UPLC-Q-TOF/MS在烘焙食品中羧甲基賴氨酸和羧乙基賴氨酸檢測(cè)中的應(yīng)用

林 欽，鄭小嚴(yán)，陳 純，戴 明，周燕瓊，張 英

(1.福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，福建 福州 350002；2.浙江大學(xué) 生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058)

研究報(bào)告

UPLC-Q-TOF/MS在烘焙食品中羧甲基賴氨酸和羧乙基賴氨酸檢測(cè)中的應(yīng)用

林 欽1*，鄭小嚴(yán)1，陳 純2，戴 明1，周燕瓊2，張 英2

(1.福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，福建 福州 350002；2.浙江大學(xué) 生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058)

建立了烘焙食品中羧甲基賴氨酸(CML)和羧乙基賴氨酸(CEL)的UPLC-Q-TOF/MS檢測(cè)方法。烘焙食品經(jīng)脫脂、還原、沉淀蛋白、酸水解釋放出CML和CEL，使用FMOC-Cl柱前衍生和HLB小柱固相萃取凈化后，采用UPLC-Q-TOF/MS檢測(cè)。CML和CEL在1～700 ng/mL濃度范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系，線性回歸系數(shù)r>0.999。CML和CEL的檢出限均為0.1 mg/kg；回收率為94.4%～108.3%；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=6)為0.4%～6.2%。該方法定性、定量準(zhǔn)確，靈敏度高，能很好地應(yīng)用于烘焙食品中CML和CEL的檢測(cè)。

超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀；烘焙食品；羧甲基賴氨酸；羧乙基賴氨酸

羧甲基賴氨酸(CML)和羧乙基賴氨酸(CEL)是食品在加工過(guò)程中發(fā)生美拉德反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)化學(xué)修飾以及生物體內(nèi)的糖氧化、脂質(zhì)氧化和羰基應(yīng)激的一個(gè)重要的生物指標(biāo)。它是晚期糖基化終末產(chǎn)物(Advanced glycosylation end products，AGEs)最主要的單體之一，常作為食品中或生物體內(nèi)AGEs含量的重要生物標(biāo)記物。AGEs與許多疾病的病理機(jī)制有關(guān)，與人類健康有著密切聯(lián)系，它積累于機(jī)體的不同組織器官，如血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、腎皮質(zhì)等組織纖維，不僅可以直接影響細(xì)胞和組織功能，參與疾病的產(chǎn)生，也可通過(guò)與特異受體結(jié)合發(fā)生反應(yīng)來(lái)改變蛋白質(zhì)和細(xì)胞功能，導(dǎo)致機(jī)體的病理變化，如糖尿病及其多種并發(fā)癥[1]。

建立靈敏、有效的AGEs檢測(cè)以及鑒定方法，并研究抑制AGEs的形成是國(guó)內(nèi)外的一個(gè)研究重點(diǎn)。福建省是烘焙食品的生產(chǎn)和消費(fèi)大省，市場(chǎng)正以每年20%以上的增速穩(wěn)步遞增，全省規(guī)模企業(yè)的產(chǎn)值已超過(guò)50億元，并向規(guī)?；⑵放苹姆较虬l(fā)展。由于烘焙食品常具有高糖、高脂特點(diǎn)，又由高溫烘焙制得，因此，最容易產(chǎn)生美拉德反應(yīng)，如何控制好美拉德反應(yīng)和提高加工工藝是企業(yè)長(zhǎng)遠(yuǎn)發(fā)展亟需面對(duì)的問(wèn)題。

