí)致死率達(dá)83.48%，繼續(xù)加熱最終芽孢致死率在92.09%。當(dāng)熱脅迫溫度升高到105 ℃的時(shí)候，20 min內(nèi)芽孢致死率迅速上升接近100%，而采用110 ℃處理則在15 min內(nèi)致死率接近100%。115 ℃條件下熱處理10 min對(duì)芽孢致死率高達(dá)89.66%，15 min后接近100%；采用120 ℃高溫脅迫處理時(shí)10 min就幾乎殺滅全部芽孢菌體。

圖7～10為凝結(jié)芽孢桿菌分別在95、100、105、110 ℃條件下熱處理不同時(shí)間后生長(zhǎng)曲線。

正常芽孢培養(yǎng)5 h即進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，當(dāng)熱脅迫溫度為90 ℃時(shí)加熱不同時(shí)間后芽孢生長(zhǎng)曲線幾乎重合且與對(duì)照組并無(wú)明顯差異。采用115 ℃及120 ℃處理的芽孢在45 h內(nèi)除10 min熱處理的芽孢外幾乎不生長(zhǎng)，故圖未列出。95 ℃處理的芽孢即使經(jīng)歷40 min處理其達(dá)到生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的時(shí)間也僅延長(zhǎng)3 h，說(shuō)明活體菌數(shù)依舊很高；采用100 ℃處理的芽孢熱脅迫時(shí)間每延長(zhǎng)5 min其達(dá)到對(duì)數(shù)期的時(shí)間也延長(zhǎng)約3 h，當(dāng)加熱時(shí)間到35 min及40 min時(shí)生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期延長(zhǎng)約15 h，且兩者間差異較小，與致死率結(jié)果一致；當(dāng)熱處理溫度為105 ℃時(shí)加熱10 min后芽孢進(jìn)入對(duì)數(shù)期的時(shí)間明顯推遲5 h，隨著加熱時(shí)間延長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)期的時(shí)間也逐漸推遲；采用110 ℃加熱10 min芽孢進(jìn)入對(duì)數(shù)期的時(shí)間已推遲10 h，加熱40 min的芽孢進(jìn)入對(duì)數(shù)期時(shí)間推遲達(dá)20 h。

綜上可以看出，90～100 ℃的熱脅迫處理對(duì)芽孢致死效果及存活芽孢生長(zhǎng)抑制效果一般，且較長(zhǎng)時(shí)間的加熱若應(yīng)用于產(chǎn)品加工制作不利于產(chǎn)品品質(zhì)及能源節(jié)約，采用105 ℃及110 ℃的中溫刺激條件雖然不能達(dá)到115～120 ℃的高溫滅菌效果，但也可以大幅提高對(duì)芽孢桿菌的滅菌效果。

3 結(jié) 論

凝結(jié)芽孢桿菌的芽孢在培養(yǎng)基中40 ℃培養(yǎng)條件下經(jīng)歷約5 h進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，14 h后進(jìn)入平穩(wěn)期，進(jìn)入對(duì)數(shù)期的時(shí)間較菌體直接培養(yǎng)遲滯3 h，呈典型S形生長(zhǎng)曲線。該菌株對(duì)葡萄糖有良好的萌發(fā)效應(yīng)，在20 min內(nèi)即開(kāi)始萌發(fā)。亞硝酸鈉、山梨酸鉀、乳酸鏈球菌素和脫氫乙酸鈉4 種防腐劑不能阻礙葡萄糖對(duì)芽孢的萌發(fā)促進(jìn)效果，結(jié)合前期研究，使用少量的乳酸鏈球菌素即可對(duì)該凝結(jié)芽孢桿菌抑制率達(dá)99%，綜合研究來(lái)看，說(shuō)明乳酸鏈球菌素對(duì)該菌株的芽孢萌發(fā)沒(méi)有抑制作用，即在有乳酸鏈球菌素的存在下該菌的芽孢可以通過(guò)葡萄糖誘導(dǎo)萌發(fā)成長(zhǎng)為營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，然后乳酸鏈球菌素可以抑制營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞繼續(xù)增殖，從而發(fā)揮其抑菌作用；山梨酸鉀可以一定程度上加快芽孢萌發(fā)過(guò)程，這為中溫肉制品生產(chǎn)中防腐劑復(fù)合使用提供參考。從熱脅迫處理對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌芽孢研究中發(fā)現(xiàn)，對(duì)于剛萌發(fā)的凝結(jié)芽孢桿菌仍有較高耐熱性，可耐受105 ℃短時(shí)高溫，但在110 ℃條件下可以有效殺滅已萌發(fā)芽孢。

從本研究可以發(fā)現(xiàn)，通過(guò)特定營(yíng)養(yǎng)劑誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)，但肉制品中微生物體系較為復(fù)雜，其實(shí)際應(yīng)用效果及其他種類芽孢桿菌芽孢誘導(dǎo)萌發(fā)研究仍需進(jìn)一步探究。

參考文獻(xiàn)：

[1] 余岳， 王春維， 祝愛(ài)俠， 等. 一株凝結(jié)芽孢桿菌芽孢抗逆性研究及其產(chǎn)孢條件優(yōu)化[J]. 飼料工業(yè)， 2013（7）： 43-47. DOI：10.3969/j.issn.1001-991X.2013.07.012.