目前，已報(bào)道的CML檢測(cè)方法有：(1)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[2-3]。通過(guò)單克隆抗CML抗體來(lái)檢測(cè)CML，但該方法的缺點(diǎn)是缺乏選擇性和非特異性，可能會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性或?qū)е聦?shí)驗(yàn)結(jié)果過(guò)高。(2)液相色譜法。使用高效液相色譜結(jié)合熒光檢測(cè)器對(duì)樣品中的CML進(jìn)行分析時(shí)，需采用衍生劑鄰苯二甲醛對(duì)樣品進(jìn)行柱前衍生[4-5]，但該方法衍生產(chǎn)物不穩(wěn)定；或采用FMOC-Cl對(duì)生物樣品進(jìn)行柱前衍生[6]，CML在激發(fā)波長(zhǎng)260 nm和發(fā)射波長(zhǎng)310 nm處有特征吸收峰，利用熒光檢測(cè)器對(duì)其進(jìn)行定性及定量，但該方法耗時(shí)長(zhǎng)，干擾較大，定量準(zhǔn)確度差。(3)使用氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[7-9]。該方法需采用易揮發(fā)的衍生劑對(duì)樣品進(jìn)行衍生，衍生時(shí)間較長(zhǎng)，并且操作過(guò)程比較復(fù)雜。(4)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)法[10]。該方法的缺點(diǎn)是離子抑制較強(qiáng)，樣品前處理和流動(dòng)相中均使用九氟戊酸離子對(duì)試劑，該試劑易在質(zhì)譜儀中殘留，造成儀器靈敏度下降，并且由于處理后溶液中離子對(duì)試劑含量的不同會(huì)造成CML和CEL色譜峰的保留時(shí)間不穩(wěn)定，不利于定性與定量分析。本研究在已有文獻(xiàn)方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化和改進(jìn)，采用柱前衍生化、固相萃取、UPLC-Q-TOF/MS、同位素稀釋等技術(shù)同時(shí)檢測(cè)烘焙食品中CML和CEL含量，具有高效、準(zhǔn)確、靈敏的特點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

超高效液相色譜儀Waters Acquity UPLC系統(tǒng)配G2-S QTof質(zhì)譜儀(美國(guó)沃特世公司)；20管固相萃取裝置(美國(guó)安捷倫公司)；DHG-9140A恒溫干燥箱(上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司)；Avanti J-E冷凍高速離心機(jī)(美國(guó)貝克曼公司)；Milli-Q超純水純化系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司，Advantage)；BSA224S分析天平(賽多利斯北京有限公司)；渦旋混合器(美國(guó)熱電，VORTEX MAXI MIXⅡ)。

1.2 試劑和材料

實(shí)驗(yàn)用水為超純水；甲醇、乙腈(色譜純，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司)；衍生劑：9-芴基甲基氯甲酸酯(FMOC-Cl，色譜純，純度≥97.0%，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)；標(biāo)準(zhǔn)品：羧甲基賴氨酸(C8H16N2O4，純度98%)、氘代羧甲基賴氨酸(CML-D4，C8H12D4N2O4，純度98%)均為加拿大TRC公司生產(chǎn)；羧乙基賴氨酸(C9H18N2O4，純度98.6%)和氘代羧乙基賴氨酸(CEL-D4，C9H14D4N2O4，純度91.1%)為法國(guó)PolyPeptide Laboratories生產(chǎn)；固相萃取柱：Oasis HLB 60 mg/3 mL(美國(guó)Waters公司)，使用前分別以2 mL甲醇和2 mL 0.5%甲酸溶液活化平衡，保持柱體濕潤(rùn)。各種代表性樣品，包括油炸食品(薯片、薯?xiàng)l、沙琪瑪?shù)?、焙烤食品(曲奇、面包、餅干等)均購(gòu)自當(dāng)?shù)爻小?/p>

標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液配制：分別準(zhǔn)確稱取適量CML和CEL標(biāo)準(zhǔn)品，用70%甲醇(如無(wú)特殊說(shuō)明均為體積分?jǐn)?shù))溶解配成CML和CEL濃度約為200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，置于4 ℃冰箱中保存；分別稱取適量的CML-D4和CEL-D4標(biāo)準(zhǔn)品，用70%甲醇溶液溶解配制成約40 μg/mL的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，置于4 ℃冰箱中保存；移取適量CML和CEL標(biāo)準(zhǔn)溶液，準(zhǔn)確加入同位素內(nèi)標(biāo)溶液，用水稀釋定容至5 mL，混勻；標(biāo)準(zhǔn)系列濃度約為1～700 ng/mL，內(nèi)標(biāo)濃度均為80 ng/mL。