[2] 艾婷， 張順亮， 王守偉， 等. 中溫殺菌對(duì)乳化腸揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)變化的影響[J]. 肉類研究， 2014， 28（12）： 6-9.

[3] 韓衍青， 徐寶才， 徐幸蓮， 等. 真空包裝熟肉制品中的特定腐敗微生物及其控制[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào)， 2011， 11（7）： 148-156. DOI：10.16429/j.1009-7848.2011.07.028.

[4] DOULGERAKI A I， ERCOLINI D， VILLANI F， et al. Spoilage microbiota associated to the storage of raw meat in different conditions[J]. International Journal of Food Microbiology， 2012， 157（2）： 130-141. DOI：10.1016/j.ijfoodmicro.2012.05.020.

[5] YOST C K， NATTRESS F M. The use of multiplex PCR reactions to characterize populations of lactic acid bacteria associated with meat spoilage[J]. Letters in Applied Microbiology， 2000， 31： 129-133. DOI：10.1046/j.1365-2672.2000.00776.x.

[6] CHENOLL E， MACI?N M C， ELIZAQU?VEL P， et al. Lactic acid bacteria associated with vacuum-packed cooked meatproduct spoilage： population analysis by rDNA-based methods[J]. Journal of Applied Microbiology， 2007， 102： 498-508. DOI：10.1111/j.1365-2672.2006.03081.x.

[7] MATAMOROS S， ANDR? S， HUE I， et al. Identification of lactic acid bacteria involved in the spoilage of pasteurized “foie gras” products[J]. Meat Science， 2010， 85（3）： 467-471. DOI：10.1016/j.meatsci.2010.02.017.

[8] ALFARO B， HERNANDEZ I， le MARC Y， et al. Modelling the effect of the temperature and carbon dioxide on the growth of spoilage bacteria in packed fish products[J]. Food Control， 2013， 29（2）： 429-437. DOI：10.1016/j.foodcont.2012.05.046.

[9] GHOSH S， SETLOW P. The preparation， germination properties and stability of superdormant spores of Bacillus cereus[J]. Journal of Applied Microbiology， 2010， 108（2）： 582-590. DOI：10.1111/j.1365-2672.2009.04442.x.

[10] GEORGET E， KUSHMAN A， CALLANAN M， et al. Geobacillus stearothermophilus， ATCC 7953 spore chemical germination mechanisms in model systems[J]. Food Control， 2014， 50： 141-149. DOI：10.1016/j.foodcont.2014.08.044.

[11] BLACK E P， KOZIOLDUBE K， GUAN D， et al. Factors influencing germination of Bacillus subtilis spores via activation of nutrient receptors by high pressure[J]. Applied and Environmental Microbiology， 2005， 71（10）： 5879-5887. DOI：10.1128/AEM.71.10.5879-5887.2005.

[12] NANGUY S P M， PERRIER-CORNET J M ， BENSOUSSAN M， et al. Impact of water activity of diverse media on spore germination of Aspergillus， and Penicillium species[J]. International Journal of Food Microbiology， 2010， 142（1/2）： 273-276. DOI：10.1016/j.ijfoodmicro.2010.06.031.

[13] AVILA M， G?MEZ-TORRES N， HERN?NDEZ M， et al. Inhibitory activity of reuterin， nisin， lysozyme and nitrite against vegetative cells and spores of dairy-related Clostridium species[J]. International Journal of Food Microbiology， 2014， 172（7）： 70-75. DOI：10.1016/j.ijfoodmicro.2013.12.002.

[14] AOUADHI C， MEJRI S， MAAROUFI A. Inhibitory effects of nisin and potassium sorbate alone or in combination on vegetative cells growth and spore germination of Bacillus sporothermodurans in milk[J]. Food Microbiology， 2015， 46（101）： 40-45. DOI：10.1016/j.fm.2014.07.004.

[15] ARAN N. The effect of calcium and sodium lactates on growth from spores of Bacillus cereus and Clostridium perfringens in a ‘sous-vide beef goulash under temperature abuse[J]. International Journal of Food Microbiology， 2001， 63（1/2）： 117-23. DOI：10.1016/S0168-1605（00）00412-8.

[16] VELUGOTI P R， RAJAGOPAL L， JUNEJA V， et al. Use of calcium， potassium， and sodium lactates to control germination and outgrowth of Clostridium perfringens spores during chilling of injected pork[J]. Food Microbiology， 2007， 24（7/8）： 687-694. DOI： 10.1016/j.fm.2007.04.004.