1.3 樣品處理

1.3.1 樣品處理方法 稱取1.0 g(精確至0.1 mg)研磨粉碎后的樣品置于50 mL聚丙烯離心管中，加入10 mL正己烷，充分渦旋，于4 ℃，10 000 r/min離心3 min，棄去正己烷層，重復(fù)上述正己烷脫脂過(guò)程2次，氮吹(40 ℃)揮去正己烷。向脫脂后的樣品中加入10 mL 0.2 mol/L硼砂鹽緩沖液，渦旋混勻，加入1.0 mL 2 mol/L硼氫化鈉溶液，輕輕振搖混勻，4 ℃放置過(guò)夜。還原后的樣品中加入2.5 mL 60%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))三氯乙酸溶液，混勻，4 ℃下以10 000 r/min離心5 min，吸出上清液棄去。將離心管中沉淀的物質(zhì)用20 mL 6 mol/L HCl溶液轉(zhuǎn)移至50 mL水解反應(yīng)釜中，110 ℃下水解22～24 h，取出冷卻至室溫。將水解液用水轉(zhuǎn)移定容至50 mL容量瓶中，混勻，濾紙過(guò)濾，收集濾液。準(zhǔn)確吸取1.00 mL濾液于5 mL刻度試管中，加入2 mL水，再加入100 μL濃度均為4.0 μg/mL 的CML-D4和CEL-D4同位素內(nèi)標(biāo)混合溶液，混勻，用50%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))KOH溶液調(diào)pH值為7.0～9.0，用水定容至5 mL，渦旋混勻備用。

1.3.2 樣品的衍生和凈化 準(zhǔn)確移取上述溶液500 μL，加入500 μL乙腈，渦旋混勻，加入200 μL 5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))硼砂溶液和200 μL 15 g/L FMOC-Cl乙腈溶液，渦旋混勻，靜置10 min，加入10 μL甲酸，混勻，再用40%乙腈溶液稀釋至約3 mL，渦旋混勻；將該衍生后溶液以1～2滴/s的速度過(guò)Oasis HLB 60 mg/3 mL固相萃取柱，待樣液完全流出后，用2 mL 40% 乙腈溶液淋洗，真空抽干，再用2 mL二氯甲烷淋洗，棄去全部流出液，真空抽干，最后用5 mL 5% 氨水甲醇溶液洗脫，真空抽干并收集流出液。將洗脫液于40 ℃氮吹濃縮至近干，用50%乙腈溶液溶解殘留物定容至2 mL，渦旋混勻，過(guò)0.22 μm PTFE濾膜后上機(jī)測(cè)試。

1.4 UPLC-Q-TOF/MS分析條件

1.4.1 色譜分析條件 色譜柱：Waters BEH C18(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流速：0.3 mL/min；流動(dòng)相：A為0.5%甲酸溶液，B為乙腈；洗脫梯度：0～4.5 min，50%～41% A；4.5～5.0 min，41% A；5.0～7.0 min，41%～2% A；7.0～9.0 min，2%～50% A。

表1 主要質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Q-TOF/MS parameters

1.4.2 Q-TOF/MS分析條件 電離源：大氣壓電噴霧離子源正離子模式(ESI+)；毛細(xì)管電壓3.00 kV；源溫度100 ℃；脫溶劑氣溫度400 ℃；脫溶劑氣流量700 L/h；錐孔反吹氣流量50 L/h；檢測(cè)方式：MS Scan靈敏度模式；掃描m/z范圍：500～900 Da；掃描時(shí)間：0.3 s；采集時(shí)間：3～6.5 min；質(zhì)量校準(zhǔn)溶液：1 ng/mL腦啡肽溶液；校準(zhǔn)液m/z：556.277 1；校準(zhǔn)頻率：10 s；定量離子質(zhì)量精度：0.02 Da；特征離子及參數(shù)見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

取濃度約為800 ng/mL的CML，CEL，CML-D4和CEL-D4混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“1.3.2”步驟衍生和凈化處理，由于處理后溶液中仍含有大量衍生副產(chǎn)物，直接注入質(zhì)譜儀掃描時(shí)，目標(biāo)物的峰往往掩蓋在大量的雜質(zhì)峰下，不利于分辨。因此，本研究將標(biāo)準(zhǔn)處理溶液經(jīng)色譜柱分離后，根據(jù)出峰時(shí)間進(jìn)行質(zhì)譜全掃描，得到比較簡(jiǎn)單的質(zhì)譜掃描圖。掃描結(jié)果發(fā)現(xiàn)在ESI(+)模式下，衍生物加H+后得到上述4種化合物的母離子m/z分別為649.255 6，663.269 7，653.280 5，667.294 8，同時(shí)還存在加Na+的離子峰，m/z為671.237 5，685.250 7，675.262 1和689.276 1，其優(yōu)化錐孔電壓等參數(shù)見(jiàn)表1，研究顯示加H+模式具有更好的靈敏度。

已有文獻(xiàn)建立了采用UPLC-MS/MS檢測(cè)CML和CEL的方法[11]，但發(fā)現(xiàn)大量的食品樣品均存在某種氨基酸類物質(zhì)，該物質(zhì)與CML難以達(dá)到基線分離，其衍生產(chǎn)物的質(zhì)荷比(653.198 3)與CML-D4(653.277 0)非常接近，并且具有相同的碎片離子，因此，在只能達(dá)到單位質(zhì)量分辨的情況下，該物質(zhì)的存在會(huì)造成一定的定量偏差。本研究利用Q-TOF/MS高質(zhì)量分辨的特點(diǎn)，在分辨率為0.1 Da時(shí)排除了該雜質(zhì)對(duì)CML-D4的干擾，同時(shí)，即使將分辨率降到0.01 Da，對(duì)峰高也基本無(wú)影響，因此，為保證檢測(cè)的靈敏度并盡可能減少干擾，本方法最終設(shè)定質(zhì)量分辨率為0.02 Da。由于CML-D4和干擾雜質(zhì)碰撞碎裂后得到的靈敏度最大的碎片離子均為衍生劑碎片(m/z179.086 1)(見(jiàn)圖1)，采用Q-TOF/MS的MSMS模式將達(dá)不到分離干擾的目的，因此，本方法采用Q-TOF/MS的MS模式檢測(cè)，經(jīng)優(yōu)化后最終確定的質(zhì)譜儀參數(shù)如“1.4.2”。

圖1 CML和CEL的衍生途徑和碰撞碎裂產(chǎn)物圖Fig.1 Proposed reaction schematic for the derivatization of CML and CEL with FMOC-Cl and their proposed fragmentation pathways

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流圖和提取離子監(jiān)測(cè)圖Fig.2 TIC and quantitative ion chromatograms of standard

2.2 色譜條件的優(yōu)化

本方法采用超高效液相色譜技術(shù)和美國(guó)Waters公司1.7 μm粒徑的C18色譜柱，具有極高的分離效率，考察了純水-乙腈體系、0.1%甲酸-乙腈體系、0.3%甲酸-乙腈體系、0.5%甲酸-乙腈體系作為流動(dòng)相的分離效果，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)0.5%甲酸-乙腈體系時(shí)，待測(cè)物CML與CEL具有最佳的峰形、分離度和靈敏度。調(diào)整洗脫梯度為“1.4.1”條件時(shí)，色譜分離圖見(jiàn)圖2。