[17] 王濤. 食品組分與抑菌劑對(duì)嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢耐熱性的影響[D].

無(wú)錫： 江南大學(xué)， 2011.

[18] WESCHE A M， GURTLER J B， MARKS B P， et al. Stress， sublethal injury， resuscitation， and virulence of bacterial foodborne pathogens[J]. Journal of Food Protection， 2009， 72（5）： 1121-1138.

[19] NORIEGA E， VELLIOU E， DERLINDEN E V， et al. Effect of cell immobilization on heat-induced sublethal injury of Escherichia coli， Salmonella， Typhimurium and Listeria innocua[J]. Food Microbiology， 2013， 36（36）： 355-64. DOI：10.1016/j.fm.2013.06.015.

[20] 宣曉婷， 丁甜， 劉東紅. 食品中亞致死損傷單增李斯特菌的研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué)， 2015， 36（3）： 280-284. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201503052.

[21] 林麗花， 柯芙容， 詹湉湉， 等. 凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)黃羽肉雞生產(chǎn)性能、血清生化指標(biāo)及抗氧化功能的影響[J]. 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)， 2014， 26（12）： 3806-3813. DOI：10.3969/j.issn.1006-267x.2014.12.034.

[22] 董惠鈞， 姜俊云， 鄭立軍， 等. 新型微生態(tài)益生菌凝結(jié)芽孢桿菌研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué)， 2010， 31（1）： 292-294.

[23] VERCAMMEN A， VIVIJS B， LURQUIN I， et al. Germination and inactivation of Bacillus coagulans and Alicyclobacillus acidoterrestris spores by high hydrostatic pressure treatment in buffer and tomato sauce[J]. International Journal of Food Microbiology， 2012， 152（3）： 162-167. DOI：10.1016/j.ijfoodmicro.2011.02.019.

[24] DARYAEI H， BALASUBRAMANIAM V M. Kinetics of Bacillus coagulans spore inactivation in tomato juice by combined pressure-heat treatment[J]. Food Control， 2013， 30（1）： 168-175. DOI：10.1016/j.foodcont.2012.06.031.

[25] ZIMMERMANN M， SCHAFFNER D W， ARAG?O G M F. Modeling the inactivation kinetics of Bacillus coagulans spores in tomato pulp from the combined effect of high pressure and moderate temperature[J]. LWT-Food Science and Technology， 2013， 53（1）： 107-112. DOI：10.1016/j.lwt.2013.01.026.

[26] PENG J， MAH J H， SOMAVAT R， et al. Thermal inactivation kinetics of Bacillus coagulans spores in tomato juice[J]. Journal of Food Protection， 2012， 75（7）： 1236-1242. DOI：10.4315/0362-028X.JFP-11-490.

[27] 潘曉倩， 趙燕， 張順亮， 等. 中溫乳化香腸中一株優(yōu)勢(shì)腐敗菌的分離鑒定與生物學(xué)特性[J]. 食品科學(xué)， 2016， 37（7）： 93-98. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201607018.

[28] ICIEK J， PAPIEWSKA A， MOLSKA M. Inactivation of Bacillus stearothermophilus spores during thermal processing[J]. Journal of Food Engineering， 2006， 77（3）： 406-410. DOI：10.1016/j.jfoodeng.2005.07.005

[29] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部. GB/T 4789.2—2010 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定[S]. 北京： 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2010.

[30] 中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì). GB 2760—2011 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)[S]. 北京： 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2014.

[31] KORZA G， SETLOW P. Topology and accessibility of germination proteins in the Bacillus subtilis spore inner membrane[J]. Journal of Bacteriology， 2013， 195（7）： 1484-1491. DOI：10.1128/JB.02262-12.

[32] GHOSH S， SETLOW P. The preparation， germination properties and stability of superdormant spores of Bacillus cereus[J]. Journal of Applied Microbiology， 2010， 108（2）： 582-590. DOI：10.1111/j.1365-2672.2009.04442.x.

[33] MORRIS S L， WALSH R C， HANSEN J N. Identification and characterization of some bacterial membrane sulfhydryl groups which are targets of bacteriostatic and antibiotic action[J]. Journal of Biological Chemistry， 1984， 259（21）： 13590-13594.

[34] GUT I M， BLANKE S R， DONK W A V D. Mechanism of inhibition of Bacillus anthracis spore outgrowth by the lantibiotic nisin[J]. Acs Chemical Biology， 2011， 6（7）： 744-752. DOI：10.1021/cb1004178.

[35] AOUADHI C， ROUISSI Z， MEJRI S， et al. Inactivation of Bacillus sporothermodurans spores by nisin and temperature studied by design of experiments in water and milk[J]. Food Microbiology， 2014， 38（2）： 270-275. DOI：10.1016/j.fm.2013.10.005.