2.3 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

FMOC-Cl以其反應(yīng)產(chǎn)物穩(wěn)定、反應(yīng)速度快且完全而成為一種十分理想的對(duì)氨基酸分析的衍生試劑[11]。本研究使用在UPLC-MS/MS檢測(cè)法[12]中研制的FMOC-Cl柱前衍生和固相萃取方法處理樣品。由于CML和CEL在食品中主要以與蛋白質(zhì)中的氨基殘基結(jié)合的方式存在，其蛋白加成產(chǎn)物一旦形成是非常穩(wěn)定且不可逆的[13]。因此，目前文獻(xiàn)基本采用將樣品按脫脂、還原、沉淀蛋白、酸水解蛋白的步驟來(lái)釋放樣品中的CML和CEL[14]。本實(shí)驗(yàn)比較了4種樣品處理方法的CML和CEL檢測(cè)結(jié)果：①將樣品直接酸水解；②將樣品按脫脂、沉淀蛋白、酸水解蛋白的步驟處理；③將樣品按脫脂、還原、沉淀蛋白、酸水解蛋白的步驟處理；④用水直接提取，在與水解法同樣稀釋倍數(shù)下測(cè)定樣品中游離的CML和CEL濃度；同時(shí)將按方法③處理樣品檢測(cè)結(jié)果，以及與UPLC-MS/MS法檢測(cè)結(jié)果相比較，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同處理方法和檢測(cè)方法的結(jié)果比較(n=3)Table 2 The result comparsion of different processing methods and detection methods(n=3) ρ/(μg·L-1)

表2結(jié)果表明，未經(jīng)還原處理的樣品(方法①②)測(cè)得的CML含量明顯高于經(jīng)過(guò)還原處理的樣品(方法③)，說(shuō)明硼氫化鈉(NaBH4)能有效抑制CML的形成，NaBH4將形成CML的主要中間產(chǎn)物Fructoselysine(FL,果糖賴氨酸)還原為己糖醇賴氨酸，終止其在水解過(guò)程中氧化裂解生成CML[15]。因此，在測(cè)定生物樣本或食品體系中CML的含量時(shí)，通常需將樣品經(jīng)過(guò)NaBH4還原處理，防止在高溫水解過(guò)程中賴氨酸與糖類反應(yīng)可能轉(zhuǎn)化為CML，導(dǎo)致樣品中CML的含量測(cè)定值過(guò)高。結(jié)果(方法④)還表明樣品中的游離CML和CEL約占總量的0.6%～13%，CML和CEL在食品中主要以結(jié)合的方式存在。比較UPLC-Q-TOF/MS和UPLC-MS/MS檢測(cè)結(jié)果，CEL的檢測(cè)結(jié)果基本一致，CML的結(jié)果則由于CML-D4與干擾物的分離不完全，造成UPLC-MS/MS檢測(cè)結(jié)果偏低約3%～9%。由此可確定，采用方法③的處理步驟和UPLC-Q-TOF/MS的檢測(cè)方法能夠得到最佳的檢測(cè)結(jié)果。

2.4 線性范圍與檢出限

在1～700 ng/mL濃度范圍內(nèi)，以進(jìn)行衍生反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度(X)為橫坐標(biāo)，以CML和CEL定量離子峰面積除以內(nèi)標(biāo)峰面積的值與內(nèi)標(biāo)濃度的乘積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，線性方程CML為Y=0.625X-0.483，CEL為Y=1.606X-1.486，相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0.999。由最低濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰高與噪音的信噪比按3倍噪音峰高計(jì)算得到CML和CEL的儀器檢出限均為0.1 mg/kg，按10倍噪音峰高計(jì)算CML和CEL的儀器定量下限均為0.3 mg/kg；同時(shí)，用CML濃度為11.0 ng/mL，CEL濃度為8.4 ng/mL的薯片樣品峰高按3倍噪音峰高和10倍噪音峰高計(jì)算CML的方法檢出限和定量下限分別為0.04 mg/kg和0.14 mg/kg，CEL的方法檢出限和定量下限分別為0.05 mg/kg和0.15 mg/kg。用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對(duì)試樣中待測(cè)組分進(jìn)行內(nèi)標(biāo)法定量，試樣溶液的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的線性范圍內(nèi)。本方法具有良好的線性范圍和靈敏度，適合對(duì)烘焙食品中微量CML和CEL的檢測(cè)。

表3 不同烘焙食品中CML和CEL的加標(biāo)回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Spiked recoveries and RSDs of CML and CEL in different baking food samples(n=6)

2.5 回收率與精密度

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)烘焙食品中均含有CML和CEL，因此，取CML和CEL含量較低的薯片、沙琪瑪和蛋糕3種樣品進(jìn)行3個(gè)水平的標(biāo)準(zhǔn)加標(biāo)試驗(yàn)，每個(gè)加標(biāo)做6個(gè)平行，結(jié)果見(jiàn)表3。該方法對(duì)CML的回收率為94.4%～107.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.4%～6.2%；對(duì)CEL的回收率為94.5%～108.3%，RSD為0.9%～6.2%。可見(jiàn)該方法對(duì)CML和CEL均具有良好的回收率和精密度，適合烘焙食品的檢測(cè)。

2.6 實(shí)際樣品的檢測(cè)

采集市場(chǎng)上福建省企業(yè)生產(chǎn)的薯片、餅干和蛋糕等烘焙和油炸類等樣品68個(gè)批次，采用本方法進(jìn)行檢測(cè)，由于CML和CEL的生成與蛋白質(zhì)特別是蛋白質(zhì)中賴氨酸的含量有很大的關(guān)系，因此，本文參照國(guó)外文獻(xiàn)[14]檢測(cè)了食品樣品中的蛋白質(zhì)和賴氨酸含量，并將CML和CEL含量進(jìn)行相應(yīng)折算，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 市售各類加工食品中CML和CEL的實(shí)測(cè)含量(n=3)Table 4 Contents of CML and CEL in various processed foods(n=3)

(續(xù)表4)

SamplenameCMLCELSample(mg/kg)Protein(mg/kg)Lysine(mmol/mol)Sample(mg/kg)Protein(mg/kg)Lysine(mmol/mol)Sesamepeanutpastry11.7070.132.1520.39122.223.51Coffeepastry114.18137.366.869.2289.314.18Coffeepastry220.43229.9516.2612.12136.349.02Sodabiscuit18.6847.911.388.4546.601.26Sodabiscuit28.3652.011.457.3045.411.18Digestivebiscuit18.92154.053.6124.06195.814.30High-fiberbranfriedbiscuit17.22135.193.0121.59169.543.53Coarsegraincookies11.8086.802.4216.96124.713.26High-fiberwholegrainsbiscuits13.95114.432.6221.68177.843.80Nutcracker24.74145.583.0710.9264.291.27Lowsugarseaweedcake6.9439.581.204.6926.720.76Porkflossbread7.7356.420.688.5762.540.71Greenbeancake114.51160.966.7014.12156.686.11Greenbeancake29.5991.022.774.3241.041.17OtherfoodsMeatfloss61.18127.951.1573.03152.741.28Popcorn3.3876.423.677.12160.917.23Littlefragile(puffedfood)1.47104.082.851.87131.893.38Cornbeans(puffedfood)3.9642.711.2110.63114.533.03Steamedcake5.1747.540.602.6724.600.29

從測(cè)定結(jié)果看，油炸類食品薯片、薯?xiàng)l和沙琪瑪?shù)戎械腃ML和CEL含量分別在2.55～6.63 mg/kg和1.92～6.93 mg/kg之間。焙烤類食品包括面包、蛋糕、曲奇、餅干等，CML的含量在6.79～66.14 mg/kg之間，CEL的含量在4.15～39.52 mg/kg之間。同一種食品，可能由于生產(chǎn)工藝控制的不同，造成了產(chǎn)品中CML和CEL含量有很大區(qū)別，如7個(gè)華夫餅中有5個(gè)的CML和CEL含量均在20～25 mg/kg和20～30 mg/kg之間，但有1個(gè)為40.82 mg/kg和37.52 mg/kg，另有1個(gè)為66.14 mg/kg和39.52 mg/kg；3個(gè)歐式蛋糕中，2個(gè)CML和CEL含量均在8 mg/kg和9 mg/kg左右，但有1個(gè)含量為23.16 mg/kg和17.20 mg/kg。此外，采用較低溫度制作的蒸蛋糕中CML和CEL的含量明顯低于高溫烘烤的蛋糕。同時(shí)，分析發(fā)現(xiàn)以蛋白質(zhì)含量折算的烘焙食品中CML含量在39.58～477.53 mg/kg蛋白之間，以賴氨酸含量折算的烘焙食品中CML含量在0.32～16.26 mmol/mol賴氨酸之間；以蛋白質(zhì)含量折算的烘焙食品中CEL含量在24.60～285.38 mg/kg蛋白之間，以賴氨酸含量折算的烘焙食品中CEL含量在0.37～15.37 mmol/mol賴氨酸之間?？梢?jiàn)，食品中CML和CEL含量與蛋白質(zhì)含量或賴氨酸含量不存在簡(jiǎn)單的定量關(guān)系，其含量與食品中糖類、脂肪含量及加工工藝等都有很大關(guān)系，這些還有待今后做更細(xì)致的研究。

3 結(jié) 論

本文建立并優(yōu)化了UPLC-Q-TOF/MS同步檢測(cè)烘焙類等食品中CML和CEL的方法，與UPLC-MS/MS檢測(cè)方法相比，本方法有效解決了相近分子量氨基酸對(duì)檢測(cè)的干擾，具有更優(yōu)的定性、定量能力，在實(shí)際樣品檢測(cè)中取得了良好的效果，有助于指導(dǎo)生產(chǎn)工藝的改進(jìn)。該方法適用性好，準(zhǔn)確度和靈敏度高，能很好地應(yīng)用于食品中CML和CEL的檢測(cè)。

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Application of Ultra Performance Liquid Chromatography-Quadrupole Time-of-flight Mass Spectrometry in Determination of CML and CEL in Baking Foods

LIN Qin1*，ZHENG Xiao-yan1，CHEN Chun2，DAI Ming1，ZHOU Yan-qiong2，ZHANG Ying2

(1.Fujian Inspection and Research Institute for Product Quality，F(xiàn)uzhou 350002，China;2.College of Biosystems Engineering and Food Science，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China)

A method was developed for the determination of Nε-(carboxymethyl)lysine(CML) and Nε-(carboxyethyl)lysine(CEL) in baking food using ultra performance liquid chromatography-quadrupole Time-of-flight mass spectrometry(UPLC-Q-TOF/MS).CML and CEL were released from the baking foods through the process of sample degreasing，reduction reaction，precipitation and acid hydrolysis of acquired protein，treated by pre-column derivation with FMOC-Cl，and purified with HLB solid-phase extraction(SPE) column.Then the contents of CML and CEL in pretreated samples were determined by UPLC-Q-TOF/MS.All the target compounds exhibited good linearity(r>0.999) over the concentration range of 1-700 ng/mL.The detection limits of CML and CEL were all 0.1 mg/kg and the mean recoveries were in the range of 94.4%-108.3% with relative standard deviations(RSD,n=6) of 0.4%-6.2%.The method was accurate and sensitive，and was suitable for the detection of CML and CEL contents in baking foods.

ultra performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry(UPLC-Q-TOF/MS)；baking foods；Nε-(carboxymethyl)lysine(CML)；Nε-(carboxyethyl)lysine(CEL)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.03.001

2016-08-15；

2016-10-26

福建省科技廳民生科技專項(xiàng)(2013Y6003)

O657.7；O657.63

A

1004-4957(2017)03-0297-08

*通訊作者：林 欽，高級(jí)工程師，研究方向：食品安全檢測(cè)，Tel:0591-83762015，E-mail：phlqfcii@126.com